安寐丹調(diào)控OXA/CREB/PER1信號(hào)通路改善SD模型大鼠晝夜節(jié)律紊亂＊

徐 波，謝光璟，夏 婧，王 平

（湖北中醫(yī)藥大學(xué)老年醫(yī)學(xué)研究所 武漢 430065）

睡眠充足是國際社會(huì)公認(rèn)的三項(xiàng)健康標(biāo)準(zhǔn)之一，而隨著社會(huì)生活節(jié)奏的加快，睡眠剝奪（SD）現(xiàn)象持續(xù)增加[1]。晝夜節(jié)律與睡眠息息相關(guān)[2]，調(diào)整SD 造成的晝夜節(jié)律紊亂是治療失眠的常見方法[3]。近年來，中醫(yī)藥防治失眠尤其是中醫(yī)古方作用機(jī)制研究成為廣大科研工作者的研究熱點(diǎn)。中醫(yī)經(jīng)典名方安寐丹源自清·陳士鐸《石室秘錄》，主治虛證失眠，由人參、生熟棗仁、茯神、當(dāng)歸等10 味藥物組成。方以人參滋補(bǔ)氣血為君藥，臣以生熟棗仁養(yǎng)血補(bǔ)肝、寧心安神，再以茯神、當(dāng)歸等補(bǔ)血寧神為佐，共奏補(bǔ)益氣血、養(yǎng)心安神之功。該治法符合近10 年中藥復(fù)方治療失眠的用藥規(guī)律[4]，乃失眠虛證尤其是中老年失眠患者的常用治療方劑，臨床療效顯著、應(yīng)用廣泛[5-9]。

前期已有多數(shù)文章報(bào)道酸棗仁湯[10,11]或酸棗仁-茯苓-黨參等水提物[12,13]防治失眠的作用機(jī)制，但關(guān)于安寐丹的基礎(chǔ)研究較少報(bào)道，筆者前期研究發(fā)現(xiàn)該方能改善不同周期SD 模型大鼠的晝夜節(jié)律紊亂、學(xué)習(xí)記憶障礙，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)OXA、OXB 有關(guān)[14,15]，但安寐丹防治失眠的深入作用機(jī)制暫不明確，進(jìn)一步探索其作用機(jī)制將為安寐丹的臨床運(yùn)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。Orexin 是影響睡眠-覺醒的重要因素，Orexin 拮抗劑Suvorexant是目前常用于失眠治療的藥物之一[16]，其效果已經(jīng)過臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)并通過FDA 的批準(zhǔn)，為此探討安寐丹對(duì)Orexin 的作用可為臨床治療失眠提供新思路，故本實(shí)驗(yàn)擬基于Orexin 信號(hào)通路開展安寐丹改善SD 模型大鼠晝夜節(jié)律紊亂的作用及相關(guān)分子機(jī)制研究具有十分重要的研究價(jià)值和必要性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

由中國食品藥品檢定研究院供應(yīng)的健康清潔級(jí)6月齡SD 雄性大鼠40 只，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0002，動(dòng)物合格證號(hào)：11401500043208。常規(guī)適應(yīng)飼養(yǎng)1 周，使用隨機(jī)數(shù)字將其分為空白組、模型組、艾司唑侖組、安寐丹組，各10 只；實(shí)驗(yàn)全程遵照《關(guān)于善待動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》和相關(guān)生物安全制度及相關(guān)規(guī)章執(zhí)行。

1.2 造模方法與模型評(píng)價(jià)

1.2.1 造模方法

采用弱堿性生理鹽水配置PCPA 混懸液，遵循人和動(dòng)物間體表面積折算的等效劑量比值及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，除空白組，余下三組大鼠均按350 mg/kg/天體質(zhì)量以10 mL·kg-1體積腹腔注射[17]，連續(xù)3 天，腹腔注射的同時(shí)連續(xù)10天疊加國際公認(rèn)的多平臺(tái)水環(huán)境剝奪法，以保證造模更加準(zhǔn)確。

1.2.2 模型評(píng)價(jià)

第3 天腹腔注射PCPA 后，將所有大鼠放入ZZ-6自主活動(dòng)儀（每天光照時(shí)間為8:00-20:00點(diǎn)，黑暗時(shí)間為20:01-7:59），待其適應(yīng)環(huán)境3 min 后，每隔3 h 記錄大鼠2 min 內(nèi)的自主活動(dòng)距離及時(shí)間，即分別記錄21:00、00:00、03:00、06:00、9:00、12:00、15:00、18:00時(shí)的活動(dòng)情況，記錄期間保持正常的攝食攝水。若大鼠第3 d腹腔注射PCPA 后24 小時(shí)活動(dòng)距離和活動(dòng)時(shí)間異常，則表明造模成功[18]。

1.3 干預(yù)方法及療程

腹腔注射第3 d起開始每日8：00時(shí)安寐丹組給予安寐丹水煎劑9.09 mg·kg-1，艾司唑侖組給予艾司唑侖0.09 mg·kg-1灌胃，空白組、模型組給予等容生理鹽水灌胃，1天1次*28天。

1.4 主要藥物與試劑、儀器

1.4.1 主要藥物與試劑

安寐丹：人參11 g，生熟棗仁各19 g，茯神11 g，當(dāng)歸11 g，丹參7 g，麥冬11 g，五味子4 g，石菖蒲4 g，甘草4 g，購自湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬黃家湖醫(yī)院藥劑室，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥學(xué)鑒定專家鑒定，使用煎藥機(jī)煎煮、過濾、濃縮至1:1 比例，冷卻置于4℃冰箱。余下主要藥物試劑如下表1。

表1 主要藥物試劑

1.4.2 主要儀器

主要儀器見下表2.

表2 主要儀器

1.5 療效性指標(biāo)評(píng)價(jià)

1.5.1 ZZ-6自主活動(dòng)儀檢測晝夜節(jié)律

方法同1.2.2模型評(píng)價(jià)。

1.5.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測學(xué)習(xí)記憶

水迷宮分4 個(gè)象限，主要分為定位航行試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)。定位航行實(shí)驗(yàn)分別從4個(gè)象限正中貼壁放入水中，記錄大鼠90 s 內(nèi)上平臺(tái)潛伏期和游泳總路程?？臻g探索實(shí)驗(yàn)為第6天移除平臺(tái)后各組均同一點(diǎn)放入水中，記錄大鼠90 s 跨越原平臺(tái)位置的次數(shù)和持續(xù)時(shí)間。

1.5.3 主要檢測方法

免疫熒光檢測下丘腦Orexin 神經(jīng)元的表達(dá)，ELISA 檢測大鼠下丘腦組織OXA、OXB 含量，WB 和RT-PCR 檢測下丘腦組織OXA/CREB/PER1 信號(hào)通路蛋白和mRNA表達(dá)。

1.6 標(biāo)本采集及檢測方法

1.6.1 標(biāo)本采集

各組大鼠干預(yù)結(jié)束后禁食12 h，麻醉、處死，分組使用灌流法采集下丘腦，生理鹽水沖洗后按組迅速置于液氮中凍存，隨即將標(biāo)本置于-80℃冰箱保存，待用于后續(xù)檢測。

1.6.2 免疫熒光檢測下丘腦Orexin

各組大鼠運(yùn)用水合氯醛麻醉，開胸，灌流，斷頭，開顱，取出下丘腦組織，用多聚甲醛固定后石蠟包埋。下丘腦切片冠狀切片，凍存，脫蠟至水，漂洗，孵育，加相應(yīng)指標(biāo)蛋白的特異性兔抗鼠一抗（1:1000）、羊抗兔二抗（1:200），漂洗并晾干，使用熒光顯微鏡觀察并記錄。

1.6.3 ELISA檢測下丘腦組織OXA、OXB含量

-80℃冰箱取出下丘腦，常溫解凍，組織勻漿機(jī)中勻漿，離心取上清，預(yù)熱酶標(biāo)儀，按照試劑盒使用說明依次配置洗滌液等工作液，隨即在96孔板依次加標(biāo)準(zhǔn)品或樣品、生物素化抗體工作液、酶結(jié)合物工作液、底物溶液、終止液，測量OD 值，并根據(jù)OD 值結(jié)果畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再套用相關(guān)公式計(jì)算OXA、OXB的含量。

1.6.4 WB 法測定下丘腦區(qū)OXA、CREB、PER1 蛋白表達(dá)水平

稱取大鼠下丘腦組織，勻漿器勻漿，離心，加PBS，離心，加RIPA 裂解液，離心，提取大鼠下丘腦組織總蛋白，以PBS 緩沖液稀釋后加入96 孔板中，加入BCA工作液，酶標(biāo)儀測定各孔A562 吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算各組組織總蛋白濃度。玻璃板加入TEMED 后灌膠裝在電泳槽上，放入電泳盒中，上樣，兩側(cè)分別加Prestained protein loading buffer 和Prestained protein MW marker 后電泳。漂洗，切膠，浸泡，轉(zhuǎn)膜，漂染，漂洗，平鋪于凝膠圖像成像分析儀上，等體積混合Western Blot 超敏發(fā)光液，運(yùn)行Bio-Rad 凝膠圖像成像分析系統(tǒng)，曝光獲得各組蛋白條帶，拍照，分析各組條帶灰度值，并作統(tǒng)計(jì)分析。

1.6.5 RT-PCR 法測定下丘腦區(qū)OXA、CREB、PER1 mRNA表達(dá)水平

-80℃冰箱取出大鼠下丘腦組織，加TRIzol，勻漿，離心，加氯仿，離心，吸上清，加異丙醇、75%乙醇、無RNA 酶水，配制反應(yīng)混合液與冰上，均量分裝，加total RNA 樣品，充分混勻，設(shè)置PCR 儀反應(yīng)程序?yàn)?5℃、5 min，4℃、∞；加入5×Prime Script Buffer 2 等，充分混合均勻，設(shè)置PCR 儀反應(yīng)程序?yàn)?2℃、60 min，70℃、5 min，4℃、∞。配置PCR 反應(yīng)液，加入PCR Forward Primer、PCR Reverse Primer、DNA 模板、ddH2O 等。充分混合均勻，離心，采用Actin 為內(nèi)參，設(shè)置Real Time-PCR 儀反應(yīng)條件：96℃、30 min，95℃、5 min，60℃、30 min，95℃、10 min，65℃、5 min，95℃、6 min，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，繪制溶解曲線，采用2-△△ct法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表3。

表3 引物序列表

△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因

△△Ct=△Ct給藥組-△Ct模型組

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用

2 結(jié)果

2.1 24 h內(nèi)不同時(shí)間自主活動(dòng)距離、時(shí)間比較

空白組大鼠24h自主活動(dòng)時(shí)間和距離均呈晝少夜多的節(jié)律。與空白組比較，模型組大鼠24 h 自主活動(dòng)時(shí)間和活動(dòng)距離均高于空白組（P＜0.01），并未呈現(xiàn)出晝夜節(jié)律特征（表4、圖1、圖2）。

圖1 24 h內(nèi)不同時(shí)間自主活動(dòng)距離

圖2 24 h內(nèi)不同時(shí)間自主活動(dòng)時(shí)間

表4 空白組和模型組大鼠24 h內(nèi)不同時(shí)間自主活動(dòng)距離、時(shí)間（ ± s， n=10）

表4 空白組和模型組大鼠24 h內(nèi)不同時(shí)間自主活動(dòng)距離、時(shí)間（ ± s， n=10）

注：與空白組比較，**P＜0.01，*P＜0.05。

組別空白組模型組活動(dòng)距離（cm）928.56±48.71 1105.96±71.31**活動(dòng)時(shí)間（s）100.81±3.25 115.6±2.67**

2.2 安寐丹對(duì)SD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

與空白組比，模型組上平臺(tái)潛伏期與游泳總路程均顯著延長（P＜0.01），穿越站臺(tái)次數(shù)、象限活動(dòng)時(shí)間降低（P＜0.01）；艾司唑侖組和安寐丹組均可減少其上平臺(tái)潛伏期（P＜0.01）和游泳總路程（P＜0.01），增加其穿越站臺(tái)次數(shù)（P＜0.05）和象限活動(dòng)時(shí)間（P＜0.01）。與模型組比較，艾司唑侖組可減少其上平臺(tái)潛伏期（P＜0.05）和游泳總路程（P＜0.01），增加其穿越站臺(tái)次數(shù)（P＜0.05）和象限活動(dòng)時(shí)間（P＜0.01）；安寐丹組可減少其上平臺(tái)潛伏期（P＜0.01）和游泳總路程（P＜0.05），增加其穿越站臺(tái)次數(shù)（P＜0.05）和象限活動(dòng)時(shí)間（P＞0.05）（表5、圖3至6）。

圖3 各組大鼠上平臺(tái)潛伏期時(shí)間

表5 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶的能力（ ± s，n=10）

表5 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶的能力（ ± s，n=10）

注：與空白組比較，**P＜0.01，*P＜0.05；與模型組比較，△△P＜0.01，△P＜0.05。

組別空白組模型組艾司唑侖組安寐丹組定位航行實(shí)驗(yàn)上平臺(tái)潛伏期（s）25.53±8.71 53.64±5.43**46.94±7.28**△40.65±6.34**△△游泳總路程（cm）333.03±44.01 989.41±41.98**643.73±34.16**△△862.74±33.78**△空間探索實(shí)驗(yàn)穿越站臺(tái)次數(shù)3.5±0.82 1.33±0.47**2.67±0.55*△2.33±0.52*△象限活動(dòng)時(shí)間（s）33.92±4.05 14.74±4.24**21.39±5.60**△△15.32±2.76**

2.3 安寐丹對(duì)SD 模型大鼠下丘腦Orexin 含量的影響

2.3.1 ELISA檢測結(jié)果

與空白組比較，SD 大鼠下丘腦組織OXA、OXB 均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，艾司唑侖組可顯著降低OXA和OXB含量（P＜0.01）；安寐丹組可顯著降低OXA 含量（P＜0.01）和OXB 含量（P＜0.05）（表6、圖7、圖8）。

圖8 各組大鼠下丘腦OXB含量的表達(dá)

表6 各組大鼠下丘腦組織OXA、OXB含量表達(dá)（ ± s，n=10）

表6 各組大鼠下丘腦組織OXA、OXB含量表達(dá)（ ± s，n=10）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01，△P＜0.05。

組別空白組模型組艾司唑侖組安寐丹組OXA（pg·μL-1）2855.50±142.96 3790.70±104.91**3380.95±105.63**△△3567.60±128.17**△△OXB（pg·μL-1）3643.55±118.36 3930.45±104.91**3745.70±151.14**△△3926.00±108.12**△

圖7 各組大鼠下丘腦OXA含量的表達(dá)

2.3.2 免疫熒光檢測結(jié)果

如圖所示，SD 大鼠下丘腦區(qū)OX 含量較空白組增多，艾司唑侖組和安寐丹組與模型組相比OX 含量呈不同程度下降（圖9）。

圖4 各組大鼠游泳總路程

圖5 各組大鼠穿越站臺(tái)次數(shù)

圖6 各組大鼠象限活動(dòng)時(shí)間

圖9 各組大鼠模型下丘腦區(qū)OX免疫熒光圖（400×）

2.4 WB檢測結(jié)果

與空白組比較，模型組下丘腦組織OXA、CREB 蛋白表達(dá)均上調(diào)（P＜0.01）、PER1 蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.01），艾司唑侖組下丘腦組織OXA、CREB 蛋白表達(dá)均上調(diào)（P＜0.05）、PER1 蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），安寐丹組下丘腦組織OXA 蛋白相對(duì)表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）、CREB 蛋白相對(duì)表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）、PER1 蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.01）。與模型組比較，艾司唑侖組下丘腦組織OXA蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）、CREB蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.01），PER1 蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.01），安寐丹組下丘腦組織OXA 蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）、CREB 蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.01）、PER1 蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）（表7、圖10-13）。

圖10 各組大鼠OXA、CREB、PER1蛋白WB結(jié)果

表7 各組大鼠下丘腦OXA、CREB、PER1蛋白的表達(dá)（ ± s，n=10）

表7 各組大鼠下丘腦OXA、CREB、PER1蛋白的表達(dá)（ ± s，n=10）

注：與空白組比較，**P＜0.01，*P＜0.05；與模型組比較，△△P＜0.01，△P＜0.05。

組別空白組模型組艾司唑侖組安寐丹組OXA 0.78±0.03 1.01±0.08**0.85±0.07*△0.87±0.04**△CREB 0.10±0.01 0.25±0.03**0.17±0.06*△△0.22±0.05*△△PER1 0.17±0.01 0.06±0.03**0.10±0.04*△△0.09±0.01**△△

圖11 各組大鼠OXA蛋白表達(dá)

圖12 各組大鼠CREB蛋白表達(dá)

2.5 RT-PCR檢測結(jié)果

圖13 各組大鼠PER1蛋白表達(dá)

與空白組比較，模型組OXA、CREB mRNA 表達(dá)均上調(diào)（P＜0.01），PER1 mRNA 表達(dá)均下調(diào)（P＜0.01）；艾司 唑 侖 組OXA mRNA 表 達(dá) 上 調(diào)（P＜0.05）、CREB mRNA 表達(dá)上調(diào)（P＜0.01），PER1 mRNA 表達(dá)下調(diào)（P＜0.01）；安寐丹 組OXA mRNA 表達(dá) 上 調(diào)（P＜0.01）、CREB mRNA 表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），PER1 mRNA 表達(dá)下調(diào)（P＜0.01）。與模型組比較，艾司唑侖組OXA mRNA表達(dá)下調(diào)（P＜0.01）、CREB mRNA 表達(dá)下調(diào)（P＜0.01），PER1 mRNA 表 達(dá) 上 調(diào)（P＜0.05）；安 寐 丹 組OXA mRNA 表達(dá)下調(diào)（P＜0.01），CREB mRNA 表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），PER1 mRNA 表 達(dá) 上 調(diào)（P＜0.05）（表8、圖14-16）。

表8 各組大鼠下丘腦OXA、CREB、PER1 mRNA的表達(dá)（ ± s，n=10）

表8 各組大鼠下丘腦OXA、CREB、PER1 mRNA的表達(dá)（ ± s，n=10）

注：與空白組比較，**P＜0.01，*P＜0.05；與模型組比較，△△P＜0.01，△P＜0.05。

組別空白組模型組艾司唑侖組安寐丹組OXA 0.83±0.12 1.00**0.96±0.13*△△0.98±0.14**△△CREB 0.42±0.13 1.00**0.55±0.13**△△0.47±0.11*△PER1 1.71±0.28 1.00**1.15±0.13*△1.38±0.19**△

圖14 各組大鼠OXA mRNA表達(dá)圖

4 討論

本次實(shí)驗(yàn)采用國際公認(rèn)的PCPA 腹腔注射以及改良多平臺(tái)水環(huán)境法進(jìn)行造模。PCPA 作為國際公認(rèn)的SD模性，具有操作簡單、成模時(shí)間短、可重復(fù)性高等特征，廣泛應(yīng)用于失眠的研究，是失眠機(jī)制研究中應(yīng)用最廣泛的模型[19]，腹腔注射PCPA 可使晝夜節(jié)律紊亂、白晝睡眠行為幾乎消失，以此表明造模成功[20]。本研究運(yùn)用ZZ-6 自主活動(dòng)儀對(duì)比空白組和模型組24h 自主活動(dòng)時(shí)間和距離發(fā)現(xiàn)，空白組大鼠“晝伏夜出”的節(jié)律明顯，具體表現(xiàn)為白天活動(dòng)時(shí)間和距離少，夜間活動(dòng)時(shí)間距離長；而SD 大鼠24h活動(dòng)時(shí)間和活動(dòng)距離喪失“晝伏夜出”的節(jié)律而呈現(xiàn)24 h“持續(xù)躁動(dòng)”的節(jié)律紊亂的現(xiàn)象，說明造模成功。

注：與空白組比較，**P＜0.01，*P＜0.05；與模型組比較，△△P＜0.01，△P＜0.05。

圖15 各組大鼠CREB mRNA表達(dá)圖

SD、晝夜節(jié)律和學(xué)習(xí)記憶三者息息相關(guān)，學(xué)習(xí)記憶包括信息獲取、編碼、短時(shí)儲(chǔ)存、長期鞏固及記憶提取等復(fù)雜的過程，最新研究表明失眠相關(guān)的日間認(rèn)知障礙很可能是由于認(rèn)知控制受損[21]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SD損害學(xué)習(xí)記憶的病理機(jī)制常涉及到突觸可塑性、晝夜節(jié)律、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及能量代謝等方面的改變[22]，分子機(jī)制主要包括損害長時(shí)程增強(qiáng)、改變谷氨酸受體表達(dá)和功能、改變節(jié)律基因表達(dá)和翻譯過程、損害海馬的神經(jīng)發(fā)生、改變OX 系統(tǒng)等[23-24]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PCPA 所致晝夜節(jié)律紊亂的SD 大鼠上平臺(tái)的潛伏期和游泳總路程均高于空白組、穿越站臺(tái)次數(shù)和象限活動(dòng)時(shí)間均低于空白組，說明SD 導(dǎo)致大鼠晝夜節(jié)律紊亂后會(huì)使大鼠學(xué)習(xí)記憶能力降低；而安寐丹可以降低其上平臺(tái)的潛伏期、縮短其游泳總路程，增加其穿越站臺(tái)次數(shù)和象限活動(dòng)時(shí)間，從而改善其認(rèn)知受損，但是否能改善其晝夜節(jié)律紊亂尚不得而知。

晝夜節(jié)律是睡眠產(chǎn)生的重要生理基礎(chǔ)，位于下丘腦的視交叉上核（SCN）可根據(jù)環(huán)境明暗獨(dú)自產(chǎn)生并維持機(jī)體的日周期節(jié)律，是人類晝夜節(jié)律起搏器，是控制晝夜節(jié)律的關(guān)鍵部位，被稱作“大腦中的主控時(shí)鐘”。中醫(yī)稱“腦為元神之腑”“腦主神明”，具有主宰精神、意識(shí)、思維功能，為精神、意識(shí)、思維活動(dòng)的樞紐；而SCN 的重要作用則進(jìn)一步豐富和闡釋了“腦為元神之腑”“腦主神明”的中醫(yī)內(nèi)涵。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SCN 損傷的大鼠24h 晝夜節(jié)律消失、記憶下降，生物鐘基因也發(fā)生相應(yīng)改變[25]。晝夜節(jié)律相關(guān)基因有生物鐘基因Clock、時(shí)鐘管理基因Bmal1、系列周期基因Per1、Per2、Per3 以及晶體蛋白基因Cry 1、Cry2 等；而PER 基因最早被復(fù)制和鑒定且在SCN 中表達(dá)明顯[26]，大鼠的PER mRNA 表達(dá)具有夜晚高早晨低的節(jié)律變化[27]，將PER 基因?qū)隤ER 基因突變的果蠅可恢復(fù)其晝夜節(jié)律[28]；哺乳動(dòng)物PER 基因有PER1、PER2、PER3三個(gè)亞型，PER1、PER2亞型是維持和調(diào)控晝夜節(jié)律的核心基因，且其中樞調(diào)節(jié)點(diǎn)位于SCN 上[29]，而PER1 亞型又可以調(diào)控其他鐘基因如PER2、PER3、CRY1、CRY2 等表達(dá)[30]，晝夜節(jié)律紊亂會(huì)導(dǎo)致PER1 mRNA 表達(dá)下降[31]。研究還發(fā)現(xiàn)，光信號(hào)主要是通過啟動(dòng)CREB 的轉(zhuǎn)錄激活通過視網(wǎng)膜-下丘腦通路傳給SCN，增加PER1表達(dá)，即光誘導(dǎo)CREB/PER1信號(hào)通路[32]。

Orexin是下丘腦分泌的具有促進(jìn)和興奮作用的神經(jīng)元，包括OXA 和OXB，在睡眠狀態(tài)下OX 神經(jīng)元處于相對(duì)靜息狀態(tài)，在清醒狀態(tài)下OX 神經(jīng)元激活并且腦脊液中OX 的含量明顯升高[33]。包含Orexin 受體-1（Orexin Receptor-1, OX1R）和Orexin 受體-2（Orexin Receptor-2, OX2R），且OX1R 與OXA 的親和力高于OXB[34]；當(dāng)Orexin被激活時(shí)，OX1R活化會(huì)導(dǎo)致Gq/磷酸酯酶C（Phospho lipase C，PLC）/蛋白激酶C（Protein kinase C，PKC）途徑激活，進(jìn)而調(diào)節(jié)離子通道活性、細(xì)胞去極化、增加胞漿中鈣離子濃度以增強(qiáng)信號(hào)在突觸間傳導(dǎo)，進(jìn)一步上調(diào)CREB 等激酶，最終調(diào)節(jié)相關(guān)的生理學(xué)功能[35]。由前文可知PER1 在晝夜節(jié)律系統(tǒng)中處于核心地位，而光信號(hào)經(jīng)視網(wǎng)膜細(xì)胞傳遞給SCN 導(dǎo)致mPER1 基因的表達(dá)主要是通過啟動(dòng)子上的CREB 的轉(zhuǎn)錄激活實(shí)現(xiàn)的，即Orexin/CREB/PER1信號(hào)通路。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)SCN調(diào)控著PER1基因[36]，SCN 損毀的大鼠體內(nèi)Orexin 分泌晝夜節(jié)律紊亂[37]，研究亦發(fā)現(xiàn)SCN區(qū)的PER1-增強(qiáng)綠色熒光蛋白（PER1-Enhanced Green Fluorescent Protein，PER1-EGFP）神經(jīng)元被OXA纖維包圍，而Orexin 可抑制PER1-EGFP 的時(shí)鐘細(xì)胞表達(dá)，闡明Orexin 可通過反向調(diào)控SCN 區(qū)節(jié)律基因PER1 來改善睡眠[38]。因“腦為一身之宗，百神之會(huì)”，可以調(diào)節(jié)機(jī)體各類氣血津液，衛(wèi)氣亦不例外，故SCN調(diào)控PER1 基因影響睡眠隸屬于中醫(yī)“腦主神明”的范疇。

Orexin 雖在下丘腦產(chǎn)生，但廣泛分布于外周系統(tǒng)并參與眾多生理活動(dòng)，中藥可以通過調(diào)節(jié)Orexin 神經(jīng)元或其受體改善模型動(dòng)物的相關(guān)病理現(xiàn)象，如研究發(fā)現(xiàn)疏肝和胃湯可能通過調(diào)節(jié)Orexin 及其受體改善抑郁模型大鼠胃排空延遲[26]；寧心方加減可調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)OXA 的表達(dá)而改善睡眠質(zhì)量[39]；天王補(bǔ)心丹可調(diào)節(jié)OXA信號(hào)保護(hù)慢性SD小鼠糖脂代謝異常[40]；鎮(zhèn)驚溫膽湯可以調(diào)控大鼠Orexin 系統(tǒng)及其受體緩解不寐、善驚等病理狀態(tài)[41]。本實(shí)驗(yàn)免疫熒光和Elisa 結(jié)果均表明SD 模型大鼠下丘腦區(qū)Orexin、OXA、OXB 含量均增多，而艾司唑侖組和安寐丹組可降低其含量；WB 結(jié)果進(jìn)一步表明模型組大鼠下丘腦組織OXA、CREB 蛋白表達(dá)均上調(diào)、PER1 蛋白表達(dá)下調(diào)，而艾司唑侖組和安寐丹組大鼠下丘腦組織的OXA、CREB 蛋白表達(dá)均下調(diào)，PER1 蛋白表達(dá)上調(diào)；RT-PCR 再次佐證SD 大鼠下丘腦區(qū)的OXA mRNA、CREB mRNA 表達(dá)上調(diào)、PER1 mRNA 表達(dá)下調(diào)，而艾司唑侖、安寐丹可降低SD 大鼠下丘腦區(qū)的OXA mRNA、CREB mRNA 表達(dá)，上調(diào)其PER1 mRNA表達(dá)，從而改善SD模型晝夜節(jié)律紊亂，說明艾司唑侖、安寐丹可能是通過調(diào)節(jié)Orexin 及其介導(dǎo)的OXA/CREB/PER1 信號(hào)通路而發(fā)揮作用。且單從行為學(xué)和RT-PCR 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)上看，艾司唑侖組增多SD大鼠穿越站臺(tái)次數(shù)和象限活動(dòng)時(shí)間，降低下丘腦組織OXA、OXB含量，下調(diào)下丘腦組織OXA mRNA 表達(dá)，上調(diào)PER1 mRNA 表達(dá)均優(yōu)于安寐丹；而安寐丹在降低SD 上平臺(tái)潛伏期、下調(diào)下丘腦組織CREB mRNA 表達(dá)優(yōu)于艾司唑侖，說明二者在改善SD 導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶障礙和節(jié)律紊亂各有優(yōu)勢。該研究結(jié)果較充分闡明了安寐丹基于“腦主神明”的理論指導(dǎo)防治失眠的物質(zhì)基礎(chǔ)與Orexin息息相關(guān)。

綜上所述，安寐丹能夠改善SD 模型大鼠的晝夜節(jié)律紊亂及學(xué)習(xí)記憶，其作用途徑可能與調(diào)節(jié)Orexin及其介導(dǎo)的OXA/CREB/PER1 信號(hào)通路相關(guān)，但其深入機(jī)制尚需展開進(jìn)一步研究。