擴(kuò)心方通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad2通路改善擴(kuò)張型心肌病大鼠心肌纖維化＊

吳 瓊，董藝丹，王佑華，彭瓏萍，王延文，魏易洪，王 懌，周 嫦，馬夢(mèng)嬌，周茂琳，周 端

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院 上海 200032）

擴(kuò)張型心肌?。―ilated Cardiomyopathy，DCM）猝死率高、預(yù)后差，屬原發(fā)性混合型心肌病的一種，其發(fā)病原因不明，病理機(jī)制復(fù)雜，常因心室重塑引起心臟擴(kuò)大及心肌收縮功能進(jìn)行性降低，從而引起難治性心力衰竭，惡性心律失常，血栓栓塞、心源性休克甚至猝死等[1]。心肌纖維化的發(fā)生不僅是DCM心肌重塑的重要病理過程，同時(shí)也是諸多心血管疾病發(fā)病的共同病理改變。這種改變通常包括細(xì)胞外基質(zhì)過量沉積、纖維蛋白增生、各型膠原比例失調(diào)，從而導(dǎo)致心臟僵硬度增加，心臟舒張功能減退，當(dāng)剩余心肌細(xì)胞收縮功能代償不足時(shí)導(dǎo)致收縮功能下降[2-3]。TGF-β1/Smads信號(hào)通路廣泛參與心肌纖維化，而TGF-β1 作為一種重要的促心肌纖維化細(xì)胞因子，在病理性心肌纖維化中其表達(dá)量明顯增加，隨后刺激心臟成纖維細(xì)胞增生、膠原合成，激活TGF-β1/Smads 通路從而導(dǎo)致心肌重塑[4-5]。因此調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads 信號(hào)通路對(duì)延緩DCM心肌纖維化有重要意義。

結(jié)合長(zhǎng)期臨床實(shí)踐對(duì)于擴(kuò)張型心肌病發(fā)病演變規(guī)律的認(rèn)識(shí)，上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院終身教授周端認(rèn)為擴(kuò)張型心肌病基本病機(jī)為“正虛（氣陰虛損）邪阻（瘀痰水阻留）”，治以益氣養(yǎng)陰、活血化痰利水，并設(shè)擴(kuò)心方治療。以擴(kuò)心方為主方的中藥方劑已經(jīng)作為我院院內(nèi)用于防治擴(kuò)張型心肌病的協(xié)定方，廣泛運(yùn)用于臨床患者，且收到良好效果[6]，但對(duì)于其治療的作用機(jī)制還有待探討。心肌纖維化是引起DCM 諸多臨床并發(fā)癥的根本原因，從中醫(yī)臨床有效方藥中尋找防治擴(kuò)張型心肌病心肌纖維化的藥物是學(xué)者們關(guān)注的問題。故本研究將以緩解心肌纖維化為切入點(diǎn)，探究擴(kuò)心方治療擴(kuò)張型心肌病的可能的作用機(jī)制，以期為臨床運(yùn)用擴(kuò)心方提供充實(shí)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

雄性、SPF 級(jí)Wistar 大鼠共68 只，體質(zhì)量170-220 g，購自上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK（滬）2014-0008。

1.1.2 藥品

擴(kuò)心方：生黃芪30 g，黃精30 g，靈芝9 g，丹參15 g，水蛭6 g，瓜蔞皮30 g，桂枝3 g，黃荊子9 g，毛冬青30 g，貓人參30 g。參照課題組前期工作，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中藥制劑室按照操作流程以水煎煮、真空濃縮、噴霧干燥、干式制粒備用[7]。西藥：卡托普利（陽性對(duì)照藥，中美上海施貴寶制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字：H31022986)。阿霉素（Dox）（造模用藥，10mg/瓶，4℃保存，深圳萬樂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)）。

1.1.3 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉，4%多聚甲醛溶液購自國藥集團(tuán)、Collagen I 抗體（ARG21965，Arigo）、Collagen III 抗體（ARG20786，Arigo）、TGF-β 抗體（ARG10002，arigo）、Smad2 抗體（ab40855，Abcam）羊抗兔II 抗（CST 公司，貨號(hào)7074S）、Fresco 17 低溫高速臺(tái)式離心機(jī)（美國）、4RM2016 病理切片機(jī)（德國）、PE Victor 酶標(biāo)儀（美國）、Olympus光學(xué)顯微鏡（日本）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠模型制備與分組

SPF 級(jí)Wistar 大鼠共68 只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。本實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組，即正常組（Con 組）8 只，考慮造模死亡率以及需要取心臟用于多個(gè)指標(biāo)檢測(cè)，余60只設(shè)為模型組。按照文獻(xiàn)[8]和課題組前期研究方法復(fù)制DCM 模型[7]，用0.9%氯化鈉溶液將Dox 溶解配成濃度為1mg/mL 的溶液，腹腔注射Dox2.5mg/kg，正常組8 只大鼠腹腔注射相同劑量的氯化鈉溶液，每周1 次，共6次，阿霉素的總共劑量達(dá)到15mg/kg，2 周后從正常組隨機(jī)挑選3 只、模型組隨機(jī)挑選10 只進(jìn)行心臟超聲，檢測(cè)左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左室舒張期末徑（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）、左室收縮期末徑（left ventricular end systolic diameter，LVESD）、左 室 短 軸 縮 短 率（fraction shortening，LVFS），造模組與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即造模成功。造模成功后60只大鼠隨機(jī)分為模型組（Dox 組），擴(kuò)心方低（KXF-L）、擴(kuò)心方中（KXF-M 組）、擴(kuò)心方高（KXF-H 組）劑量組、卡擴(kuò)普利組（Cap組）每組12只，設(shè)6只為1籠。

1.2.2 給藥

結(jié)合文獻(xiàn)及前期工作，造模成功后即開始給實(shí)驗(yàn)大鼠灌胃進(jìn)行干預(yù)。根據(jù)體表面積換算法得出大鼠灌胃劑量：①擴(kuò)心方低劑量為3.6 g/(kg·天)，擴(kuò)心方中劑量為3.6 g/(kg·天)，擴(kuò)心方高劑量為7.2 g/(kg·天)；②卡托普利組給藥量為5mg/(kg·天)；③正常組和模型組給予與KXF-M 組等劑量的0.9%氯化鈉溶液，每天灌胃給藥1次，共干預(yù)4周。

1.2.3 心超檢測(cè)

于藥物干預(yù)后第4周末，用濃度為3%戊巴比妥鈉1.17 mL·kg-1腹腔麻醉所有大鼠，待其角膜反射消失后，用剃毛刀將大鼠胸部、腹部毛發(fā)剔除，并擦拭干凈。使大鼠呈仰臥位，將超聲探頭放置于大鼠左胸前，由二維超聲引導(dǎo)M 型曲線。每個(gè)大鼠連續(xù)測(cè)量3個(gè)心動(dòng)周期的數(shù)值，將超聲心動(dòng)圖保存起來作為為原始數(shù)據(jù)，觀察并記錄LVEDD、LVESD、LVEF、LVFS、室間隔厚度（interventricular septal thickness，IVS)，左室后 壁 厚 度（left ventricular posterior wall thickness，LVPWT)。

1.2.4 Masson染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)改變

心超檢測(cè)后，開胸取出大鼠心臟，用冰浴生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分，取左室前壁心肌部分組織浸泡于甲醛溶液中，制成石蠟切片，切片脫蠟至水。用Masson 染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)改變。每個(gè)標(biāo)本選取5 個(gè)視野，使用Image-Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)分析心肌膠原容積分?jǐn)?shù)（collagen volume fraction，CVF）。

1.2.4 免疫組化觀察ColI、ColIII

石蠟切片脫蠟至水，抗原修復(fù)及封閉后，滴加ColI、ColIII 的I 抗50μl，37℃60 min（濃度為1:200），然后滴加生物素化II 抗，37℃30 min。經(jīng)顯色，復(fù)染，脫水、透明后封片，用OlyVIA 軟件分析圖像。每張切片選取不同5 個(gè)視野，觀察染色情況，之后運(yùn)用ImagePro Plus 6.0軟件計(jì)算各片陽性表達(dá)占總面積的百分比，并進(jìn)行組間比較。

1.2.5 蛋白芯片檢測(cè)TGF-β1通路相關(guān)蛋白表達(dá)

取適量-80°保存大鼠心尖部組織，采用Full Moon公司芯片（CSP100 plus），實(shí)驗(yàn)步驟按照Full Moon公司的標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行，檢測(cè)由上海華盈生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.2.6 Western blot法檢測(cè)TGF-β1、Smad2蛋白表達(dá)

取適量-80°保存的大鼠心尖部組織，標(biāo)本預(yù)處理后予以勻漿、裂解，離心，計(jì)算樣品總蛋白濃度。配置10%分離膠，5%濃縮膠，然后電泳，結(jié)束后將目的蛋白轉(zhuǎn)移至膜，于5%BSA 室溫封閉2 h，洗模后加入封閉液稀釋的TGF-β 抗體（1:1 000）和Smad2 抗體（1:1 000），孵育過夜，洗膜后再加入稀釋的二抗（1:2000），室溫孵育后洗膜，上機(jī)顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 心超

用阿霉素腹腔注射造模后第9 周行心超檢測(cè)示：與Con 組相比，Dox 組LVEDD、LVESD 明顯增加（P＜0.01），EF、FS 明顯降低（P＜0.01），提示造模成功。而經(jīng)藥物干預(yù)后，與Dox 組比較，擴(kuò)心方中、高劑量組和陽性藥對(duì)照Cap 組大鼠LVEDD、LVESD 均有明顯降低（P＜0.01），擴(kuò)心方低劑量組LVEDD 有所降低（P＜0.05），LVESD 無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。EF、FS方面，擴(kuò)心方所有劑量組及卡托普利組大鼠EF、FS 均有明顯改善（P＜0.01），其中擴(kuò)心方低、中、高劑量組呈現(xiàn)出一定的劑量－效應(yīng)關(guān)系，尤以高劑量組為優(yōu)。IVS、LVPWT 方面，與模型組相比，中藥與西藥干預(yù)皆未有明顯改善作用，但在數(shù)值上，中藥干預(yù)組可見隨藥物濃度增加，數(shù)值改善越明顯（圖1）。

圖1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠心超指標(biāo)比較

2.2 Masson染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)改變

與Con 組相比，Dox 組大鼠心肌間質(zhì)可見大量藍(lán)色纖維化組織，心肌細(xì)胞排列奈亂，CVF 顯著升高（P＜0.01）；與Dox 組相比，KXF-H 組可見少量膠原纖維，CVF 顯著降低（P＜0.01），KXF-M 組心肌間質(zhì)可見部分纖維組織，CVF 較模型組明顯減少（P＜0.01）；KXF-L組間質(zhì)可見稍多心肌纖維組織，CVF 較模型組仍有明顯減少（P＜0.01）；卡托普利組接近正常組，肌纖維間隙較正常組稍寬，CVF 較模型組明顯減少（P＜0.01）。從CVF 數(shù)值可見擴(kuò)心方治療隨濃度增加，呈現(xiàn)出一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系（圖2、表1）。

圖2 心肌Masson染色（×200倍）

表1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠CVF結(jié)果比較（ ± s，%）

表1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠CVF結(jié)果比較（ ± s，%）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別Con組（n=8）Dox組（n=6）KXF-L組（n=7）KXF-M組（n=6）KXF-H組（n=8）Cap組（n=7）CVF(%)3.44±0.40 12.83±1.39**8.21±0.67△△7.97±0.41△△7.20±0.48△△6.53±0.16△△

2.3 免疫組化法觀察ColI、ColIII

與Con 組相比，Dox 組ColI、ColIIII 表達(dá)明顯增多，并大片分布于細(xì)胞外基質(zhì)（P＜0.01）。經(jīng)藥物干預(yù)后，擴(kuò)心方所有劑量組ColIIII 表達(dá)均明顯減少，間質(zhì)纖維組織增生，膠原增生較模型組明顯改善（P＜0.01），擴(kuò)心方中、高劑量組及卡托普利組ColI 表達(dá)明顯減少（P＜0.01）、低劑量組有改善（P＜0.05），從數(shù)值可見擴(kuò)心方治療隨濃度增加，呈現(xiàn)出一定的劑量－效應(yīng)關(guān)系（圖3、圖4、表2）。

表2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠Col、ColIII含量結(jié)果比較（ ± s，%）

表2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠Col、ColIII含量結(jié)果比較（ ± s，%）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別Con組（n=8）Dox組（n=6）KXF-L組（n=7）KXF-M組（n=6）KXF-H組（n=8）Cap組（n=7）ColI 3.8±0.21 18.03±1.67**13.81±0.51△△12.29±1.45△△8.17±0.86△△9.53±0.16△△ColIII 6.71±0.43 26.89±2.77**23.32±1.68△20.33±1.53△△14.31±1.34△△17.29±2.76△△

圖3 心肌組織ColI免疫組化（×200倍）

圖4 心肌組織ColIII免疫組化（×200倍）

2.4 CSP100 plus蛋白芯片

蛋白芯片TGF-β1 通路中共檢測(cè)了9 種蛋白，包括：p44/42絲裂原活化蛋白激酶、致癌轉(zhuǎn)錄因子c-Myc（Myc）、蛋白磷酸酶2A-α（PP2A-α）、p70 核糖體蛋白S6 激 酶（P70S6K）、Smad1、Smad2、Smad3、TGFBR1、TGFBR2，后2 者為TGF-β1 的受體。在外界刺激下，TGF-β1被激活后與TGFBR2結(jié)合形成復(fù)合物，隨后該復(fù)合物再與TGFBR1 結(jié)合，激活其下游的Smads 蛋白，發(fā)揮生物學(xué)作用[9-10]。

蛋白芯片顯示經(jīng)Dox 造模后，與Con 組相比，TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)通路中有3 種蛋白表達(dá)上調(diào)，分別為PP2A-alpha（上調(diào)1.42 倍）、Smad2（1.5 倍）、TGFBR2（1.44倍）。而經(jīng)擴(kuò)心方藥物干預(yù)后，與Dox組相比，治療組中此3 種蛋白中有2 種蛋白含量有相應(yīng)下降，分別為Smad2（下調(diào)0.81 倍）、TGFBR2 表達(dá)下降（0.77倍），且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表3、圖5）。

圖5 3組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物CSP100 plus蛋白芯片中Smad2、TGF-β1圖像

表3 3組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物CSP100 plus蛋白芯片中Smad2、TGFBR2表達(dá)水平（ ±s)

表3 3組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物CSP100 plus蛋白芯片中Smad2、TGFBR2表達(dá)水平（ ±s)

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別Con組Dox組KXF-H組Smad2 1565.2±65.65 1907.6±57.24**1768.17±136.60 TGFBR2 2382.75±124.84 3942.50±644.53**3183.80±168.48△△

2.5 Western blot結(jié)果

與Con 組相比，Dox 組TGF-β1 以及Smad2 蛋白表達(dá)均明顯升高（P＜0.01）。與Dox 組相比，擴(kuò)心方所有劑量組TGF-β1 表達(dá)明顯減少（P＜0.01），且改善程度呈現(xiàn)出一定的劑量－效應(yīng)關(guān)系。而擴(kuò)心方低、中高劑量組與Dox 組相比，Smad2 蛋白未有明顯降低，高劑量中藥組及卡托普利組中的Smad2 蛋白則明顯降低（P＜0.01）（圖6）。

圖6 各組TGF-β1、Smad2蛋白表達(dá)比較

3 討論

當(dāng)心臟承受的壓力或容量負(fù)荷過重時(shí)，為了應(yīng)對(duì)這一變化，心肌在形態(tài)、大小以及功能上發(fā)生結(jié)構(gòu)適應(yīng)性反應(yīng)，稱之為心肌重塑[11，12]。心肌纖維化是引起心肌重塑的重要病理過程，當(dāng)心臟受到病理因素刺激時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原過度沉積會(huì)導(dǎo)致間質(zhì)增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肌纖維排列紊亂、斷裂，從而導(dǎo)致心肌纖維化。細(xì)胞外基質(zhì)成分的改變通常包含成纖維細(xì)胞合成和膠原蛋白合成增加，而當(dāng)膠原蛋白含量增多時(shí)，伴隨而來的是膠原纖維網(wǎng)的過度形成，此時(shí)心肌細(xì)胞會(huì)被這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)所包圍，致使心肌細(xì)胞舒縮功能障礙，從而影響心功能。而隨著心肌重塑的發(fā)生發(fā)展，心腔進(jìn)行性增大，最終極有可能發(fā)展成擴(kuò)張型心肌病[13-14]。近年來，西醫(yī)在治療擴(kuò)張型心肌病、慢性心衰方面有顯著進(jìn)步的同時(shí)，仍有一些矛盾點(diǎn)有待解決，比如不少DCM 患者由于血壓低并不能耐受抗心衰、逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)治療（如利尿劑，血管緊張素受體拮抗劑，β 受體阻滯劑等）；糾正心衰使用利尿劑時(shí)患者出現(xiàn)口干，出虛汗，燥熱，但又需要控制入量等，而中醫(yī)治療擴(kuò)心病有諸多優(yōu)勢(shì)，如緩解胸悶心慌、氣喘等臨床癥狀；增加西藥療效，降低其副作用；改善患者心功能及提高生存率等[6,15-16]。因此探討擴(kuò)張型心肌病中醫(yī)藥防治作用機(jī)制，有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。

中醫(yī)學(xué)中沒有關(guān)于“擴(kuò)張型心肌病”的直接記載，大多數(shù)醫(yī)家將其歸為“心脹”“心痹”“心水”等范疇。擴(kuò)心方為我院用于治療擴(kuò)張型心肌病的協(xié)定方之一，課題組前期臨床研究提示擴(kuò)心方可顯著改善擴(kuò)心病患者心功能及臨床癥狀，提高患者生活質(zhì)量，機(jī)制可能與改善心肌重塑，減少心肌纖維化相關(guān)，但目前尚缺乏進(jìn)一步證據(jù)[6]。我院終身教授周端認(rèn)為擴(kuò)張型心肌病基本病機(jī)為“正虛（氣陰虛損）邪阻（瘀痰水阻留）”，治以益氣養(yǎng)陰、活血化痰利水。在DCM 發(fā)生發(fā)展過程中，心肌細(xì)胞凋亡，炎癥因子釋放、氧化應(yīng)激損傷等皆會(huì)造成成纖維細(xì)胞增生和膠原蛋白沉積，從而導(dǎo)致心肌纖維化，屬陰的物質(zhì)不斷的丟失，進(jìn)而出現(xiàn)氣陰兩虛之證。擴(kuò)心方作為益氣養(yǎng)陰之方劑，已在臨床運(yùn)用多年，由生黃芪、黃精、丹參、瓜蔞皮、桂枝、黃荊子等組成。其中黃芪、黃精為君藥，具有補(bǔ)氣、滋陰填精作用；丹參、瓜蔞皮為臣藥，具有活血化瘀、理氣寬胸之功；同時(shí)取桂枝溫陽利水之效，黃荊子平喘滌痰之功，以為佐藥。諸多現(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)提示擴(kuò)心方中多味藥物皆可抑制心肌纖維化。黃芪作為君藥之一，多項(xiàng)臨床研究證實(shí)其能有效提高DCM 患者EF值、縮小LVEDD、延長(zhǎng)步行距離、保護(hù)心功能[17]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)黃芪能有效改善Dox誘導(dǎo)的心衰大鼠心肌纖維化，同時(shí)可降低炎癥因子釋放[18]。擴(kuò)心方中的另一君藥黃精則可降低異丙腎上腺素腹腔注射所致模型小鼠心肌細(xì)胞間黏附分子-1、血管細(xì)胞粘附因子-1蛋白表達(dá)，從而延緩心肌纖維化[19]。丹參的主要成分丹酚酸A 可以改善高血壓心肌肥厚模型大鼠心肌纖維化，其可能的機(jī)制為抑制血管緊張素受體和阻斷TGF-β1/Smads 信號(hào)通路[20]。另外擴(kuò)心方中多味藥物如瓜蔞皮、靈芝、毛冬青等兼具有心臟保護(hù)作用[21，22]。

當(dāng)心臟受到病理因素刺激時(shí)會(huì)生成大量的I 型與III 型膠原蛋白，形成細(xì)胞外基質(zhì)和纖維沉積，細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原過度沉積會(huì)導(dǎo)致間質(zhì)增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肌纖維排列紊亂、斷裂，導(dǎo)致間質(zhì)纖維化，從而引起心臟舒縮功能障礙[23,24]。本研究通過Masson 染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)改變發(fā)現(xiàn)與Con 組相比，Dox 組大鼠心肌間質(zhì)可見大量藍(lán)色纖維化組織，心肌細(xì)胞排列奈亂，尤其是血管周圍明顯。而經(jīng)過藥物擴(kuò)心方干預(yù)后，中藥各劑量干預(yù)組大鼠心肌纖維組織明顯減少，排列紊亂改善，其中擴(kuò)心方治療組中，隨藥物濃度增加，呈現(xiàn)出一定的劑量－效應(yīng)關(guān)系。而免疫組化觀結(jié)果顯示發(fā)現(xiàn)與Con組相比，Dox組ColI、ColIII表達(dá)明顯增多，并大片分布于細(xì)胞外基質(zhì)，且形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂，而經(jīng)擴(kuò)心方治療后，ColI、ColIII 表達(dá)明顯減少，排列也較為整齊。另外我們通過心超評(píng)估大鼠心肌舒縮功能發(fā)現(xiàn)與Con 相比，Dox 組LVEDD、LVESD 明顯增加，IVS 減小，EF、FS 明顯降低，DCM 大鼠發(fā)生了心臟結(jié)構(gòu)改變以及心功能障礙。而經(jīng)中藥治療后，擴(kuò)心方中、高劑量組大鼠LVEDD、LVESD 均有明顯降低，EF、FS均有明顯提高，且與西藥卡托普利組效果相當(dāng)。擴(kuò)心方低劑量組LVEDD 有所降低，LVESD 方面無差異，EF、FS有明顯改善，數(shù)值上隨擴(kuò)心方藥物濃度的增加，LVEDD、LVESD、EF、FS 改善程度更佳，說明擴(kuò)心方對(duì)DCM心室重構(gòu)的改善呈現(xiàn)出一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

越來越多的研究表明，TGF-β1 介導(dǎo)的信號(hào)通路與心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展有著緊密關(guān)聯(lián)。TGF-β1 是一種重要的促纖因子，其可刺激心臟成纖維細(xì)胞增生、造成膠原I與膠原III的廣泛合成，細(xì)胞外基質(zhì)和纖維過度沉積，從而導(dǎo)致心肌纖維化。在外界刺激下，TGF-β1 被激活并釋放，隨之與細(xì)胞表面活性II 型受體（TβRII）結(jié)合，再與I 型受體（TβRI）結(jié)合，形成復(fù)合物，該復(fù)合物作用于R-Smads蛋白C端絲氨酸殘基，導(dǎo)致Smad2、Smad3 增加且磷酸化，使TGF-β1/Smad 信號(hào)傳導(dǎo)通路被激活，進(jìn)而促進(jìn)膠原纖維的合成和分泌，導(dǎo)致心肌纖維化[9，10]。中醫(yī)藥治療疾病具有多靴點(diǎn)、多途經(jīng)、多環(huán)節(jié)改善癥狀的特點(diǎn)，為了進(jìn)一步研究擴(kuò)心方改善心肌纖維化的上游機(jī)制，我們進(jìn)行了蛋白芯片檢測(cè)。蛋白芯片技術(shù)能從生理、病理、藥理等微觀機(jī)制方面為闡釋中醫(yī)藥理論提供可能。本研究通過蛋白芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)擴(kuò)心方在TGF-β1信號(hào)通路上有多種蛋白表達(dá)增加。與Con 組相比，模型組大鼠中PP2Aalpha（上調(diào)1.42 倍）、Smad2（1.5 倍）、TGFBR2（1.44倍）。而經(jīng)擴(kuò)心方藥物干預(yù)后，與Dox 組相比，治療組中此3 種蛋白中有2 種蛋白含量有相應(yīng)下降，分別為Smad2（下調(diào)0.81 倍）、TGFBR2 表達(dá)下降（0.77 倍），且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），蛋白芯片研究提示擴(kuò)心方改善Dox 大鼠心肌纖維化可能與TGF-β1/Smad2 信號(hào)通路相關(guān)。為了進(jìn)一步證實(shí)，我們進(jìn)行了Western blot實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示經(jīng)過中藥擴(kuò)心方干預(yù)后，所有中藥劑量組大鼠心肌TGF-β1 表達(dá)均有明顯下降，且呈現(xiàn)出一定的劑量－效應(yīng)關(guān)系，擴(kuò)心方高劑量組改善最為明顯。而Smad2 蛋白表達(dá)上，擴(kuò)心方高劑量組有明顯下降（P＜0.01），因此擴(kuò)心方能有效降低Dox 誘導(dǎo)的DCM大鼠心肌TGF-β1以及Smad2的表達(dá)。

綜上，本研究以我院中醫(yī)臨床長(zhǎng)期用于擴(kuò)張型心肌病的有效方藥擴(kuò)心方為研究對(duì)象，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)擴(kuò)心方可改善擴(kuò)張型心肌病大鼠心肌纖維化，其機(jī)制可能與抑制TGF-β1/Smad2 信號(hào)通路密切相關(guān)。目前擴(kuò)張型心肌病臨床缺少針對(duì)性治療方法，國內(nèi)外對(duì)于擴(kuò)張型心肌病心肌纖維化研究還在不斷進(jìn)展之中。盡管TGF-β1/Smad2 信號(hào)通路是常見的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，但在擴(kuò)張型心肌病心肌纖維化發(fā)病機(jī)制及中醫(yī)藥防治作用的研究較為少見。本研究將為中醫(yī)藥防治擴(kuò)張型心肌病心肌纖維化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，進(jìn)一步的深入研究正在進(jìn)行之中。