益心舒對(duì)缺血型心肌病大鼠心室重構(gòu)和三磷酸腺苷含量的影響及機(jī)制

齊貴彬，高建步，張永杰，王星，張明磊，王新敏，李京倡，解莉莉

（南陽(yáng)市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，河南南陽(yáng)473009）

心室重構(gòu)和心肌組織能量代謝異常在缺血型心肌病的發(fā)生與發(fā)展中具有重要作用[1]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，缺血型心肌病大鼠模型存在心室重構(gòu)、心肌組織中三磷酸腺苷（ATP）含量明顯降低現(xiàn)象，改善能量代謝類(lèi)藥物能夠改善心功能和缺血型心肌病癥狀[2]。益心舒膠囊是由丹參、人參、五味子、黃芪等組成的復(fù)方制劑，具有溫陽(yáng)、活血、化瘀等作用，有助于改善缺血型心肌病的臨床癥狀[3]。本研究通過(guò)建立缺血型心肌病大鼠模型，觀察益心舒對(duì)缺血型心肌病大鼠心室重構(gòu)和ATP含量的影響，并探討相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD 大鼠60 只，體質(zhì)量190～210 g，購(gòu)于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019?0010。

1.2 主要藥品、試劑

益心舒膠囊購(gòu)于貴州信邦制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z52020038，規(guī)格每粒0.4 g，批號(hào)B14000033276；卡維地洛片購(gòu)于北京巨能制藥有限責(zé)任公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H19991108，規(guī)格每片20 mg，線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒JC?1 購(gòu)于廈門(mén)生光生物科技有限公司，批號(hào)CA1310?100；SDS?PAGE 凝膠制備試劑盒購(gòu)于上海尚寶生物有限公司，批號(hào)10312；鼠抗人β?抑制蛋白單克隆抗體，（批號(hào)DK1052）、鼠抗人磷酸化p38MAPK 蛋白單克隆抗體，（批號(hào)DK8524）、鼠抗人解偶聯(lián)蛋白2 單克隆抗體單克隆抗體，（批號(hào)DK5271）、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（批號(hào)HDK0221），均購(gòu)于武漢科茵生物科技有限公司。

1.3 主要儀器

Voluson S6彩色超聲診斷儀購(gòu)于美國(guó)GE 公司；CMY?10 型手持式組織勻漿機(jī)購(gòu)于上海測(cè)博生物科技有限公司；Eppendorf5418R 高速離心機(jī)購(gòu)于德國(guó)艾本德股份公司；PT?350C 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)于北京普天新橋技術(shù)有限公司。

1.4 方法

1.4.1 缺血型心肌病大鼠模型制備[4]隨機(jī)選取12只大鼠為正常對(duì)照組，另外的大鼠采用左側(cè)冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎術(shù)制備缺血型心肌病模型。具體方法如下：術(shù)前禁食8 h，按300 mg/kg的劑量腹腔注射10%（φ）水合氯醛麻醉，在胸骨左側(cè)第4和第5肋間隙處開(kāi)胸，將心臟擠出，在肺動(dòng)脈圓錐和左心耳交界處距離根部1 mm的位置結(jié)扎，將心臟迅速放回胸腔，排出胸腔中氣體后縫合。將存活的大鼠常規(guī)飼養(yǎng)4周，自由進(jìn)食、飲水，4周后進(jìn)行彩色超聲診斷儀檢查，左室射血分?jǐn)?shù)低于50%為缺血型心肌病造模成功。

1.4.2 分組與給藥取36只造模成功的大鼠，隨機(jī)分為模型組、益心舒組、卡維地洛組，每組12只。正常對(duì)照組12只大鼠在冠脈前降支距離根部1 mm 的位置僅穿線不結(jié)扎，其余操作與另外3組相同。根據(jù)人體給藥劑量折合后益心舒組大鼠給藥劑量為20 mg/kg，使用0.9%氯化鈉溶液配制成質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL的益心舒藥液；卡維地洛組大鼠給藥劑量為10 mg/kg，使用0.9%（ρ）氯化鈉溶液配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的卡維地洛藥液；正常對(duì)照組和模型組給予相同體積的蒸餾水。每日灌胃1 次，4 周1 個(gè)療程。

1.4.3 左心室結(jié)構(gòu)和心室重構(gòu)指標(biāo)檢測(cè)使用彩色超聲診斷儀進(jìn)行檢測(cè)，左心室結(jié)構(gòu)改變情況觀察指標(biāo)包括：左心室后壁厚度、室間隔厚度、左心室舒張末期內(nèi)徑、左心室收縮末期內(nèi)徑，均連續(xù)檢測(cè)3個(gè)心動(dòng)周期，取平均值。心室重構(gòu)指標(biāo)包括：左心室質(zhì)量指數(shù)=左心室濕質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量，右心室質(zhì)量指數(shù)=右心室濕質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量。

1.3.4 心肌ATP 含量測(cè)定取各組大鼠心肌組織適量，使用組織勻漿機(jī)處理后，4 ℃12 000 r/min離心10 min，收集上清液，加入96孔板中，70 μL/孔，按試劑盒說(shuō)明書(shū)加入相應(yīng)試劑，上酶標(biāo)儀檢測(cè)，使用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定每個(gè)標(biāo)本的總蛋白濃度，心肌ATP含量最終以ng/mg prot表示。

1.4.5 心肌線粒體膜電位檢測(cè)[5]取各組大鼠心肌組織約40 mg，手術(shù)剪碎后加入牛胰蛋白酶，進(jìn)行組織勻漿，采用差速離心法獲得線粒體。熒光探針JC?1 檢測(cè)線粒體跨膜電勢(shì)差，操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，結(jié)果用線粒體膜電位發(fā)射率（ER）值表示，計(jì)算公式：EK=590 nm熒光強(qiáng)度/527 nm熒光強(qiáng)度。

1.4.6 Western blot 檢測(cè)取各組大鼠心肌組織適量勻漿，4 ℃12 000 r/min離心10 min，取上清液，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度。以100 μg 蛋白上樣量進(jìn)行10% SDS?PAGE 凝膠電泳后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，室溫下封閉1 h，洗滌后滴加1∶500 倍稀釋的鼠抗人β?抑制蛋白單克隆抗體，1∶1 000倍稀釋的鼠抗人磷酸化p38MAPK 蛋白、鼠抗人解偶聯(lián)蛋白2 單克隆抗體，以及1∶2 000 倍稀釋的鼠抗人GAPDH 單克隆抗體，4 ℃過(guò)夜，次日加入1∶2 000 倍稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，37 ℃反應(yīng)2 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色后分析β?抑制蛋白、磷酸化p38MAPK蛋白、鼠抗人解偶聯(lián)蛋白2的表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，采用方差分析和t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠左心室結(jié)構(gòu)的變化情況

模型組大鼠左心室后壁厚度、室間隔厚度、左心室舒張末期內(nèi)徑明顯低于正常對(duì)照組，左心室收縮末期內(nèi)徑明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；益心舒組和卡維地洛組大鼠左心室后壁厚度、室間隔厚度、左心室舒張末期內(nèi)徑明顯高于模型組，左心室收縮末期內(nèi)徑明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；左心室后壁厚度、室間隔厚度、左心室舒張末期內(nèi)徑、左心室收縮末期內(nèi)徑在益心舒組與卡維地洛組大鼠之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組左心室結(jié)構(gòu)相關(guān)指標(biāo)比較Table 1 Comparison of relevant indexes of left ventricular structure in each group(±s,n=12)

表1 各組左心室結(jié)構(gòu)相關(guān)指標(biāo)比較Table 1 Comparison of relevant indexes of left ventricular structure in each group(±s,n=12)

與正常對(duì)照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05。

組別正常對(duì)照組模型組益心舒組卡維地洛組劑量/（mg·kg-1）--2 0 10左心室后壁厚度/mm 2.64±0.31 1.52±0.15**1.89±0.20#1.93±0.25#室間隔厚度/mm 2.81±0.29 1.58±0.17**2.06±0.24#2.12±0.27#左心室舒張末期內(nèi)徑/%6.83±0.59 4.46±0.43**5.27±0.51#5.09±0.46#左心室收縮末期內(nèi)徑/%1.18±0.11 2.36±0.24*1.71±0.18#1.79±0.21#

2.2 各組大鼠心室重構(gòu)指標(biāo)變化情況

模型組大鼠左心室質(zhì)量指數(shù)、右心室質(zhì)量指數(shù)明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01），益心舒組和卡維地洛組大鼠左心室質(zhì)量指數(shù)、右心室質(zhì)量指數(shù)明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）；左心室質(zhì)量指數(shù)、右心室質(zhì)量指數(shù)在益心舒組與卡維地洛組大鼠之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠心室重構(gòu)指標(biāo)變化情況分析Table 2 Analysis of changes in ventricular remodeling indexes of rats in each group(±s,n=12) w/(mg·g-1)

表2 各組大鼠心室重構(gòu)指標(biāo)變化情況分析Table 2 Analysis of changes in ventricular remodeling indexes of rats in each group(±s,n=12) w/(mg·g-1)

與正常對(duì)照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01。

組別正常對(duì)照組模型組益心舒組卡維地洛組劑量/（mg·kg-1）--2 0 10左心室質(zhì)量指數(shù)1.62±0.15 3.05±0.24**1.98±0.19##1.91±0.17##右心室質(zhì)量指數(shù)0.50±0.06 0.96±0.11*0.71±0.09#0.68±0.07#

2.3 各組大鼠ATP含量和線粒體膜電位水平比較

模型組大鼠ATP 含量、線粒體膜電位ER 值明顯低于正常對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01）；益心舒組和卡維地洛組大鼠ATP 含量、線粒體膜電位ER 值明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）；ATP 含量、線粒體膜電位ER 值在益心舒組與卡維地洛組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠ATP含量和線粒體膜電位水平比較Table 3 Comparison of ATP content and mitochondrial membrane potential of rats in each group(±s,n=12)

表3 各組大鼠ATP含量和線粒體膜電位水平比較Table 3 Comparison of ATP content and mitochondrial membrane potential of rats in each group(±s,n=12)

與正常對(duì)照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01。

組別正常對(duì)照組模型組益心舒組卡維地洛組劑量/（mg·kg-1）--2 0 10 ATP含量/（ng·mg-1）10.35±0.47 1.92±0.09**9.86±0.44##10.09±0.41##線粒體膜電位ER值/%4.61±0.34 2.25±0.11*4.53±0.28#4.49±0.25#

2.4 各組大鼠相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

模型組大鼠β?抑制蛋白表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照組，磷酸化p38MAPK蛋白、解偶聯(lián)蛋白2表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；益心舒組和卡維地洛組大鼠β?抑制蛋白表達(dá)水平明顯高于模型組，磷酸化p38MAPK 蛋白、解偶聯(lián)蛋白2 表達(dá)水平明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。見(jiàn)表4，圖1。

表4 各組大鼠相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較Table 4 Comparison of expression levels of related proteins in rats of each group (±s,n=12)

表4 各組大鼠相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較Table 4 Comparison of expression levels of related proteins in rats of each group (±s,n=12)

與正常對(duì)照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01。

組別正常對(duì)照組模型組益心舒組卡維地洛組劑量/（mg·kg-1）--2 0 10 β?抑制蛋白0.95±0.08 0.52±0.14**0.74±0.16#0.77±0.14#磷酸化p38MAPK蛋白0.21±0.05 0.92±0.11**0.47±0.15##0.41±0.13##解偶聯(lián)蛋白2 0.16±0.03 0.84±0.08**0.29±0.14##0.23±0.11##

圖1 各組大鼠相關(guān)蛋白表達(dá)的Western blot電泳圖Figure 1 Western blot electrophoresis of rat related protein expression in each group

3 討論

缺血型心肌病是常見(jiàn)的心血管系統(tǒng)疾病，主要由于心肌損傷，心臟長(zhǎng)期處于高負(fù)荷導(dǎo)致心室供血不足，引發(fā)的一系列失代償反應(yīng)[6]。在中醫(yī)理論中將其歸屬為“胸痹”“怔忡”等范疇，治療原則以溫陽(yáng)、活血、化瘀、通脈等為主[7]。益心舒膠囊組分包括丹參、人參、五味子、黃芪等，具有溫陽(yáng)、活血、化瘀等作用。已有的藥理學(xué)研究顯示，益心舒膠囊能夠改善心肌對(duì)缺氧的耐受能力，擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈并增加血流量[8]。β-抑制蛋白家族作為一種信號(hào)蛋白參與人體的多種生理過(guò)程，包括反式激活、泛素化、去磷酸化等效應(yīng)[9]。由于β?抑制蛋白具有多個(gè)作用靶點(diǎn)，已成為目前研究熱點(diǎn)之一。磷酸化p38MAPK蛋白在人體細(xì)胞中廣泛分布，在缺氧、輻射、炎癥等多種因素的作用下被激活，是β?抑制蛋白下游的重要靶點(diǎn)[10]。相關(guān)研究顯示，p38MAPK蛋白被激活與心力衰竭密切相關(guān)，可能與誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡和心室重構(gòu)有關(guān)[11]。

本研究結(jié)果顯示，益心舒組和卡維地洛組大鼠左心室后壁厚度、室間隔厚度、左心室舒張末期內(nèi)徑明顯升高，左心室收縮末期內(nèi)徑、左心室質(zhì)量指數(shù)、右心室質(zhì)量指數(shù)明顯降低，且在上述兩組間無(wú)明顯差異，提示益心舒膠囊和卡維地洛能夠明顯抑制缺血型心肌病大鼠的心室重構(gòu)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，益心舒組和卡維地洛組大鼠β?抑制蛋白高表達(dá)，磷酸化p38MAPK 蛋白低表達(dá)，可推測(cè)益心舒膠囊抑制缺血型心肌病大鼠心室重構(gòu)的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞中β?抑制蛋白、磷酸化p38MAPK 蛋白表達(dá)有關(guān)。

心肌能量供應(yīng)不足導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)和功能受損參與缺血型心肌病的發(fā)生與發(fā)展，是心室重構(gòu)進(jìn)展的主要因素[12]。線粒體是細(xì)胞能量代謝的主要場(chǎng)所，解偶聯(lián)蛋白2是線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)體，通過(guò)改變線粒體的膜電位水平來(lái)調(diào)節(jié)心肌能量代謝[13]。相關(guān)研究顯示，在缺血型心肌病早期，解偶聯(lián)蛋白2 能夠抑制超氧陰離子分泌和細(xì)胞凋亡，穩(wěn)定細(xì)胞鈣離子水平[14]；隨著缺血型心肌病的進(jìn)展，解偶聯(lián)蛋白2表達(dá)不斷上調(diào)，解偶聯(lián)作用增強(qiáng)，對(duì)心肌代謝產(chǎn)生不良影響，造成心肌細(xì)胞興奮和收縮偶聯(lián)異常，心功能下降[15]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠ATP 含量、線粒體膜電位ER 值明顯降低；益心舒組和卡維地洛組大鼠ATP 含量、線粒體膜電位ER 值明顯升高，且在上述兩組間無(wú)明顯差異，提示缺血型心肌病存在明顯的能量代謝障礙，益心舒膠囊能夠明顯改善缺血型心肌病大鼠的能量代謝，效果與卡維地洛相當(dāng)。進(jìn)一步分析顯示，益心舒組和卡維地洛組大鼠解偶聯(lián)蛋白2 低表達(dá)，提示益心舒膠囊可通過(guò)抑制缺血型心肌病大鼠偶聯(lián)蛋白2 的過(guò)表達(dá)，穩(wěn)定線粒體膜電位，保證氧化磷酸化進(jìn)行，提高心肌ATP 含量，增強(qiáng)心肌收縮力，改善心功能。本研究為益心舒膠囊的臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。