當(dāng)歸六黃湯UPLC指紋圖譜的建立及4種成分的含量測定

曾杉，史紫娟，陳偉彥，高永堅，梁鳳友

（國藥集團廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東佛山528305）

當(dāng)歸六黃湯源自金代李東垣編纂的《蘭室秘藏》，被后世廣泛認(rèn)作“治盜汗”的良藥，由當(dāng)歸、生地黃、熟地黃、黃芩、黃連、黃柏、黃芪七味藥組成[1?3]。眾醫(yī)家根據(jù)中醫(yī)理論對當(dāng)歸六黃湯進行組方配伍解析：當(dāng)歸味甘、辛，性溫，具有養(yǎng)血作用，生地味甘苦涼，熟地味甘微溫，具有滋陰作用，三藥合用，共奏滋陰制火之功，共為君藥；黃芩、黃連和黃柏味苦性寒，分別具瀉上、中、下焦火的作用，三藥合用，清熱瀉火作用更強，共為臣藥；黃芪為佐藥，味甘性溫，可發(fā)揮益氣固表的作用。全方七味藥合用，主治陰虛火旺所致的盜汗[4?6]。

當(dāng)歸六黃湯作為《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》中收錄的方劑之一，臨床應(yīng)用經(jīng)驗豐富。然而該方藥味數(shù)量多、化學(xué)成分種類復(fù)雜且含量差異較大，目前針對當(dāng)歸六黃湯物質(zhì)基礎(chǔ)和指紋圖譜研究的文獻甚少[7?8]。指紋圖譜結(jié)合多指標(biāo)成分含量測定是中藥復(fù)方制劑一種常用的質(zhì)控手段，兩者結(jié)合能夠反映經(jīng)典名方的整體基礎(chǔ)物質(zhì)情況。本研究利用構(gòu)建的當(dāng)歸六黃湯UPLC 指紋圖譜方法，同時測定了處方中黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、阿魏酸4 種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以期為經(jīng)典名方當(dāng)歸六黃湯物質(zhì)基準(zhǔn)及制劑的開發(fā)生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

H?class 型高效液相色譜儀（Waters UPLC）；MS105 型電子天平（梅特勒?托利多公司；2002E 型電子天平（梅特勒?托利多公司）；KQ?500DE 型數(shù)控超聲清洗儀（昆山超聲儀器有限公司）；MILLI?PORE Synergy 超純水儀（美國默克公司）；HN101?3A型電熱鼓風(fēng)干燥烘箱（南通滬南科學(xué)儀器有限公司）；Synergy UV型超純水儀（美國默克公司）。

1.2 試藥

黃芩苷（批號：110715?201720）、鹽酸小檗堿（批號：10713?201813）、鹽酸黃柏堿（批號：111895?201504）、阿魏酸（批號：110773?201614）、漢黃芩苷（批號：1112002?201702）對照品由中國食品藥品檢定研究院提供；木蘭花堿（批號：180226?004）、千層紙素A 苷（批號：18040202）、表小檗堿（批號：19012103）對照品由中山市成諾生物科技有限公司提供；甲醇、乙腈為HPLC級。

1.3 樣品

當(dāng)歸、地黃、熟地黃、黃芩、黃柏、黃連、黃芪均購自主產(chǎn)區(qū)或道地產(chǎn)區(qū)，由廣東一方制藥有限公司鑒定分別為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根、玄參科植物地黃Rehmannia glutino?sa Libosch.的新鮮或干燥塊根、唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi 的干燥根、蕓香科植物黃皮Phellodendron chinense Schneid.的干燥樹皮、毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch.的干燥根莖、豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus Bge.var.mongholicus Hsiao的干燥根。

當(dāng)歸六黃湯共15 個批次，編號為S1-S15，方中7味藥的產(chǎn)地信息見表1。

表1 15批樣品產(chǎn)地信息Table 1 Origin information of 15 batches of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 當(dāng)歸六黃湯樣品的制備

當(dāng)歸六黃湯在《蘭室秘藏》原文中制法記載為“當(dāng)歸、生地黃、熟地黃、黃芩、黃連、黃柏各等分，黃芪加一倍，共為粗末，每服五錢，水二盞煎至一盞?！辈殚單墨I資料，確定金元時期一錢為現(xiàn)今3.73 g，一盞為現(xiàn)今150 mL。依照古方，即稱取當(dāng)歸、生地黃、熟地黃、黃芩、黃連、黃柏飲片各2.33 g，黃芪飲片4.66 g，置于1 L電陶瓷煎藥壺中，加水300 mL，煎煮至150 mL，煎液分裝后進行低溫冷凍干燥，得復(fù)方凍干粉。

2.2 指紋圖譜的建立

2.2.1 色譜條件色譜柱：Waters CORTECST3（150mm×2.1 mm，1.6 μm）；流動相：0.1%磷酸溶液（A）?乙腈（B），梯度洗脫（0～15 min，5%→20%B；15～30 min，20%→25%B；30～45 min，25%→95%B）；柱溫為25 ℃；流速為0.25 mL/min；進樣量為1 μL；檢測波長為285 nm。

2.2.2 對照品溶液的制備取黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、阿魏酸、木蘭花堿、千層紙素A 苷、表小檗堿、漢黃芩苷對照品適量，精密稱定，分別加70%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇制成每1 mL 各含黃芩苷189.5 μg、鹽酸小檗堿186.2 μg、鹽酸黃柏堿49.7 μg、阿魏酸25.1 μg、木蘭花堿87.5 μg、千層紙素A 苷86.3 μg、表小檗堿85.4 μg、漢黃芩苷83.2 μg 的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備取當(dāng)歸六黃湯凍干粉約0.1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理20 min，放冷，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 精密度試驗取同一份當(dāng)歸六黃湯供試品溶液（S5），按“2.2.1”項色譜條件進樣6次，導(dǎo)出色譜圖并計算相似度均大于0.95，表明儀器精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗取同一份當(dāng)歸六黃湯供試品溶液（S5），按“2.2.1”項色譜條件分別在0、2、4、8、12、16、20、24 h 進樣測定，導(dǎo)出色譜圖并計算相似度均大于0.95，結(jié)果表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗取同一批當(dāng)歸六黃湯樣品（S5），平行制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項色譜條件進樣測定，導(dǎo)出6 份色譜圖并計算相似度均大于0.95，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.7 指紋圖譜的建立及共有峰的標(biāo)定制備15批當(dāng)歸六黃湯供試品溶液，按指紋圖譜方法進行檢測，將色譜結(jié)果導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012 版”進行分析，標(biāo)定20 個特征峰并生成對照指紋圖譜，見圖1-2。與對照品進行對照，確證了8 個色譜峰，分別為3 號峰鹽酸黃柏堿，5 號峰綠原酸，6號峰木蘭花堿，8號峰阿魏酸，11號峰表小檗堿，12號峰黃芩苷，14號峰鹽酸小檗堿，17號峰千層紙素A苷，18號峰漢黃芩苷。對15批次當(dāng)歸六黃湯指紋圖譜與對照圖譜之間進行相似度比較，見表2?？梢?，15 批當(dāng)歸六黃湯樣品相似度結(jié)果均大于0.90，表明不同產(chǎn)地各藥味成分穩(wěn)定，無較大差異。

圖1 15批當(dāng)歸六黃湯UPLC指紋圖譜疊加圖Figure 1 UPLC fingerprints of 15 batches of Danggui Liuhuang decoction

圖2 當(dāng)歸六黃湯UPLC對照指紋圖譜Figure 2 HPLC reference fingerprint of Danggui Liuhuang decoction

表2 15批當(dāng)歸六黃湯樣品相似度評價結(jié)果Table 2 Fingerprint similarities of 15 batches of Danggui Liuhuang decoction

2.3 當(dāng)歸六黃湯中4種成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

2.3.1 色譜條件同“2.2.1”項色譜條件。

2.3.2 對照品溶液的制備取黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、阿魏酸對照品適量，精密稱定，分別加70%甲醇制成每1 mL 各含黃芩苷189.5 μg、鹽酸小檗堿186.2 μg、鹽酸黃柏堿49.7 μg、阿魏酸25.1 μg的對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備取當(dāng)歸六黃湯凍干粉碾細，精密稱定0.1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3.4 專屬性試驗取當(dāng)歸六黃湯供試品溶液（S5）、對照品溶液、空白溶劑按“2.2.1”項下方法進樣測定，結(jié)果表明黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、阿魏酸4個成分的色譜峰專屬性好，理論塔板數(shù)按黃芩苷峰計算應(yīng)不低于10 000，見圖3。

2.3.5 線性關(guān)系考察分別各取“2.3.2”項中4 個成分對照品溶液適量，逐級稀釋成質(zhì)量濃度分別為100%、75%、50%、25%、10%、1%的對照品溶液，按指紋圖譜色譜條件測定，記錄峰面積?質(zhì)量濃度的線性回歸方程為：黃芩苷，Y=19 063X+6 744.9（R=0.999 9）；鹽酸黃柏堿，Y=5 622.8X-97.04（R=0.999 9）；鹽酸小檗堿，Y=20 807X-7 813.3（R=0.999 9）；阿魏酸，Y=12 473X-673.4（R=0.999 9），結(jié)果表明黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、阿魏酸分別在1.895～189.5、1.862～186.2、0.497～49.7、0.251～25.1 μg/mL 的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.6 精密度試驗取同一份當(dāng)歸六黃湯供試品溶液（S5），按“2.2.1”項色譜條件進樣6 次，計算黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、阿魏酸峰面積的RSD值分別為1.1%、1.2%、1.1%和1.5%，表明儀器精密度良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗取同一份當(dāng)歸六黃湯供試品溶液（S5），按“2.2.1”項色譜條件分別在0、2、4、8、12、16、20、24 h 進樣測定，計算各成分黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、阿魏酸峰面積的RSD 值分別為1.1%、1.3%、1.0%和1.2%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 重復(fù)性試驗取同一批當(dāng)歸六黃湯樣品（S5），平行制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項色譜條件進樣測定，計算各成分黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、阿魏酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 值分別為1.3%、1.1%、1.2%和1.1%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗取當(dāng)歸六黃湯樣品（S1）約0.05 g，按“2.3.3”項方法制備供試品溶液6 份，每組分別精密加入含189.5 μg/mL 黃芩苷對照品溶液4 mL、186.2 μg/mL 鹽酸小檗堿對照品溶液4 mL、49.7 μg/mL鹽酸黃柏堿對照品溶液1 mL、25.1 μg/mL阿魏酸對照品溶液1 mL。按“2.2.1”項色譜條件測定，記錄色譜圖，計算黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、阿魏酸的平均加樣回收率分別為98.33%、101.40%、99.19%、97.11%，RSD 分別為1.7%、1.9%、1.5%、1.3%，均滿足2020年版《中國藥典》要求。

2.3.10 15 批樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定取15 批當(dāng)歸六黃湯凍干粉，按指紋圖譜方法同時進行含量測定，計算樣品中黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、阿魏酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表3。15 批樣品中黃芩苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為10.99～18.82 mg/g、鹽酸小檗堿的為11.17～21.46 mg/g、鹽酸黃柏堿的為0.41～1.13 mg/g、阿魏酸的為0.28～0.58 mg/g。

2.4 出膏率的測定

取15批當(dāng)歸六黃湯凍干粉，按《中國藥典》水分測定法第二法（烘干法）測定水分，按公式“出膏率= 凍干粉質(zhì)量×（1-水分）/飲片投料量×100%”計算出膏率，結(jié)果見表3。15 批當(dāng)歸六黃湯樣品的出膏率范圍為24.05%～33.89%。

3 討論

3.1 質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定指標(biāo)的選擇

當(dāng)歸六黃湯經(jīng)典名方的制備采用水為溶劑進行煎煮，因此選擇各藥味中具有特征性的水溶性成分作為質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定指標(biāo)。據(jù)文獻報道，當(dāng)歸中的阿魏酸具有增強心肌的血液供應(yīng)、緩解心肌缺血的作用[9]；黃芩中的黃芩苷具有抗氧化、清除自由基、抗病毒和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等作用[10]；黃連中的鹽酸小檗堿具有抗菌、抗病毒等作用[11]；黃柏中的鹽酸黃柏堿在降血壓、抗腎炎、抑制細胞免疫反應(yīng)等方面均具有顯著效果[12]。以上這些代表成分均是水溶性成分，因此，本研究選擇它們作為質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定指標(biāo)。

3.2 指紋圖譜和質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定方法的考察

采用PDA 模式下通過對比不同波長的色譜圖，發(fā)現(xiàn)在檢測波長285 nm 下，當(dāng)歸六黃湯凍干粉供試品溶液檢測所得色譜峰信息更豐富，其中黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、阿魏酸4個成分峰響應(yīng)較高，分離度較好，故最終確定以285 nm 作為指紋圖譜和質(zhì)量分?jǐn)?shù)方法的檢測波長。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定方法考察中，供試品的制備方法分別考察了不同提取溶劑（甲醇、70%甲醇、30%甲醇、水）、提取方式（功率500 W、頻率40 kHz 超聲30 min 和210 r/min振搖30 min）、提取時間（10、20、30 min）對當(dāng)歸六黃湯中黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、阿魏酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響，并進行了方法學(xué)考察，最終確定了合適的供試品制備方法。

圖3 專屬性試驗色譜圖Figure 3 Chromatograms of specificity

表3 15批當(dāng)歸六黃湯凍干粉的出膏率和質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果Table 3 Results of yield and content of 15 batches of Danggui Liuhuang Decoction freeze?dried powder

3.3 當(dāng)歸六黃湯物質(zhì)基準(zhǔn)研究

本研究制備的15 批當(dāng)歸六黃湯樣品的出膏率范圍為24.05%～33.89%，平均出膏率為（28.61±8.58）%，15 批樣品的出膏率都在均值的±30%范圍內(nèi)，表明3 個產(chǎn)地的不同批次藥材質(zhì)量均一穩(wěn)定。采用超高效液相色譜法建立了15 批樣品的UPLC指紋圖譜，并按照2020年版《中國藥典》分析方法驗證指導(dǎo)要求完成了系統(tǒng)的方法學(xué)考察，通過15批樣品確定了20 個共有峰。20 個共有峰歸屬于除佐藥黃芪外的六味藥材：峰1 為當(dāng)歸、生地黃、熟地黃的共有峰，峰2 歸屬于熟地黃，峰3 為黃芩和黃柏的共有峰，峰4 為黃芩、黃連、黃柏的共有峰，峰5 歸屬于黃柏，峰6 為黃連和黃柏的共有峰，峰7、8 為黃芩、黃連、黃柏的共有峰，峰9 歸屬于黃連、黃柏，峰10、11、12 歸屬于黃連，峰13 歸屬于黃芩，峰14、15 歸屬于黃連，峰16、17、18、19、20均歸屬于黃芩。通過測定15批樣品的黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、阿魏酸4 個成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)河北與山東產(chǎn)地黃芩的黃芩苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，山西產(chǎn)地的較低；重慶與四川產(chǎn)地的黃連中鹽酸小檗堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，山西產(chǎn)地的較低；表明不同產(chǎn)地的藥材質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間有一定的差異。

指紋圖譜結(jié)合多指標(biāo)成分含量測定是對經(jīng)典名方復(fù)方制劑進行整體質(zhì)量評價的一種重要手段[13]，本研究建立了經(jīng)典名方當(dāng)歸六黃湯多指標(biāo)成分含量測定與指紋圖譜方法，該方法可用于當(dāng)歸六黃湯物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量控制。黃芪為本方中的佐藥，但黃芪皂苷類成分紫外光譜為末端吸收，受其他藥味干擾較大，故本研究未能建立黃芪指紋圖譜及含量測定方法。