黃瓜次生代謝產(chǎn)物抑制反硝化作用的研究

張新星，李睿琦，伊章華，徐一碩，高志嶺

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 / 河北省農(nóng)田生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000）

氮素是作物生長發(fā)育所需的重要營養(yǎng)元素，合理施用氮肥是作物高產(chǎn)的關(guān)鍵措施［1-2］。然而，目前我國農(nóng)田氮肥利用率普遍較低，施入農(nóng)田的氮肥約有40%～50%通過各種途徑流失［3］。在氮素循環(huán)轉(zhuǎn)化過程中，氨揮發(fā)、硝酸鹽的淋洗、硝化和反硝化過程是土壤氮素?fù)p失的主要途徑。土壤反硝化在不同的土壤環(huán)境中可導(dǎo)致25%～90%的氮肥損失［4-5］。反硝化作用不僅會(huì)降低氮肥的利用效率，同時(shí)產(chǎn)生的氮氧化物對(duì)環(huán)境也有嚴(yán)重的負(fù)面影響。

目前關(guān)于土壤氮素循環(huán)抑制劑的研究也主要集中在硝化和礦化這兩個(gè)過程［6-9］。常見的土壤氮素循環(huán)抑制劑主要為化學(xué)合成抑制劑［8-11］，化學(xué)合成抑制劑可有效的抑制土壤氮素的轉(zhuǎn)化，有些化學(xué)抑制劑還能提高作物的氮素利用率及產(chǎn)量。但是化學(xué)合成抑制劑因其成本高，生物穩(wěn)定性有限等原因，在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用并不廣泛［12］。

近年來，隨著對(duì)植物—微生物—土壤氮循環(huán)互作研究的深入，發(fā)現(xiàn)植物次生代謝產(chǎn)物中存在抑制土壤硝化及反硝化過程的物質(zhì)，并將其命名為生物硝化抑制劑（BNI）及生物反硝化抑制劑（BDI［13-14］。與化學(xué)抑制劑相比，生物抑制劑是植物自身產(chǎn)生的，具有易獲得、成本低、作用時(shí)間長且對(duì)生態(tài)環(huán)境友好等特點(diǎn)。植物次生代謝產(chǎn)物通過根系分泌及組織凋落腐解等方式進(jìn)入土壤，除了可以為根際土壤微生物提供氮源、碳源外，還具有介導(dǎo)植物對(duì)礦質(zhì)元素吸收利用以及幫助植物適應(yīng)外界環(huán)境變化的作用［15-17］。目前已明確臂形草根系分泌的Brachialactone［18］、高粱根系分泌的高粱醌和對(duì)羥基苯丙酸甲酯［19］、水稻根系分泌的1,9-葵二醇及卡蘭賈樹根系分泌的水黃皮素可以通過抑制氨單加氧酶(AMO)、羥胺還原酶(HAO)途徑或單獨(dú)抑制AMO途徑來抑制土壤硝化作用；Bardon 等［14,20-21］從Fallopia spp.根系提取物中發(fā)現(xiàn)B 型原花青素（PC）可以通過誘導(dǎo)酶的構(gòu)象變化，特異性的抑制與膜結(jié)合的硝酸還原酶活性，并在之后的研究中發(fā)現(xiàn)［22-23］，PC 可以特異性的抑制土壤反硝化細(xì)菌活性，而不影響土壤細(xì)菌的總豐度。

生物硝化/反硝化抑制劑的形成及釋放受植物種類、環(huán)境等多因素的影響，目前關(guān)于植物分泌硝化/反硝化抑制劑是否具有普遍性還未知，本研究選擇我國大宗蔬菜—黃瓜為研究對(duì)象，通過室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)，旨在明確黃瓜根系代謝產(chǎn)物中是否具有潛在的生物反硝化作用抑制物。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試黃瓜品種：‘津優(yōu)35 號(hào)’，氮素利用高效型品種，購于天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司。

供試反硝化模式菌株：缺乏N2O 還原酶的銅綠假單胞菌（ATCC13985，Pseudomonas aureofaciens購自美國農(nóng)業(yè)部菌種保存中心）

1.2 溶液的配置

黃瓜山崎營養(yǎng)液：四水合硝酸鈣0.95 g/L，硝酸鉀0.81 g/L，七水合硫酸鎂0.5 g/L，磷酸二氫銨0.155 g/L，硼酸0.003 g/L，七水合硫酸鋅0.002 g/L，五水合硫酸鈣5×10-5g/L，pH=6.5

LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L。

反硝化DM 培養(yǎng)基［24］：硝酸鉀0.72 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，七水硫酸鎂0.2 g/L，六水丁二酸二鈉2.8 g/L，pH 7.0。

1.3 黃瓜種子的催芽及種植

挑選籽粒飽滿的黃瓜種子，于溫水中浸泡3 ～5 h后將種子置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，放入人工氣候箱，恒溫(25±1) ℃黑暗培養(yǎng)，發(fā)芽后轉(zhuǎn)移到滅菌石英砂中定植，培養(yǎng)條件為白天22 ℃(14 h)，晚上18 ℃(10 h)，每隔4 d 澆1 次營養(yǎng)液。

1.4 根系代謝物質(zhì)的提取

1.4.1 根系分泌物的提取 取定植后生長30 d 的黃瓜幼苗，滅菌的去離子水洗凈根系后置于錫紙包裹的盛有無菌水的三角瓶中，光照條件下連續(xù)收集根系分泌物8 h。收集的水溶液過0.22 μm 濾膜真空抽濾后置于超低溫冰箱(-86 ℃)冷凍12 h，冷凍干燥機(jī)凍干。

稱取50 mg 根系分泌物凍干粉溶解于50 mL 色譜純的甲醇中，超聲提取30 min 后4℃環(huán)境下12 000 r/s離心10 min，收集上清液；上清液42℃旋蒸至干后，50 mL 的無菌水復(fù)溶，超聲提取30 min 后再次離心，將上清液與水不溶組分分開。未溶解組分冷凍干燥后用5 mL 甲醇復(fù)溶，得到非水溶性組分。上清液用3 倍體積的二氯甲烷進(jìn)行超聲波提取，分離出二氯甲烷層，30 ℃旋蒸至干，不溶物復(fù)溶于5 mL 液相色譜純甲醇中，得到根系分泌物的中性組分；用1 mol/L 的HCl 將上清液pH 值調(diào)為2，相同方法進(jìn)行提取，得到根系分泌物的酸性性組分。試驗(yàn)前，取5 mL 樣品，旋轉(zhuǎn)蒸至干后，5 mL 二氯甲烷復(fù)溶，備用。

1.4.2 根系提取物的提取 取定植后生長30 d 的黃瓜幼苗，使用前用滅菌的去離子水將根系洗凈，錫紙包裹置于液氮中速凍，后進(jìn)行冷凍干燥。稱取5 g凍干后的根在珠磨機(jī)中粉碎，溶解于50 mL 水∶甲醇(50∶50，v/v)中進(jìn)行30 min 的超聲提取，之后對(duì)提取液進(jìn)行真空抽濾，50 mL 純甲醇對(duì)殘?jiān)貜?fù)進(jìn)行兩次提取，將所有提取液收集到一起并干燥濃縮。使用前，將干燥后的樣品重新懸浮于水∶甲醇(50∶50，v/v)中，0.22μm 濾器過濾，得到10 mg/mL 提取物。

1.5 試驗(yàn)方案

1.5.1 細(xì)菌培養(yǎng) 將甘油瓶中的銅綠假單胞菌接種于滅菌的LB 肉湯培養(yǎng)基中，28 ℃下培養(yǎng)過夜，將處于指數(shù)生長期的細(xì)菌進(jìn)行離心收集菌體處理后，置于0.9%的NaCl 水溶液中重復(fù)洗滌3 次，之后復(fù)溶于50 mL 0.9%的NaCl 水溶液饑餓培養(yǎng)2 h。培養(yǎng)結(jié)束后離心，用反硝化DM 培養(yǎng)基復(fù)溶菌體并調(diào)整OD600為0.05，備用。

1.5.2 根系分泌物對(duì)銅綠假單胞菌代謝活性的影響由于根系分泌物的數(shù)量有限，該試驗(yàn)在含有氧化還原染料氯化四唑的Biology MT2 96 孔板中進(jìn)行，通過氧化還原染料變色程度判斷細(xì)菌厭氧呼吸代謝活性強(qiáng)度。取97 μL 菌液加入96 孔板中，并以2.5%的添加量將不同濃度的根系分泌物添加到96 孔板中，各處理根系分泌物的最終濃度分別為0.015、0.075、0.15、0.3 mg/mL，為創(chuàng)造反硝化過程發(fā)生的厭氧環(huán)境，最后在每孔中加入60 μL 礦物油覆蓋。將MT2 平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)12 h 后每隔3 h 用酶標(biāo)儀(590 nm)測(cè)定1 次代謝活性。

1.5.3 根系提取物對(duì)細(xì)菌反硝化過程的影響 設(shè)置根系提取物的濃度分別為0、0.005、0.02、0.1、0.25、0.5 mg/mL，將菌液及根系提取物溶液加入250 mL 帶有橡膠塞密閉的滅菌血清中，瓶中空氣用氮?dú)獯?，瓶?nèi)最終細(xì)菌OD600值為0.05，總體積為10 mL。培養(yǎng)開始前18 h，每間隔6 h 測(cè)定1 次氧化亞氮濃度，之后每隔12 h 測(cè)定1 次，連續(xù)測(cè)定66 h。最后一次氣體采樣后測(cè)定菌液中NO-N、NO-N 含量及OD600數(shù)值。N2O 采用氣象色譜儀(Agilent6820)進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)器為ECD，檢測(cè)溫度為330 ℃；NO-N 和NO-N 使用化學(xué)分析儀（SmartChem200）進(jìn)行測(cè)定；細(xì)菌OD600值采用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2016、SPSS 22.0 及origin 2018 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 根系分泌物對(duì)反硝化細(xì)菌厭氧代謝活性的影響

前期研究表明，細(xì)菌接種后會(huì)有一個(gè)遲滯期，10 ～12 h 后銅綠假單胞菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，因此本研究選取在培養(yǎng)的12 h 開始進(jìn)行厭氧代謝活性的測(cè)定（圖1）。

圖1 不同組分根系分泌物對(duì)銅綠假單胞菌厭氧代謝活性的影響Fig. 1 Effects of different components of root exudates on anaerobic metabolic activity of Pseudomonas aeruginosa

由圖1 可知，隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，銅綠假單胞菌代謝活性增強(qiáng)，與未添加根系分泌物的空白處理相比，各處理在12 h 測(cè)定開始時(shí)均表現(xiàn)出不同程度的抑制效果。酸性組分添加量為0.075 及0.15 mg/L 的處理在培養(yǎng)12 h 時(shí)與空白對(duì)照相比，顯著抑制了銅綠假單胞菌的代謝，抑制率分別為21.4%、21.1%；15 h 時(shí)0.075 mg/L 處理的抑制效果達(dá)到最大22.1%，其余處理與空白對(duì)照相比未表現(xiàn)出顯著差異 （圖1d）。中性組分中0.075 mg/L 的處理在培養(yǎng)的12 ～21 h內(nèi)表現(xiàn)出持續(xù)的顯著抑制效果，抑制效率分別為24.51%、27.59%、22.21%及19.46%；培養(yǎng)至24 h 時(shí)，0.015 mg/L 處理表現(xiàn)出顯著的抑制效果（圖1e）。非水溶組分中，0.3 mg/L 處理在整個(gè)培養(yǎng)期間均表現(xiàn)出顯著的抑制效果，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，抑制效果逐漸降低，各時(shí)期的抑制效率分別為25.75%、26.65%、21.31%、14.47%及9.1%；0.075 mg/L 處理在24 h 表現(xiàn)出顯著的抑制效果（圖1f）。

2.2 根系提取物對(duì)銅綠假單胞菌反硝化過程的影響

2.2.1 對(duì)細(xì)菌OD 值的影響 細(xì)菌OD600的高低直接反映了細(xì)菌量的多少，由圖2 可知，在適宜的培養(yǎng)條件下，與空白對(duì)照相比，根系提取物的添加量分別為0.005、0.02、0.1 及0.25 mg/L 的處理在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)細(xì)菌的OD600值無顯著變化，當(dāng)根系分泌物的添加量為0.5 mg/L 時(shí)，顯著促進(jìn)了銅綠假單胞菌的生長。

圖2 根系提取物對(duì)細(xì)菌生長的影響Fig. 2 Effect of root extract on bacterial growth

2.2.2 對(duì)氧化亞氮排放的影響 圖3 為根系提取物的添加對(duì)N2O 排放量的影響。與細(xì)菌的生長曲線一致，在0 ～12 h 內(nèi)氣體的累積排放量增長緩慢，12 ～42 h 進(jìn)入細(xì)菌對(duì)數(shù)生長期，此時(shí)細(xì)菌生長旺盛，氣體排放量大幅增加，42 h 氣體累積排放量趨于穩(wěn)定。與之相對(duì)的排放速率，在0 ～12 h 內(nèi)快速增加，12 ～30 h 漲幅降低，30 ～66 h 之后逐漸降低趨近于0。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，各處理間氣體累積排放量的差異逐漸擴(kuò)大，18 h 之后，添加根系提取物的處理N2O 的累積排放量均顯著高于空白對(duì)照處理，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，各處理N2O 累積排放量分別為對(duì)照處理的1.27、1.30、2.74 及2.77 倍，說明根系提取物的添加促進(jìn)了N2O 的生成。

圖3 根系提取物對(duì)N2O-N 排放的影響Fig. 3 Effect of root extract on N2O cumulative emission

圖4 根系提取物對(duì)硝態(tài)氮及亞硝態(tài)氮含量的影響Fig. 4 Effects of root extracts on nitrate and nitrite contents

2.2.4 相關(guān)性分析 對(duì)添加提取物的量及測(cè)定的各指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表1 所示。根系分泌物的添加量與N2O 累積排放量及細(xì)菌OD600值分別達(dá)到了顯著和極顯著正向強(qiáng)相關(guān)；與NO-N及NO-N 的含量均達(dá)到了極顯著負(fù)向強(qiáng)相關(guān)。除OD600與N2O 累積排放量之間無顯著相關(guān)性外，其余各指標(biāo)間均呈顯著或極顯著的相關(guān)關(guān)系。

表1 指標(biāo)間相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis between indicators

3 討論

大量研究表明，植物次級(jí)代謝產(chǎn)物中含有豐富的糖類、氨基酸、維生素等可作為微生物生長所需的碳源及氮源，刺激其生長及代謝活性的增強(qiáng)［25-27］，除此之外植物次級(jí)代謝產(chǎn)物中某些特殊物質(zhì)對(duì)土壤微生物或土壤養(yǎng)分循環(huán)具有特定的功能，例如單寧類物質(zhì)可通過絡(luò)合有機(jī)氮及土壤胞外酶的作用從而延緩有機(jī)氮的礦化，原花青素通過誘導(dǎo)酶的構(gòu)象變化，特異性的抑制與膜結(jié)合的硝酸還原酶活性，從而延緩反硝化過程的發(fā)生等。植物次生代謝產(chǎn)物中包含物質(zhì)種類繁多［15］，提取及純化方法的不同會(huì)影響最終提取物中物質(zhì)含量及組成［28-29］，并且根系分泌物及提取物為混合物，發(fā)生作用的不是單一組分效應(yīng)，而是各個(gè)組分間相互作用的綜合［24］，這與本研究中在相同培養(yǎng)條件下，添加不同組分及不同量的黃瓜次級(jí)代謝產(chǎn)物均對(duì)銅綠假單胞菌的反硝化能力影響具有差異的結(jié)果相一致。本研究結(jié)果表明黃瓜根系分泌物的酸性、中性及非水溶性組分對(duì)銅綠假單胞菌的厭氧代謝活性均表現(xiàn)出不同程度的抑制，說明在提取的混合組分中可能具有潛在生物反硝化抑制物質(zhì)的存在。合格的生物硝化/反硝化抑制劑可以特異性的抑制參與硝化及反硝化過程的酶的活性，而不影響微生物的組成及數(shù)量，由于本研究中只測(cè)定了反硝化細(xì)菌的厭氧代謝強(qiáng)度，并不能確定該抑制作用是通過抑制了細(xì)菌生長還是厭氧代謝酶活發(fā)生的，因此需要進(jìn)一步的試驗(yàn)進(jìn)行確定。本研究中，根系提取物添加量與培養(yǎng)結(jié)束時(shí)N2O 累積排放量、NO-N 含量、NO-N 含量及表征細(xì)菌數(shù)量的OD600間均達(dá)到了顯著或極顯著強(qiáng)相關(guān)，而OD600與N2O 累積排放量之間無顯著的相關(guān)關(guān)系，說明根系提取物的添加量在0.005 ～0.25 mg/L 時(shí)顯著促進(jìn)了反硝化細(xì)菌的厭氧呼吸及反硝化過程的發(fā)生，并沒促進(jìn)微生物的生長，當(dāng)根系提取物添加量為0.5 mg/L 時(shí)，顯著促進(jìn)了細(xì)菌的生長。在本研究中所采取的根系提取物處理方法下，未觀察到反硝化抑制現(xiàn)象的發(fā)生。

4 結(jié)論

本研究以‘津優(yōu)35 號(hào)’黃瓜根系分泌物及提取物為研究對(duì)象進(jìn)行室內(nèi)細(xì)菌純培養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果如下：

（1）根系分泌物的不同組分均表現(xiàn)出了不同程度的反硝化抑制能力，中性及非水溶性組分抑制效果較強(qiáng)，且持續(xù)時(shí)間久，最高抑制效率均出現(xiàn)在培養(yǎng)的第15 h，分別為27.59 %及26.65 %，黃瓜根系分泌物中可能存在潛在的生物反硝化抑制劑；

（2）低濃度根系提取物在不影響細(xì)菌生長的前提下顯著促進(jìn)了反硝化過程的進(jìn)行，高濃度根系提取物既刺激了細(xì)菌的生長同時(shí)促進(jìn)了反硝化過程的進(jìn)行；在本研究所采取的提取方法下，未觀察到根系提取物中潛在生物反硝化抑制劑存在的證據(jù)。