鼠李糖乳桿菌GR-1 介導MAPK 信號通路抗大腸桿菌誘導奶牛子宮內膜上皮細胞炎性損傷

劉佳瑋，馮曉微，焦玉蘭,3，孫 艷，靳天雄，馮鳴鵲，劉 蓓，劉明超,2

（1.河北農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，河北 保定 071001；2.河北省獸醫(yī)生物技術創(chuàng)新中心，河北 保定 071001；3.瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司，河北 保定 071001）

奶牛子宮內膜炎是一種嚴重危害奶牛健康的疾病，對奶牛養(yǎng)殖的經濟效益影響較大［1］。直接病因是病原微生物的感染，主要有大腸桿菌（Escherichia coli）、鏈球菌、葡萄球菌、棒狀桿菌等［2-3］。這些致病菌容易在奶牛產后侵入子宮，通過分泌黏附素與子宮內膜上皮細胞緊密結合并在此大量繁殖，其釋放的毒素和酶類物質被子宮內膜上皮細胞受體識別后，會引起炎癥反應。若致病菌未被及時清除，炎癥則會持續(xù)發(fā)展，造成上皮細胞的損傷，物理屏障被破壞，從而導致更多致病菌侵入機體［4］，引起子宮甚至全身的疾病。臨床上多采用抗生素治療奶牛子宮內膜炎，但耐藥菌株的大量出現(xiàn)使得該方法療效甚微，同時也提高了治療成本，因此迫切需要找到更為有效的治療手段。

益生菌作為抗生素的潛在替代品，可以通過搶占致病菌的黏附位點［5］、合成抑菌物質阻抑病原菌繁殖、調節(jié)子宮內pH 值等［6］手段預防及治療子宮疾病。乳酸菌是生物體內常見的益生菌，有學者從牛子宮內分離得到乳酸菌并將其作用于體外培養(yǎng)的牛子宮內膜上皮細胞，發(fā)現(xiàn)乳酸菌具有免疫調節(jié)作用［7］。Ametaj 等［8］發(fā)現(xiàn)通過陰道灌注乳酸菌，奶牛陰道內的膿性分泌物減少，產奶量提高。Genís 等［9］的研究證明從奶牛陰道內分離得到的乳酸菌可有效降低由大腸桿菌引起的炎癥反應，并降低IL-8 和IL-1β mRNA 的表達，相關試驗表明乳酸菌對于子宮炎癥的治療效果十分顯著。鼠李糖乳桿菌GR-1（Lactobacillus rhamnosusGR-1）是一種乳酸菌，其具有天然的益生特性，在抑制炎癥發(fā)展方面可以發(fā)揮顯著的作用［10］。然而與炎癥過程相關的分子機制錯綜復雜，具體通路機制還不是十分明確。因此探索乳酸菌防治奶牛子宮內膜炎的具體通路機制對開發(fā)新的奶牛子宮內膜炎防控和治療手段具有重大意義。

據(jù)報道，調節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（Mitogenactivated protein kinases，MAPK）信號通路是治療炎癥疾病的有效方法。因此本研究利用大腸桿菌刺激原代培養(yǎng)的奶牛子宮內膜上皮細胞（Bovine endometrial epithelial cells，BEECs）建立奶牛子宮內膜炎體外炎性模型，然后利用MAPK 特異性信號通路抑制劑來探究L.rhamnosusGR-1 抗奶牛子宮內膜炎性損傷的具體分子機制，為臨床治療奶牛子宮內膜炎提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 生物材料

奶牛子宮取自保定某回民屠宰場（未孕），待牛屠宰后，于冰盒上快速帶回實驗室進行后續(xù)操作。

大腸桿菌（O111：K58（B4），CVCC1450）、鼠李糖乳桿菌GR-1（ATCC55826）均由中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院臨床營養(yǎng)與免疫實驗室惠贈。

1.2 主要試劑

胎牛血清（FBS）購自Gemini 公司；DMEM/F12 培 養(yǎng) 基 購 自Gibco 公 司；Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒，以及SB203580、SP600125、PD98059 等特異性通路抑制劑均購自碧云天生物技術有限公司；LB 肉湯培養(yǎng)基、MRS 肉湯培養(yǎng)基均購自北京奧博星生物技術有限責任公司；p-JNK1、p-p38、p-ERK1/2 一 抗 均 購 自 美 國CST 公 司，GAPDH 一抗購自Proteintech 公司，堿性磷酸酶標記的二抗購自北京博奧森生物技術有限公司；FastKing-RT SuperMix 反轉錄試劑盒、Superreal PreMix Plus 熒光定量預混試劑盒由天根生化科技有限公司提供；MTT 試劑盒、RIPA 高效細胞裂解液、TriQuick 總RNA 提取試劑等其它常規(guī)試劑均購自索萊寶科技有限公司。

1.3 奶牛子宮內膜上皮細胞原代培養(yǎng)

按照王仕宇［11］改進的組織塊消化貼壁法，取健康未孕奶牛子宮內膜組織，加入5 mL 含2%雙抗、40%胰酶的DMEM/F12 培養(yǎng)基，4 ℃消化12 h，再將組織移至25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2的條件下貼壁培養(yǎng)，獲得原代奶牛子宮內膜上皮細胞。當細胞長滿細胞培養(yǎng)瓶底的80%～90%時，去除培養(yǎng)基，加入2 mL PBS 洗2 次，然后再加入900 μL 胰酶消化3 min，顯微鏡觀察細胞皺縮變圓，輕輕拍打使細胞懸浮后，加入2 mL 完全培養(yǎng)基終止消化，吸至離心管，1 000 r/min 離心5 min，棄去上清液，加入2 mL 完全培養(yǎng)基重懸并計數(shù)，按每瓶200 萬轉移至新細胞瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 MTT 法檢測細胞增殖

調整細胞濃度至3×105個/mL，按照100 μL/孔將細胞接種于96 孔板中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)12、24、36、48、60 和72 h 后，小心吸去上清，加入90 μL 新鮮培養(yǎng)液，再加入10μL MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸掉上清，每孔加入110 μL Formazan 溶解液，置搖床上低速振蕩10 min，在酶標儀490 nm 處測量各孔吸光度。

1.5 實驗處理

將處于對數(shù)生長期細胞濃度調整至5×105個/mL，按照2 mL/孔將細胞接種于6 孔板中培養(yǎng)24 h，換成無血清培養(yǎng)基過夜。本實驗室前期已經成功建立BEECs 炎性模型［12］，并確立了提前3 h加入作用濃度為5×106CFU/mL 的L.rhamnosusGR-1，再加入作用濃度為5×105CFU/mLE.coli刺激6 h 的炎性模型方案。試驗分為4 個組：對照組（CONT）、E.coli攻毒組（ECOL）、提前3 h加入L.rhamnosusGR-1 單獨處理組（LRGR）、提前3 h 加入L.rhamnosusGR-1 預處理再加入E.coli組（LRGR+ECOL）。特異性通路抑制劑作用濃度為10 μmol/L，隨L.rhamnosusGR-1 一同加入。

1.6 細胞凋亡檢測

當細胞增殖達到90%，去除培養(yǎng)液，利用PBS洗滌3 遍；吸取780 μL Annexin V-FITC 結合液到孔板中，再加入20 μL Annexin V-FITC，混勻；加40 μL 碘化丙啶染色液，混勻。然后用錫紙包蓋減少光源照射，室溫避光孵育20 min；在倒置熒光顯微鏡下觀察，Annexin V-FITC 是綠色熒光，碘化丙啶（PI）是紅色熒光，在1 h 內完成檢測。

1.7 Western blot 檢測p-JNK1、p-p38、p-ERK1/2蛋白的表達

加入細胞裂解液提取總蛋白，通過BCA 法將蛋白濃度調整一致；在濃縮膠上依次加入5 μL Marker和20 μL 待測蛋白；待蛋白跑至分離膠底部，采用濕式轉膜法，將蛋白轉至PVDF 膜；浸于5%的脫脂牛奶中封閉1 h；加入p-JNK1、p-p38、p-ERK1/2兔源單克隆抗體（1∶1 000），以GAPDH 鼠源單克隆抗體（1∶1 000）為內參，4 ℃孵育過夜；PBST洗膜4 次，每次5 min；加入與一抗對應的羊抗兔IgG/AP 抗體或羊抗鼠IgG/AP 抗體（1∶1 000），37 ℃、180 r/min，1 h；PBST 洗 膜4 次， 每 次5 min；BCIP/NBT 避光顯色；采用image j 軟件進行灰度分析。

1.8 實時熒光定量PCR

使 用TriQuick 試 劑 提 取 總RNA， 使 用FastKing-RT SuperMix 試劑盒合成cDNA。根據(jù)Superreal PreMix Plus 產品說明書，配置反應體系，引物（見表1）由天一輝遠生物科技有限公司合成。采用兩步法，擴增條件如下：95 ℃ 15 min 預變性；95 ℃ 10 s 變性，60 ℃ 30 s 退火延伸反應40 個循環(huán)。使用羅氏LightCycler 480 實時熒光定量PCR 系統(tǒng)（瑞士羅氏公司）檢測各基因Ct 值，以GAPDH為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-8 mRNA 的相對表達。

表1 目的基因引物序列、擴增片段長度及序列號Table 1 Target gene primer sequence, amplified fragment length and sequence number

1.9 統(tǒng)計分析

用SPSS 21.0 軟件進行單因素方差分析（One Way ANOVA），用LSD 法進行組間多重比較，結果用“平均值±標準誤”表示，用GraphPad Prism 8 軟件對數(shù)據(jù)進行作圖。P<0.05 表示差異性顯著，P<0.01 表示差異性極顯著。

2 結果與分析

2.1 細胞形態(tài)觀察和生長曲線

組織塊培養(yǎng)至第2 天，組織塊周圍有少量細胞爬出，形態(tài)呈“放射”狀；第8 天細胞基本長滿瓶底，大部分呈“鋪路石”狀；純化分離后的奶牛子宮內膜上皮細胞可進行傳代，與原代細胞生物學特征一致。

從奶牛子宮內膜上皮細胞生長曲線可以看出，12 ～24 h 時間內，細胞生長速度較為緩慢；24 ～60 h 時間段內，細胞生長速度迅速，處于對數(shù)生長期；60 ～72 h 時間段內，細胞生長速度比較平緩（見圖1），符合正常細胞增殖特性。

圖1 BEECs 生長曲線Fig. 1 Growth curve of BEECs

2.2 L. rhamnosus GR-1 對E. coli 誘導的BEECs凋亡的影響

與對照組相比，E.coli攻毒組的綠色單染數(shù)量明顯增多，表明E.coli使BEECs 的細胞膜普遍受損，處于凋亡早期；紅綠雙染數(shù)量也明顯增多，表明此部分細胞完全喪失細胞膜的完整性，處于凋亡中晚期或者已經壞死。與E.coli攻毒組相比，L.rhamnosusGR-1 預處理組的綠色單染數(shù)量和紅綠雙染數(shù)量均有所下降；與對照組相比，L.rhamnosusGR-1 單獨處理組綠色單染數(shù)量和紅綠雙染數(shù)量沒有顯著差異（圖2）。

圖2 細胞凋亡熒光檢測Fig. 2 Fluorescence detection of apoptosis

每組隨機選取3 個視野，記錄綠色單染數(shù)和紅綠雙染數(shù)，計算得出的細胞早期凋亡相對數(shù)、死亡相對數(shù)（圖3）。與對照組相比，E.coli攻毒組的早期細胞凋亡和細胞死亡數(shù)極顯著增高（P<0.01），L.rhamnosusGR-1 單獨處理組與L.rhamnosusGR-1預處理組的細胞凋亡數(shù)無顯著差異（P>0.05）；與E.coli攻毒組相比，L.rhamnosusGR-1 預處理組細胞凋亡數(shù)、死亡數(shù)均顯著降低（P<0.05），L.rhamnosusGR-1 單獨處理組細胞凋亡數(shù)、死亡數(shù)極顯著降低（P<0.01）。這表明E.coli可以損傷BEECs 的膜結構，從而導致了細胞凋亡，而L.rhamnosusGR-1 能夠保護BEECs，減少E.coli誘導引起的凋亡。

圖3 L. rhamnosus GR-1 對E. coli 誘導BEECs 凋亡的影響Fig. 3 The effect of L. rhamnosus GR-1 on the apoptosis of BEECs induced by E. coli

2.3 L. rhamnosus GR-1 對E. coli 誘 導 的BEECs中MAPK 通路的影響

利用Western blot 檢測BEECs 中p-p38、p-JNK1和p-ERK1/2 蛋白含量（見圖4）。

圖4 L. rhamnosus GR-1 對E. coli 誘導的BEECs 中MAPK 通路蛋白表達的影響Fig. 4 L. rhamnosus GR-1 effects on MAPK protein expression in E. coli-induced BEECs

與對照組相比，E.coli攻毒組p-p38、p-JNK1蛋白水平極顯著升高（P<0.01），p-ERK1/2 蛋白水平極顯著降低（P<0.01）。與E.coli攻毒組相比，L.rhamnosusGR-1 預處理組中p-p38、p-JNK1 蛋白水平極顯著降低（P<0.01），p-ERK1/2 蛋白水平無顯著差異（P>0.05）。與對照組相比，L.rhamnosusGR-1 單獨處理組中p-JNK1 和p-ERK1/2 蛋白水平降低（P<0.05 或P<0.01），p-p38 蛋白水平無顯著變化（P>0.05）。表明E.coli可以誘導BEECs 中p38、JNK 通路活化，而L.rhamnosusGR-1 可以抑制E.coli誘導的p38、JNK 通路活化。

2.4 L. rhamnosus GR-1 與MAPK 通路抑制劑對E. coli 誘導的BEECs 炎性因子的影響

在L.rhamnosusGR-1 預處理BEECs 3 h 加入E.coli刺激6 h 的基礎上，添加MAPK 特異性通路抑制劑，檢測細胞中mRNA 的表達（圖5）。與對照組相比較，E.coli攻毒組細胞中TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-8 mRNA 表達均顯著升高（P<0.05），而L.rhamnosusGR-1 單獨處理組的TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-8 mRNA 表達量與空白對照組無顯著性差異（P>0.05），表明E.coli可以誘導BEECs 產生炎性因子，L.rhamnosusGR-1 不能刺激BEECs 產生炎性因子；與E.coli攻毒組相比較，L.rhamnosusGR-1 單獨處理組及預處理組中的TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-8 mRNA 表 達 顯 著 降低（P<0.05）, 表明L.rhamnosusGR-1 可以調節(jié)E.coli誘導的BEECs 中炎性因子的表達；在添加p38 抑制劑SB203580 和JNK 抑制劑SP600125 后均能引起E.coli攻毒組和L.rhamnosusGR-1 預處理組TNF-α、IL-1β 和IL-6 mRNA 表達水平的顯著下降（P<0.05），添加ERK 抑制劑PD98059 后與添加前相比普遍沒有顯著性差異（P>0.05）。這些結果表明，抑制p38 與JNK 通路可以調節(jié)炎性因子的表達，而結合前文中L.rhamnosusGR-1 可以顯著抑制E.coli活化JNK、p38 通路的結論，可以得出由E.coli引起的BEECs 炎性反應與MAPK信號通路的活化密切相關，L.rhamnosusGR-1 對炎性因子的調控作用是來自于對JNK 與p38 信號通路的調節(jié)。

圖5 L. rhamnosus GR-1 和MAPK 通路抑制劑（SB203580、SP600125、PD98059）對E. coli 誘導的BEECs 中炎性因子mRNA 表達的影響Fig. 5 L. rhamnosus GR-1 and MAPK pathway inhibitors (SB203580, SP600125, PD98059)effects on the expression of inflammatory factors mRNA in E. coli-induced BEECs

3 討論與結論

本研究選取的益生菌菌株為L.rhamnosusGR-1，由于具有免疫活性調節(jié)的特點而備受關注。Yang 等［13］發(fā)現(xiàn)L.rhamnosusGR-1 的上清液可以緩解LPS 引起的炎癥和孕鼠流產。Otero 等［14］從健康奶牛生殖道內成功分離到了多株乳酸菌，并且大部分菌株可抑制奶牛子宮內膜炎致病菌的生長，經鑒定，這些乳酸菌菌株中就包括鼠李糖乳桿菌。由此可以看出L.rhamnosusGR-1 對致病菌具有一定的抑制作用，但其具體作用機制還有待進一步研究。

有學者發(fā)現(xiàn)乳酸菌L.rhamnosusGG 可以抑制腸上皮細胞的凋亡［15］，Liu 等［16］應用E.coli誘導BEECs 構建炎性模型，發(fā)現(xiàn)加入L.rhamnosusGR-1 共培養(yǎng)后可以減輕E.coli對細胞超微結構的損傷，表明L.rhamnosusGR-1 對上皮細胞具有保護作用。本研究中，E.coli誘導BEECs 膜結構的損傷導致了細胞凋亡的發(fā)生，L.rhamnosusGR-1 能夠抑制E.coli誘導的BEECs 的凋亡，進一步證明了L.rhamnosusGR-1 對BEECs 的保護作用。

Toll 樣 受 體（Toll like receptor，TLR） 可 特異性識別病原微生物，介導炎癥反應。TLR4 是第一個被發(fā)現(xiàn)的Toll 樣受體。當TLR4 信號通路激活，將信號轉導到細胞內，隨后與髓樣分化因子88（Myeloid differentiation factor 88，MyD88）結合，進而啟動下游核轉錄因子κB（Nuclear factor-κB，NF-κB）及MAPK 等信號通路。其中MAPK 主要分布在細胞質中，是細胞內信號轉導的通路，在上皮細胞的免疫中發(fā)揮關鍵作用，是調控炎癥過程的關鍵因子。MAPK 中3 條重要信號途徑為氨基末端激酶（JNK）、細胞外信號調節(jié)激酶1/2（ERK1/2）和p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）。其中ERK 主要介導細胞增殖、分化，JNK 主要介導細胞應激，p38 主要介導炎癥反應。Cronin 等［17］利用LPS 刺激奶牛子宮內膜細胞發(fā)現(xiàn)MAPK 通路快速磷酸化。Qiao 等［18］發(fā)現(xiàn)唾液乳桿菌可以調節(jié)產腸毒素大腸桿菌誘導的豬腸道上皮細胞中MAPK 信號通路的表達。本試驗結果表明L.rhamnosusGR-1 可以抑制E.coli誘導JNK、p38 通路的活化。對比發(fā)現(xiàn)，在本研究中，E.coli未能激活ERK 通路，與對照組相比，E.coli攻毒組顯著下降，這表明E.coli可以抑制BEECs 中ERK 通路，而L.rhamnosusGR-1未能調控E.coli對ERK 的抑制作用，這一結論與Qiao［18］在唾液乳桿菌抗ETECK88 誘導的IPEC-J2細胞炎癥模型中第6 小時的試驗結果一致。

近年來，在奶牛子宮疾病的相關研究中，越來越多的研究表明，MAPK 信號通路是調控炎性反應的潛在靶點［19-20］。本研究發(fā)現(xiàn)E.coli會顯著增加BEECs 內炎性因子的表達，L.rhamnosusGR-1可顯著降低E.coli誘導的BEECs 中炎性因子的表達水平，這些結果證實了L.rhamnosusGR-1 可通過調節(jié)炎性因子減少E.coli對BEECs 的損傷。為進一步探索MAPK 通路對促炎細胞因子下調的影響，本研究使用了MAPK 特異性信號通路抑制劑SB203580、SP600125 和PD98059， 特 異 性 信號通路抑制劑可以通透細胞，高選擇性的抑制目的信號轉導，常被用于信號途徑的研究。郭詠梅［21］發(fā)現(xiàn)SB203580、SP600125 可以抑制奶牛乳腺上皮細胞中MAPK 信號通路下游因子IL-1 的表達,進而保護細胞免受一氧化氮蓄積的損傷。Qiao［18］發(fā)現(xiàn)SB203580 的存在可以降低ETEC K88 誘導的IPEC-J2 細胞IL-1β、IL-8 和TNF-α 的表達水平。本研究發(fā)現(xiàn)SB203580、SP600125 可以顯著抑制E.coli誘導的BEECs 中炎性因子的表達。以上結果進一步證明了抑制p38 和JNK 信號通路是治療炎癥的有效手段。

綜上所述，本研究結果表明，L.rhamnosusGR-1 可通過抑制MAPK 下游的p38 和JNK 信號通路抑制E.coli誘導的BEECs 中TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-8 的表達而發(fā)揮抗炎作用，減少E.coli造成的損傷，為今后治療奶牛子宮內膜炎提供了新的路徑。