附加生長延緩劑和無菌水覆蓋延長葡萄試管苗繼代間隔的研究

劉文林，成曉華，杜國強(qiáng)，王 莉，師校欣

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，河北 保定 071001)

豐富的植物種質(zhì)資源為植物育種和遺傳研究提供了廣泛的遺傳基礎(chǔ)［1］。利用組織培養(yǎng)技術(shù)離體保存種質(zhì)資源可以克服資源圃保存的諸多弊病，具有所占空間小、基因型穩(wěn)定、不受季節(jié)限制、恢復(fù)生長快、便于運(yùn)輸和交流等優(yōu)點(diǎn)。葡萄種質(zhì)資源離體保存，最好進(jìn)行限制生長保存，通過延緩試管苗生長，延長繼代間隔時(shí)間，減少試管苗接種的工作量，降低變異機(jī)率［2］。

多效唑（PP333）、比久（B9）、矮壯素（CCC）、脫落酸（ABA）、馬來酰肼（MH）等生長延緩物質(zhì)應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)技術(shù)，在延緩生長、壯苗培養(yǎng)等方面取得了良好效果［3］。常騰飛等［4］研究表明B9、CCC、PP333 可延長‘富士’‘喬納金’蘋果試管苗保存時(shí)間；在培養(yǎng)基中添加適宜濃度的PP333、ABA 和B9，并結(jié)合不同光照和溫度培養(yǎng)條件，有效延長了芋頭試管苗的保存時(shí)間［5］；培養(yǎng)基附加 PP333 有效抑制了‘Melissa’‘巨玫瑰’葡萄試管苗生長，可用于該葡萄品種種質(zhì)離體保存［6］。近年來，眾多研究者開始試驗(yàn)一些新型的植物生長延緩劑，為試管種質(zhì)離體保存提供更多更好選擇［7］。烯效唑（S3307）與多效唑結(jié)構(gòu)相似，活性是多效唑的6 ～10 倍，高效、低毒、殘留量小、不污染環(huán)境，應(yīng)用前景更廣［8］。在腳板薯組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中附加烯效唑促進(jìn)了叢生芽分化生長，使節(jié)間縮短、莖段粗壯［9］。在培養(yǎng)基中添加烯效唑?qū)η噱X柳試管苗的生長和生理特性,有良好作用［10］。于弋珺等［11］試驗(yàn)證明，烯效唑可顯著抑制馬鈴薯試管苗生長，延長繼代間隔時(shí)間，又可以利用KT 與 IBA，迅速解除烯效唑的抑制作用?？s節(jié)胺（DPC）也是一種有效的生長延緩劑，可以使植物節(jié)間縮短，植株變矮。華婧等［12］研究發(fā)現(xiàn)添加100 mg/L 縮節(jié)胺可使馬鈴薯試管苗生長緩慢，頂端生長受抑強(qiáng)烈。這2 種生長延緩劑在葡萄品種試管苗離體保存中均未見應(yīng)用報(bào)道。

在種質(zhì)離體保存過程中，試管苗生存的養(yǎng)分和水分來源于培養(yǎng)基，試管苗保存時(shí)間短的一個(gè)重要因素是培養(yǎng)基干涸。Caplin 提出在培養(yǎng)基表面覆蓋礦物油能抑制植物養(yǎng)分消耗，降低生長速度，延長植物保存時(shí)間［13］，這種方式已應(yīng)用于香蕉和假馬齒莧等植物試管苗離體保存［14-15］。考慮到覆蓋礦物油成本較高，本研究通過在培養(yǎng)基表面覆蓋無菌水，降低材料周圍的氧氣濃度，抑制試管苗生長及培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，并結(jié)合附加烯效唑處理，期望達(dá)到延緩葡萄試管苗生長，減少培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，延長種質(zhì)離體保存時(shí)間的良好效果。

1 材料與方法

1.1 材料

供試葡萄品種為‘巨峰’（‘Kyoho’）、‘赤霞珠’（‘Cabernet Sauvignon’）、‘四倍體玫瑰香’（‘Tetraploid Muscat Hamburg’）、‘克瑞森無核’（‘Crimson Seedless’），試驗(yàn)于2016 年10 月—2018 年4 月在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 繼代培養(yǎng)基及常規(guī)培養(yǎng)條件 繼代培養(yǎng)基：B5+IAA 0.5 mg/L+白砂糖25 g/L+瓊脂6.0 g/L，pH值為6.0。常規(guī)培養(yǎng)條件：室溫25 ℃，光照強(qiáng)度為2 000 Lx，光周期為（光/暗）14 h /10 h。

1.2.2 培養(yǎng)基附加縮節(jié)胺對(duì)葡萄試管苗生長的影響 在繼代培養(yǎng)基中附加不同濃度的縮節(jié)胺，濃度設(shè) 置 為0、150、200、250、300、400、500、600、800、1 000 mg/L；試驗(yàn)接種材料為（1.5±0.1）cm 不帶葉片的單芽莖段。采用完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每處理6 瓶，每瓶接5 個(gè)莖段，重復(fù)3 次（下同）。每隔30 d 對(duì)試管苗的存活率進(jìn)行調(diào)查。

1.2.3 培養(yǎng)基附加烯效唑?qū)ζ咸言嚬苊缟L的影響 在繼代培養(yǎng)基中附加不同濃度的烯效唑，濃度設(shè)置為0、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L。每隔30 d 對(duì)試管苗的株高及存活率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.4 培養(yǎng)基表面覆蓋無菌水對(duì)葡萄試管苗生長的影響 莖段接種后即在培養(yǎng)基表面覆蓋無菌水。無菌水的體積設(shè)置為0、20、40、60、80 mL，并對(duì)液面做好標(biāo)記。每隔30 d 對(duì)試管苗的株高和存活率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.5 培養(yǎng)基附加烯效唑及表面覆蓋無菌水對(duì)葡萄試管苗生長的影響 將葡萄無葉單芽莖段接種在附加1.0 mg/L 烯效唑的培養(yǎng)基中，再覆蓋0、20、40、60、80 mL 無菌水。每隔60 d 對(duì)試管苗的株高和存活率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.6 恢復(fù)生長 將以上處理的葡萄試管苗延緩生長180 d 后轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基上常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 數(shù)據(jù)調(diào)查

存活率（%）= 存活株數(shù) / 接種數(shù) × 100

株高為培養(yǎng)基表面以上部分的植株高度，試管苗生長至8.5 cm 達(dá)到封口膜后彎曲生長，無法精確測量其高度，最終高度以≥ 8.5 cm 表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel、DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)12.01 版對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及方差分析（多重比較采用鄧肯新復(fù)極差測驗(yàn)），百分率數(shù)據(jù)進(jìn)行了反正弦平方根轉(zhuǎn)換。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基附加縮節(jié)胺對(duì)葡萄試管苗生長的影響

培養(yǎng)基附加不同濃度的縮節(jié)胺，對(duì)‘巨峰’‘赤霞珠’葡萄試管苗的萌芽率和生根率無明顯影響，但能顯著抑制葡萄試管苗植株高度，且濃度越高，抑制生長作用越明顯?？s節(jié)胺濃度800 和1 000 mg/L 時(shí)，試管苗的莖、葉畸形嚴(yán)重，不適于作為延緩試管苗生長的適宜濃度。縮節(jié)胺對(duì)葡萄試管苗存活率的影響如表1 所示，‘巨峰’葡萄試管苗保存至180 d 時(shí)，200 ～250 mg/L 縮節(jié)胺處理的存活率雖高于對(duì)照，但僅達(dá)到10.0%～14.4%，故縮節(jié)胺不適宜‘巨峰’等葡萄延緩生長保存（其它不適宜品種‘四倍體玫瑰香’‘克瑞森無核’的數(shù)據(jù)略）。附加250 mg/L縮節(jié)胺處理的‘赤霞珠’試管苗保存180 d 的存活率100%，顯著高于其它處理，因此培養(yǎng)基附加250 mg/L 的縮節(jié)胺可用于‘赤霞珠’試管苗延緩生長保存（表1）。

表1 培養(yǎng)基附加不同濃度縮節(jié)胺對(duì)‘巨峰’和‘赤霞珠’葡萄試管苗存活率的影響Table 1 The effect of supplying Mepiquat Chloride in the media on the survival rate of ‘Kyoho’ and‘Cabernet Sauvignon’ grape plantlets in vitro

2.2 培養(yǎng)基附加烯效唑?qū)ζ咸言嚬苊缟L的影響

將‘巨峰’‘四倍體玫瑰香’‘克瑞森無核’葡萄試管苗接種于附加0、0.5、1.0、2.0 和4.0 mg/L 烯效唑的培養(yǎng)基中，觀察不同濃度烯效唑?qū)υ嚬苊缟L的影響，結(jié)果如圖1 所示，附加低濃度的烯效唑顯著抑制了‘巨峰’‘四倍體玫瑰香’和‘克瑞森無核’試管苗生長，可將試管苗頂端干枯時(shí)間分別延遲30 ～90 d，過高濃度的烯效唑?qū)υ嚬苊绲囊种谱饔锰珡?qiáng)，致使長時(shí)間保存存活率降低，‘克瑞森無核’品種雖在2.0 mg/L 濃度下存活率最高，但試管苗根系過于粗壯，莖葉卷縮、顏色異常，不宜采用。附加0.5 mg/L 烯效唑時(shí)，有效延長了‘巨峰’‘四倍體玫瑰香’和‘克瑞森無核’試管苗保存時(shí)間，保存180 d 時(shí)，3 個(gè)品種試管苗的存活率分別為50%、45%、67%，而對(duì)照僅能保存120 d；附加1.0 mg/L 烯效唑時(shí)，也能在180 d 時(shí)保持較高存活率，與0.5 mg/L烯效唑處理差異不顯著。為此，在培養(yǎng)基中附加0.5 ～1.0 mg/L 的烯效唑?qū)ρ娱L葡萄試管苗繼代間隔時(shí)間有良好作用。

圖1 培養(yǎng)基附加烯效唑?qū)ζ咸言嚬苊缟L的影響Fig.1 The effect of supplying Uniconazole in the media on the growth of grape plantlets in vitro

2.3 培養(yǎng)基表面覆蓋無菌水對(duì)葡萄試管苗生長的影響

將‘巨峰’‘四倍體玫瑰香’‘克瑞森無核’葡萄試管嫩梢去掉葉片，切分成約1.5 cm 的單芽莖段，接入培養(yǎng)基中，隨即在培養(yǎng)基表面倒入不同體積的無菌水，結(jié)果表明（圖2、3），覆蓋無菌水初期有一定的推遲莖段萌芽、抑制生長作用，同時(shí)出現(xiàn)‘玻璃化’現(xiàn)象，但是當(dāng)植株生長露出水面后，嫩梢和葉片可恢復(fù)正常，后期生長量與對(duì)照差異不顯著。隨培養(yǎng)時(shí)間延長，覆蓋無菌水處理有效抑制了培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，延長了葡萄試管苗的保存時(shí)間。由于加水量增加，試管苗葉片腐爛程度加重，從試管苗狀態(tài)及抑制培養(yǎng)基水分蒸發(fā)綜合考慮，適宜的覆蓋水量為20 ～40 mL。

圖2 培養(yǎng)基表面覆蓋不同體積無菌水對(duì)葡萄試管苗生長的影響Fig.2 The effect of covering different amount sterile water on the medium surface on the growth of the grape plantlets in vitro

圖3 培養(yǎng)基覆蓋不同體積無菌水的‘巨峰’葡萄試管苗生長狀態(tài)（120 d）Fig.3 The growth status of the 'Kyoho' grape plantlets in vitro on the media that covered with different amount of sterile water (120 d)

2.4 培養(yǎng)基附加烯效唑同時(shí)表面覆蓋無菌水對(duì)葡萄試管苗生長的影響

限制試管苗保存時(shí)間的一個(gè)重要因素是隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，培養(yǎng)基逐漸干涸，為了更好抑制試管苗生長和培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，進(jìn)行了培養(yǎng)基中附加1.0 mg/L 烯效唑同時(shí)覆蓋不同體積無菌水的試驗(yàn)。結(jié)果表明，該組合處理能夠有效推遲‘巨峰’‘四倍體玫瑰香’‘克瑞森無核’無葉莖段腋芽萌發(fā)及不定根的發(fā)生時(shí)間，且加水量越多，抑制作用越明顯（數(shù)據(jù)略）。浸沒在水中的莖段萌芽后易‘玻璃化’，隨株高增加，試管苗逐漸露出水面，后期新長出的莖葉逐漸恢復(fù)正常。

培養(yǎng)基附加1.0 mg/L 烯效唑及表面覆蓋20～80 mL無菌水的組合處理有效延長了‘巨峰’‘四倍體玫瑰香’和‘克瑞森無核’試管苗保存時(shí)間，保存180 d 時(shí)，3 個(gè)品種的試管苗存活率分別由只加烯效唑單一處理的55%、50%、70%提高到組合處理的100%。從存活率、生長狀態(tài)及玻璃苗發(fā)生情況考慮，建議在附加烯效唑的培養(yǎng)基上覆蓋40 mL 無菌水（圖4、5）。

圖4 培養(yǎng)基附加烯效唑及表面覆蓋無菌水對(duì)葡萄試管苗生長的影響Fig.4 The effect of supplying Uniconazole in the medium and covering sterile water on the medium on the growth of the grape plantlets in vitro

圖5 附加烯效唑及覆蓋無菌水對(duì)‘巨峰’葡萄試管苗生長的影響（180 d）Fig.5 The effect of supplying Uniconazole and covering sterile water on the growth of the 'Kyoho' grape plantlets in vitro (180 d)

2.5 恢復(fù)生長

將培養(yǎng)基附加縮節(jié)胺處理的‘赤霞珠’試管苗、附加烯效唑處理以及附加烯效唑同時(shí)覆蓋無菌水處理的‘巨峰’‘四倍體玫瑰香’及‘克瑞森無核’試管苗延緩生長180 d 后轉(zhuǎn)接到普通繼代培養(yǎng)基上常規(guī)培養(yǎng)。

培養(yǎng)基附加縮節(jié)胺處理的葡萄試管苗在第1 代均能恢復(fù)正常生長。附加烯效唑處理的試管苗在第1 代普遍恢復(fù)效果不好，第2 代恢復(fù)正常，在植株形態(tài)及生長量方面與對(duì)照相比無顯著性差異。培養(yǎng)基附加烯效唑及表面覆蓋無菌水處理的試管苗恢復(fù)效果依品種而異，大部分根系有增粗的現(xiàn)象，‘巨峰’品種在第1 代即恢復(fù)生長；‘四倍體玫瑰香’與‘克瑞森無核’在第1 代恢復(fù)效果不好，第2 代恢復(fù)正常。推測是烯效唑在不同品種試管苗中的殘留效應(yīng)不同導(dǎo)致（圖6）。

圖6 恢復(fù)生長培養(yǎng)的試管苗（第1 代）Fig.6 The plantlets in vitro grew in conventional medium (First subculture stage)

3 討論與結(jié)論

縮節(jié)胺、烯效唑是一類植物內(nèi)源激素赤霉素（GA）的拮抗物質(zhì)，它們能夠抑制赤霉素合成通路中某些基因的表達(dá)，從而抑制赤霉素的合成，延緩植物生長，外施赤霉素類似物后植株就能恢復(fù)正常［16-17］。縮節(jié)胺常用于馬鈴薯組培中，主要目的為壯苗及誘導(dǎo)試管薯等［18-19］。本研究表明，縮節(jié)胺對(duì)葡萄試管苗延緩生長保存的效果因品種而異，‘巨峰’‘四倍體玫瑰香’和‘克瑞森無核’等試管苗不適宜，培養(yǎng)基中附加250 mg/L 的縮節(jié)胺對(duì)‘赤霞珠’試管苗延緩生長有較好作用。這與不同基因型馬鈴薯試管苗對(duì)縮節(jié)胺濃度敏感性存在差異的結(jié)果類似［12］。其原因推測可能是不同葡萄基因型對(duì)縮節(jié)胺的敏感性不同，另外與赤霉素有多條合成途徑有關(guān)，縮節(jié)胺對(duì)每條赤霉素合成途徑的抑制作用可能存在差異。

烯效唑作為一種高活性植物生長延緩劑，具有延緩植物生長、促根壯苗、增強(qiáng)抗逆性等作用。潘學(xué)軍等在培養(yǎng)基添加0.1 mg/L 的烯效唑結(jié)合低溫、弱光培養(yǎng)在野生毛葡萄試管苗離體保存中取得良好效果；同時(shí)研究表明適宜的烯效唑等處理增加了試管苗葉肉細(xì)胞的緊密度，提高了試管苗的保護(hù)酶和可溶性蛋白含量即提高了抗氧化能力，是烯效唑用于離體保存成功的重要機(jī)制之一［20］。但不同的植物種類及不同的試管材料應(yīng)用時(shí)適宜的烯效唑濃度存在差異。周恒等［21］研究顯示適合草莓試管苗種質(zhì)保存的烯效唑濃度為0.1 mg/L，超過0.15 ～0.20 mg/ L 時(shí)，試管苗多數(shù)死亡。培養(yǎng)基添加6 mg /L烯效唑，可將木薯胚性愈傷組織的繼代時(shí)間由20 d延長至80 d［22］。本研究結(jié)果表明在培養(yǎng)基中附加0.5 ～1.0 mg/L 的烯效唑可有效抑制葡萄試管苗生長，適于離體種質(zhì)保存。

本研究篩選出的適宜烯效唑處理雖然能有效延緩試管苗生長，但由于常溫下培養(yǎng)基中的水分蒸發(fā)，培養(yǎng)基干涸造成試管苗死亡，導(dǎo)致延長葡萄試管苗繼代間隔時(shí)間的效果并不十分理想，為此本研究創(chuàng)造性地進(jìn)行了培養(yǎng)基附加烯效唑同時(shí)覆蓋無菌水的處理。在培養(yǎng)基表面覆蓋無菌水的方法至今未見報(bào)道，一般認(rèn)為植物長期浸泡于水中或澇漬脅迫下進(jìn)行無氧呼吸，大量消耗可溶性糖，積累有毒化合物，影響植物正常生長［23-24］；另外一個(gè)限制因素是試管苗覆蓋在無菌水中會(huì)出現(xiàn)‘玻璃苗’，本團(tuán)隊(duì)進(jìn)行葡萄和其它果樹及花卉覆蓋無菌水的試驗(yàn)都會(huì)遇到這個(gè)問題，但葡萄有別于其它植物的特點(diǎn)是培養(yǎng)基中未加細(xì)胞分裂素6-BA（6-BA 與‘玻璃苗’發(fā)生有關(guān)），這樣玻璃化程度較輕，且植株長勢(shì)高，隨著保存時(shí)間的延長，植株慢慢露出水面，水對(duì)植物的影響作用逐漸降低，長出水面的葡萄試管苗即可恢復(fù)正常，對(duì)植株存活率沒有明顯影響。而其它植物繼代培養(yǎng)基中加有6-BA，‘玻璃苗’本身發(fā)生嚴(yán)重，且多為叢芽增殖，不同于葡萄試管苗后期能長出水面，因此很難恢復(fù)正常。培養(yǎng)基中覆蓋20 ～40 mL無菌水對(duì)延長葡萄試管苗保存時(shí)間有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，延緩生長保存中將延緩劑與覆蓋無菌水的組合處理比單一處理效果更好。在無菌水蒸干之后向培養(yǎng)基表面繼續(xù)附加無菌水或營養(yǎng)液的方法值得進(jìn)一步研究。