外源脯氨酸緩解玉米幼苗鹽脅迫的效應(yīng)

陳奮奇，方 鵬，白明興，姬祥卓，莊澤龍，彭云玲

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 甘肅 蘭州 730070；3. 甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 甘肅 蘭州 730070）

土壤鹽堿化嚴(yán)重制約了全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)與發(fā)展，全球約20%耕地和33%灌溉農(nóng)田受到土壤鹽分的影響[1]。同時(shí)，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的不合理灌溉和過度施肥導(dǎo)致土壤鹽堿化逐年加劇，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的影響也逐年加重[2]。植物在高鹽環(huán)境中會(huì)受到滲透和離子雙重脅迫而營(yíng)養(yǎng)失衡，同時(shí)產(chǎn)生活性氧損害自身的生理和代謝活動(dòng)，進(jìn)而影響正常生長(zhǎng)，造成農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的巨大損失[3-4]。因此，如何利用好鹽漬化土地，減少鹽堿土對(duì)農(nóng)作物的傷害，增加農(nóng)民的收入，已成為全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要任務(wù)之一。

脯氨酸(proline, Pro)是重要的滲透調(diào)節(jié)保護(hù)劑之一，分子量小，水溶性大，對(duì)細(xì)胞無毒害作用，其在緩解植物遭受的逆境脅迫中發(fā)揮著重要的作用[5-6]。在逆境環(huán)境下，植物通過合成大量的Pro來調(diào)節(jié)滲透平衡，穩(wěn)定原生質(zhì)膠體和組織代謝，以緩解植物因脅迫引起的損傷，從而提高植物的抗逆性[7]。外源Pro的施用也會(huì)增加植物對(duì)逆境的抵御能力和適應(yīng)性，尤其對(duì)鹽脅迫具有較好的緩解效果，如王瑋等[8]采用水培法研究外源Pro對(duì)鹽脅迫下蘿卜(Raphanus sativus)幼苗生長(zhǎng)及生理生化的影響，結(jié)果表明施加外源Pro可通過提高抗氧化酶的活性和有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量有效緩解鹽脅迫對(duì)蘿卜幼苗生長(zhǎng)的抑制作用，從而增強(qiáng)蘿卜植株對(duì)鹽脅迫的抗性和適應(yīng)能力。陳曉云等[9]也通過不同濃度外源Pro處理100 mmol·L-1NaCl脅迫下的蕎麥(Fagopyrum esculentum)幼苗，結(jié)果表明20～30 mmol·L-1Pro是緩解蕎麥鹽脅迫的最佳濃度，該濃度處理時(shí)，鹽脅迫下的蕎麥葉片質(zhì)膜透性和丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量顯著降低，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性和凈光合速率顯著增加。因此，說明外源Pro可誘導(dǎo)植物體內(nèi)產(chǎn)生抵抗鹽脅迫的能力，提高植物對(duì)鹽脅迫的耐受性。

玉米(Zea mays)是世界上最重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物之一，其既可作為糧食、飼料，又可作為生物能源，但其是一種非耐鹽性作物[10-11]。李文陽等[12]通過不同的鹽濃度處理不同玉米品種，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下玉米苗期的株高和地上部鮮重顯著下降，且下降速度與鹽濃度成正比。此外，鹽脅迫還會(huì)導(dǎo)致玉米幼苗長(zhǎng)勢(shì)弱小，氣孔導(dǎo)度低，光合效率差，嚴(yán)重影響其后期的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量[13]。所以，提高玉米在苗期的耐鹽性對(duì)其后期的生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)量具有極其重要的意義，而關(guān)于外源Pro對(duì)鹽脅迫下不同耐鹽性玉米自交系幼苗生長(zhǎng)緩解效應(yīng)的研究鮮見報(bào)道。因此，本研究以玉米耐鹽自交系8723和鹽敏感自交系P138為試材，在鹽脅迫下添加外源Pro，從生長(zhǎng)參數(shù)、生理特性和離子穩(wěn)態(tài)三方面研究外源Pro對(duì)鹽脅迫下耐鹽性不同玉米自交系在苗期的影響，旨在探索利用外源Pro來緩解鹽脅迫對(duì)作物的毒害，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用化學(xué)調(diào)控手段提高作物對(duì)鹽脅迫的耐受性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料來自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米課題組前期篩選出的耐鹽玉米自交系8723 (來源于引進(jìn)玉米自交系8723)和鹽敏感玉米自交系P138 (來源于美國(guó)雜交種P78599的后代材料)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理，分別為CK：蒸餾水；Pro：250 μmol·L-1Pro；N：180 mmol·L-1NaCl；NP：180 mmol·L-1NaCl + 250 μmol·L-1Pro。每 個(gè) 處 理3次 生 物 學(xué) 重復(fù)。以上處理濃度均為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米課題組實(shí)驗(yàn)室前期篩選所得的最佳處理濃度[14]。

1.2.2 幼苗生長(zhǎng)試驗(yàn)

1.3 指標(biāo)測(cè)定與方法

1.3.1 生長(zhǎng)參數(shù)測(cè)定

分別從各處理中取長(zhǎng)勢(shì)健康且整體一致的幼苗5株，用直尺分別測(cè)定株高與最長(zhǎng)根長(zhǎng)度，并分別稱量地上部與地下部鮮重。

1.3.2 生理指標(biāo)測(cè)定

相對(duì)含水量(relative water content)與相對(duì)電導(dǎo)率(relative conductivity)的測(cè)定參照彭云玲等[15]；SOD活性、過氧化物酶(peroxidase, POD)活性、過氧化氫酶(catalase, CAT)活性測(cè)定參照Zhang和Kirkham[16]；根系活力(root activity)測(cè)定參照白寶璋等[17]。游離脯氨酸含量測(cè)定采用茚三酮顯色法[18]，可溶性糖含量(soluble sugar content)測(cè)定采用蒽酮硫酸比色法測(cè)定[19]；MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸顯色法[20]。各指標(biāo)3次重復(fù)。

1.3.3 離子含量測(cè)定

將各植株從營(yíng)養(yǎng)缽中取出沖洗干凈，將根、莖、葉分離，于105 ℃烘箱中殺青30 min后置于80 ℃烘箱中48 h烘干至恒重，然后粉碎過0.25 mm篩，離子含量采用H2SO4-H2O2法在Topwave微波消解儀(Analytik Jena，德國(guó))中進(jìn)行消化。分別準(zhǔn)確稱取0.5 g根、莖、葉于微波消解罐中，加入濃硫酸5 mL和30%過氧化氫2 mL，按微波消解儀的操作流程進(jìn)行消解。消解結(jié)束，等消解罐冷卻后將消解液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用去離子水定容至刻度混勻備用。K、Ca、Na標(biāo)準(zhǔn)溶液購(gòu)自國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心。利用TAS-990 Super原子吸收分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)采用火焰原子吸收法(FL-AAS)測(cè)定各個(gè)離子的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)，采用Duncan法進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果用平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用Excel 2016作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源Pro對(duì)玉米生長(zhǎng)參數(shù)的影響

鹽脅迫及外源Pro處理下，兩耐鹽性不同玉米自交系的生長(zhǎng)情況存在差異(圖1)。與CK相比，鹽脅迫下P138與8723的苗長(zhǎng)、根長(zhǎng)、地上部鮮重、地下部鮮重均降低，且P138的這些指標(biāo)均達(dá)到顯著變化(P＜ 0.05)，分別降低了39.81%、39.36%、44.22%和46.27%；而8723僅根長(zhǎng)與地下鮮重顯著降低，分別降低了17.55%和27.98%。與CK相比，Pro處理下兩自交系的苗長(zhǎng)、根長(zhǎng)、地上部鮮重、地下部鮮重均無顯著差異(P＞ 0.05)；而與鹽處理相比，NP處理下，P138的苗長(zhǎng)、根長(zhǎng)、地上部鮮重、地下部鮮重均顯著升高，分別增加了38.06%、28.75%、43.90%和41.67%；而8723僅根長(zhǎng)與地下鮮重顯著升高，分別增加了15.32%和42.34%。以上結(jié)果說明外源Pro對(duì)鹽敏感自交系P138的緩解效果比耐鹽自交系8723明顯。

152 程序性死亡配體 1 在索拉非尼耐藥肝癌細(xì)胞中的表達(dá)和功能 孫非凡，李 東，李 華，王 濤，劉 煜，張 濤

圖1 鹽脅迫及外源Pro對(duì)玉米幼苗表型的影響Figure 1 Effects of salt stress and exogenous Pro on maize seedling phenotype

2.2 外源Pro對(duì)玉米幼苗生理特性的影響

鹽脅迫及外源Pro處理下，P138與8723在生理特性方面也存在差異(圖2)。兩自交系在不同處理下，相對(duì)含水量與根系活力均呈現(xiàn)先降后升趨勢(shì)，而其他生理指標(biāo)均呈現(xiàn)出先升后降趨勢(shì)。8723的相對(duì)含水量與根系活力在各處理下均未表現(xiàn)出顯著差異(P＞ 0.05)，而P138在鹽脅迫下較CK分別下降了29.35%和53.34%。兩自交系的Pro含量、SOD及POD活性在鹽脅迫下顯著升高(P＜ 0.05)，P138分別是CK的1.97、2.59和1.71倍，8723分別是CK的2.04、2.57和1.62倍，兩自交系在Pro含量、SOD及POD活性的上升幅度比較相近。鹽脅迫下相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量、CAT活性及可溶性糖含量在P138中也顯著升高，分別是CK的3.04、2.07、2.46和2.61倍，除相對(duì)電導(dǎo)率外，其余3個(gè)指標(biāo)在8723中也顯著升高。此外，與CK相比，Pro處理下，兩自交系的各生理特性指標(biāo)均未發(fā)生明顯差異；而與鹽處理相比，NP處理下相對(duì)含水量與根系活力在兩自交系中均表現(xiàn)出升高趨勢(shì)，且在P138中均顯著性升高，分別升高了19.97%和40.86%；而Pro含量、MDA含量、SOD活性、POD活性、CAT活性及可溶性糖含量在兩自交系中均表現(xiàn)出降低趨勢(shì)，并且在P138中均顯著降低，分別降低了29.22%、31.48%、29.32%、17.48%、27.43%和38.72%；而8723僅Pro含量、SOD活性及POD活性顯著降低，分別為11.66%、17.04%和10.17%。

圖2 外源Pro對(duì)玉米幼苗生理特性的影響Figure 2 Effect of exogenous Pro on physiological characteristics of maize seedlings

2.3 不同處理玉米幼苗期離子含量的變化

2.3.1 不同處理玉米幼苗期的Na+含量

在鹽脅迫及外源Pro處理下兩玉米自交系根、莖、葉中Na+含量表現(xiàn)存在差異(圖3)。與CK相比，鹽脅迫下兩自交系根、莖、葉中Na+含量均顯著升高(P＜ 0.05)，且在P138中分別升高了6.79、4.65和5.58倍，8723分別升高了7.58、6.53和5.74倍。此外，與CK相比，Pro處理下，兩自交系的根、莖、葉中Na+含量均未發(fā)生明顯差異(P＞ 0.05)；而與鹽處理相比，NP處理下，P138的根、莖、葉中Na+含量均顯著降低，分別降低了41.83%、34.83%和24.66%，而8723僅在根和葉中Na+含量顯著降低，分別降低了34.24%和15.14%；NP處理下P138各部位Na+含量變幅大于8723。

2.3.2 不同處理玉米幼苗期的K+含量

與CK相比，鹽脅迫下兩自交系根、莖、葉中K+含量均顯著降低(P＜ 0.05) (圖3)，P138分別降低了28.12%、58.83%和56.70%，8723分 別 降 低 了31.27%、35.32%和36.91%，P138莖和葉中K+含量相比8723降低幅度更大。此外，與CK相比，Pro處理下兩自交系的根、莖、葉中K+含量均未發(fā)生明顯差異(P＞ 0.05)；而與鹽處理相比，NP處理下兩自交系根、莖、葉中K+含量均顯著升高，P138分別升高了15.82%、47.10%和70.80%，8723分別升高了23.56%、18.70%和25.53%；P138莖與葉中K+含量升高幅度大于8723。

圖3 不同處理下玉米幼苗中Na+、 K+、Ca2+ 含量的變化Figure 3 Changes in Na+, K+, and Ca2+ levels in maize seedlings under different treatments

2.3.3 不同處理玉米幼苗期的Ca2+含量

鹽脅迫下兩自交系根、莖、葉中的Ca2+含量較CK處理均顯著下降(P＜ 0.05) (圖3)，P138分別降低了61.76%、52.13%和53.32%，8723分 別 降 低 了50.79%、38.67%和37.79%，P138各部位Ca2+含量相比8723降低幅度更大。此外，與CK相比，Pro處理下，兩自交系的根、莖、葉中Ca2+含量均未發(fā)生明顯差異(P＞ 0.05)；而與鹽處理相比，NP處理下兩自交系根、莖、葉中的Ca2+含量均顯著升高，P138分別升高了120.37%、51.78%和68.95%，8723分別升高了55.86%、20.60%和28.72%，說明P138各部位Ca2+含量升高幅度明顯大于8723。

2.3.4 不同處理玉米幼苗中的Na+、K+、Ca2+比值

在鹽脅迫下，8723和P138各個(gè)部位的K+/Na+和Ca2+/Na+較CK均 顯 著 下 降(P＜ 0.05) (表1)。與CK相比，Pro處理下兩自交系的根、莖、葉中K+/Na+和Ca2+/Na+均未發(fā)生明顯變化(P＞ 0.05)；而與鹽處理相比，NP處理下兩自交系各部位Ca2+/Na+均顯著升高，且鹽敏感自交系P138根與莖中K+/Na+比值均顯著升高，分別升高了99.31%和130.00%，耐鹽自交系8723根與葉中K+/Na+比值均顯著升高，分別升高了88.79%和46.82%。

表1 不同處理下米幼苗K+/Na+和Ca2+/Na+的變化Table 1 Changes in K+/Na+ and Ca2+/Na+ in maize seedlings under different treatments

3 討論與結(jié)論

根系是植物最早感受到鹽脅迫的器官，且其生長(zhǎng)會(huì)因脅迫而受到抑制，植物處于幼苗期時(shí)，表現(xiàn)得尤為明顯[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，耐鹽玉米自交系8723與鹽敏感玉米自交系P138在鹽脅迫下，根長(zhǎng)和地下鮮重相較于清水對(duì)照均顯著降低，且P138的降低幅度更大，這表明P138對(duì)鹽脅迫表現(xiàn)出了更強(qiáng)烈的反應(yīng)。苗長(zhǎng)可以較好地反映玉米在幼苗期地上部生長(zhǎng)狀況的好壞。在鹽脅迫下，兩自交系中僅P138的苗長(zhǎng)與地上鮮重相比于對(duì)照組均顯著降低。在NP處理下，兩個(gè)自交系的苗長(zhǎng)、根長(zhǎng)、地上鮮重及地下鮮重均有所升高，且P138的這些指標(biāo)均顯著升高。因此，說明外源Pro可以緩解鹽脅迫對(duì)玉米幼苗的傷害作用，且對(duì)鹽敏感自交系的緩解效果更明顯，這與沙漢景等[22]在水稻(Oryza sativa)中的研究結(jié)果一致。

相對(duì)含水量高低能夠反映植物抵御鹽脅迫引起的生理干旱水平[11]。根系活力也是一種評(píng)價(jià)植物抵御鹽脅迫的重要指標(biāo)[23]。相對(duì)電導(dǎo)率能夠反映鹽脅迫對(duì)植物細(xì)胞膜的損傷程度，其值較低時(shí)表明植物細(xì)胞膜因鹽脅迫引起的損傷越低，抵抗鹽脅迫的能力越強(qiáng)[15,24-25]。此外，鹽脅迫會(huì)破壞植物細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)代謝系統(tǒng)的平衡，導(dǎo)致活性氧含量的累積。而這些活性氧因膜脂的過氧化或脫脂作用，使得細(xì)胞膜受到損傷和破壞，從而增大細(xì)胞膜透性，引起MDA含量的升高[26-27]。SOD是清除活性氧的關(guān)鍵酶，其能夠催化O2-或者HO2-歧化成O2和H2O2，而POD與CAT主要負(fù)責(zé)清除細(xì)胞內(nèi)的H2O2[21]。在本研究中，鹽脅迫下，P138的相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量、CAT活性、SOD活性、POD活性及可溶性糖含量均顯著升高，而相對(duì)含水量與根系活力均顯著降低；除相對(duì)電導(dǎo)率外，8723中其他指標(biāo)也顯著升高，而相對(duì)含水量與根系活力無顯著變化。因此，說明玉米幼苗因鹽脅迫導(dǎo)致活性氧的積聚與清除系統(tǒng)的平衡破壞，使得抗氧化物酶SOD、CAT以及POD活性顯著提高。在外源Pro的作用下，鹽敏感玉米自交系P138的相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量、CAT活性、SOD活性、POD活性及可溶性糖含量較鹽脅迫處理均顯著降低，而8723中僅Pro含量、SOD活性及POD活性顯著降低。這表明外源Pro通過提高玉米幼苗體內(nèi)3種抗氧化酶的活性，提高對(duì)活性氧的清除能力，進(jìn)而降低活性氧對(duì)其細(xì)胞膜的過氧化作用，從而有效緩解鹽害作用，這一緩解效果在P138中表現(xiàn)更為突出。Pro具有清除活性氧，降低細(xì)胞滲透勢(shì)，維持細(xì)胞膜正常功能的作用，故此其不僅是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，而且也是關(guān)鍵的抗氧化物質(zhì)[28]。本研究中，兩個(gè)玉米自交系的Pro含量在鹽脅迫下均顯著升高，這與在石竹(Dianthus chinensis)中的研究結(jié)果[29]相一致。當(dāng)施用外源Pro后，兩個(gè)自交系中Pro含量相比鹽脅迫均顯著降低，而P138降低更為明顯，這可能是由于外源Pro的補(bǔ)償，使得內(nèi)源Pro含量降低，提高了玉米幼苗的耐鹽性。

鹽脅迫對(duì)植物的生長(zhǎng)抑制主要在于兩方面，一方面是由于活性氧的積聚而造成的過氧化傷害，另一方面則是離子脅迫引起的植物體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)離子平衡的紊亂，兩個(gè)過程相互促進(jìn)，進(jìn)而影響植物正常的生理代謝過程[30-31]。在鹽脅迫下，植物細(xì)胞內(nèi)Na+的增多會(huì)明顯抑制K+選擇性吸收的能力[32]。同時(shí)，高濃度的Na+會(huì)交換出細(xì)胞中的Ca2+，引起植物體內(nèi)Ca2+含量的降低，破壞細(xì)胞內(nèi)離子平衡，進(jìn)而造成營(yíng)養(yǎng)離子代謝失調(diào)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下，兩玉米自交系根、莖和葉中Na+含量均顯著升高，但K+與Ca2+含量在兩自交系的根、莖和葉中均顯著降低。K+/Na+和Ca2+/Na+比值是衡量細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)和傷害程度的重要指標(biāo)[33]。本研究發(fā)現(xiàn)兩玉米自交系的K+/Na+和Ca2+/Na+比值在鹽脅迫下均顯著降低。當(dāng)鹽脅迫與外源Pro交互處理后，兩自交系根、莖和葉Na+含量較鹽脅迫處理均顯著降低，而K+和Ca2+含量均顯著提高，且K+/Na+和Ca2+/Na+比值大部分顯著升高，這與Sobahan等[34]在水稻和李廣魯?shù)萚35]在冰葉日中花(Mesembryanthemum crystallinum)中的研究結(jié)果相一致。因此，這說明外源Pro很可能是通過某些生理機(jī)制來提高玉米幼苗細(xì)胞內(nèi)K+和Ca2+含量，降低Na+含量，進(jìn)而有效提高了玉米幼苗的耐鹽性。

此外，研究發(fā)現(xiàn)，在25 mmol·L-1NaCl脅迫下，外源Pro增加了鹽敏感水稻的葉綠素、脯氨酸和抗壞血酸含量、K+/Na+比值及抗氧化酶活性，但這些數(shù)據(jù)在耐鹽水稻中基本沒有受到影響[36]。并且，沙漢景等[22]利用外源Pro緩解鹽脅迫下水稻的研究中也發(fā)現(xiàn)，外源Pro對(duì)鹽敏感品種的調(diào)控作用大于耐鹽品種。在本研究中，外源Pro對(duì)鹽脅迫下鹽敏感玉米自交系幼苗各生長(zhǎng)參數(shù)及相關(guān)生理指標(biāo)的緩解程度也大于耐鹽自交系。因此，說明外源Pro對(duì)鹽敏感品種具有更好地緩解效應(yīng)。據(jù)此推測(cè)實(shí)際生產(chǎn)中，若要通過使用外源Pro提高玉米幼苗的耐鹽性，應(yīng)該首先考慮所選玉米自交系本身的耐鹽特性。當(dāng)使用對(duì)象是鹽敏感自交系時(shí)，會(huì)取得更好的效果。

綜上所述，添加外源Pro能夠有效緩解鹽脅迫下玉米幼苗的生長(zhǎng)抑制，其作用過程主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面，一方面通過提高SOD、POD以及CAT等抗氧化物酶的活性以及玉米體內(nèi)游離Pro含量，進(jìn)而降低甚至清除其體內(nèi)活性氧的積聚，從而減少丙二醛含量并穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，以此提高玉米幼苗的耐鹽性和對(duì)鹽環(huán)境的適應(yīng)性。另一方面外源Pro可通過提高玉米細(xì)胞內(nèi)K+和Ca2+含量，減少Na+的毒害作用，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞體內(nèi)離子平衡能力，維持原有細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)離子平衡穩(wěn)態(tài)，從而提高玉米幼苗對(duì)鹽脅迫的耐性?？傊?80 mmol·L-1的NaCl脅迫下，施加外源250 μmol·L-1的Pro可以有效緩解兩個(gè)玉米自交系受到鹽脅迫的傷害，尤其對(duì)鹽敏感自交系的緩解效果更明顯。但是關(guān)于外源Pro與玉米內(nèi)源Pro含量的關(guān)系，以及對(duì)活性氧代謝、離子平衡調(diào)節(jié)的分子機(jī)理有待于進(jìn)一步研究證明。