晚期糖基化終產(chǎn)物受體阻斷劑FPS-ZM1減緩ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的作用△

謝 妃，吳岳恒，林吉進(jìn)，1

［1.華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣州 510006；2.廣東省心血管病研究所心內(nèi)科廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），廣州 510080］

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種以血管壁纖維增生、慢性炎癥、脂質(zhì)積聚和免疫功能紊亂為特征的病理疾?。?］。隨著粥樣斑塊的不斷進(jìn)展，不穩(wěn)定斑塊容易破裂，導(dǎo)致急性心血管事件，而斑塊發(fā)生破裂則與局部的炎癥反應(yīng)、血栓形成以及蛋白降解有密切關(guān)系［2］。雖然低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）仍然是AS 最重要的危險(xiǎn)因素，但近年來(lái)，AS 的免疫和炎癥機(jī)制引起了人們極大的興趣，目前針對(duì)炎癥反應(yīng)這一靶點(diǎn)來(lái)干預(yù)AS 發(fā)展的方法尚不成熟［1，3-4］。晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）是一類(lèi)屬于免疫球蛋白家族的多配體受體，能與晚期糖基化終末產(chǎn)物（ad?vanced glycation end products，AGEs）、S100/鈣粒蛋白家族、高遷移率族蛋白1（high mobility group box，HMGB1）等配體結(jié)合發(fā)揮促炎作用［5］，并在AS 中起重要作用，在AS 患者中血漿AGEs、S100/鈣粒蛋白家族、HMGB1、RAGE 濃度均升高［6-8］，同時(shí)伴隨各炎癥因子升高，其與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，深入探究RAGE 在AS 中的炎癥機(jī)制可為AS 治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 主要藥品與試劑

FPS-ZM1 粉末（selleck，s8185），用DMSO 配備10 mg/mL 的FPS-ZM1 儲(chǔ)備液，臨用前用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）配置成工作液腹腔注射給藥；高脂飼料及純化對(duì)照飼料（江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司，XT108C）；飽和油紅O染液（上海索萊寶生物科技有限公司，G1015）；蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒（上海愛(ài)必信生物科技有限公司，abs9217）；RAGE抗體（Abcam，ab37647）；小鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（CUSABIO，CSB-E04741m）；小鼠纖溶酶原激活物抑制物-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）ELISA 試劑盒（CSB-E07947m）。

1.2 主要儀器

XTL250 型體式顯微鏡，全自動(dòng)血生化分析儀（日本日立）；病理切片機(jī)（賽默飛世爾科技）；正置顯微鏡（奧林巴斯有限公司）；成像系統(tǒng)（日本濱松）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀Multiskan GO（Thermo Scien?tific）。

1.3 動(dòng)物分組及給藥

6 周齡雄性無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)ApoE-/-小鼠購(gòu)自廣東藥康生物科技有限公司，體質(zhì)量20～25 g，在華南理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)動(dòng)物房中飼養(yǎng)，檢疫1 周，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，ApoE-/-小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組（CTRL組，純化對(duì)照飼料喂養(yǎng)），AS 模型組（AS 組，高脂飼料喂養(yǎng)），F(xiàn)PS-ZM1 干預(yù)組（FZM1 組，高脂喂養(yǎng)加FPS-ZM1 腹腔注射），每組8 只。ApoE-/-小鼠高脂喂養(yǎng)8 周后，開(kāi)始腹腔注射給藥，連續(xù)4 周，F(xiàn)PS-ZM1 干預(yù)組給予1 mg·kg-1·d-1的FPS-ZM1［9］，其余組給予PBS 作為對(duì)照。每周根據(jù)小鼠體質(zhì)量變化調(diào)整給藥。

1.4 小鼠血脂濃度測(cè)定

摘除小鼠眼球取血，收集于乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）采血管，分離血漿，分裝后-80 ℃保存直至使用。采用全自動(dòng)生化儀測(cè)定血漿三酰甘油（triacylglycerol，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein-cho?lesterol，HDL-C）濃度。

1.5 小鼠主動(dòng)脈取材

眼球取血后采用頸椎脫臼法將ApoE-/-小鼠處死，開(kāi)胸開(kāi)腹后剪除右心耳，用預(yù)冷的PBS 從左心室開(kāi)始灌流，直至肝臟發(fā)白，分離心臟，以主動(dòng)脈根部為起點(diǎn)，沿脊柱旁仔細(xì)快速分離主動(dòng)脈至髂總動(dòng)脈分叉處為止，后轉(zhuǎn)移至體式顯微鏡下，于裝有預(yù)冷的PBS 的皿中操作，仔細(xì)剝離主動(dòng)脈周?chē)M織，自主動(dòng)脈根部上1 cm 處左右垂直分離主動(dòng)脈，近端主動(dòng)脈根部置于4%多聚甲醛溶液固定，用于包埋切片。遠(yuǎn)端主動(dòng)脈置于液氮速凍后保存于-80 ℃用于蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)。

1.6 小鼠主動(dòng)脈切片油紅O、蘇木素伊紅染色

將4%多聚甲醛固定的小鼠主動(dòng)脈根部置于蔗糖溶液脫水后，使用OCT 包埋，切片厚6 μm，每隔10 張收取3 張，每只小鼠取15 張，5 張用于油紅O 染色，5 張用于HE 染色，5 張用于免疫組化檢測(cè)RAGE表達(dá)［10］。用于油紅O染色的切片于60%異丙醇中漂洗20 s，取油紅O 貯備液6 mL，加蒸餾水4 mL，混合后靜置10 min，過(guò)濾后用于染色。油紅O 染色時(shí)間為5 min；60%異丙醇稍洗去多余染液，蒸餾水洗；Mayer 蘇木素淺染核1 min，1%鹽酸酒精稍分化，水漂洗10 min，用濾紙將切片周?chē)帜ǜ?，封片。HE染色按HE試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。采用Image pro plus 6.0軟件測(cè)量主動(dòng)脈斑塊面積比（%）。

1.7 切片免疫組織化學(xué)染色

測(cè)定小鼠主動(dòng)脈組織RAGE 表達(dá)：各組主動(dòng)脈組織常規(guī)包埋、固定、切片，將切片脫蠟復(fù)水后，采用熱修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)，采用試劑盒進(jìn)行免疫組化染色，在光學(xué)正置顯微鏡非重疊視野下分別觀察組織著色情況。采用Image pro plus 6.0 軟件對(duì)主動(dòng)脈組織RAGE 表達(dá)情況進(jìn)行半定量。

1.8 Western blot 檢測(cè)

將小鼠主動(dòng)脈組織剪碎，加入組織裂解液抽提蛋白，用二辛可酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒（碧云天）測(cè)定總蛋白濃度，加入一定比例的蛋白上樣緩沖液，95℃金屬浴10 min，取20 μg 蛋白進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，5%脫脂牛奶封閉1 h，進(jìn)行一抗（RAGE，1∶1 000）孵育，4℃過(guò)夜，洗膜3 次，每次5 min，進(jìn)行HRP 標(biāo)記的二抗（1∶1 000）孵育，4 ℃1 h，洗膜，最后化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）顯色進(jìn)行掃描拍照，采用Imge J 計(jì)算灰度值來(lái)表示RAGE 的相對(duì)表達(dá)量。

1.9 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定

將保存于-80 ℃的血漿逐級(jí)解凍，按照ELISA試劑盒說(shuō)明測(cè)定血漿樣本中TNF-α以及PAI-1的濃度。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0.2 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以（）表示，單因素多樣本組間均數(shù)比較采用one-way ANOVA 分析，多因素多組間均數(shù)比較采用two-way ANOVA 分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組小鼠血脂濃度比較

與對(duì)照組（CTRL）比較，AS模型組ApoE-/-小鼠血漿TC、LDL-C濃度均顯著增高（P＜0.05），但TG 濃度下降（P＜0.05），HDL-C 濃度無(wú)明顯變化；FPSZM1 干預(yù)組（FZM1）血脂各指標(biāo)與對(duì)照組及AS 模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 3 組小鼠血漿TG、TC、LDL-C 和HDL-C 濃度比較柱狀圖（n=8）

2.2 3 組小鼠主動(dòng)脈根部切片油紅O 染色、蘇木素伊紅染色比較

油紅O 染色鏡下觀察正常對(duì)照組（CTRL）小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜下油紅O 染色紅色著色區(qū)少，AS 模型組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜下紅色著色區(qū)顯著增加（P＜0.01），F(xiàn)PS-ZM1 干預(yù)組（FZM1）小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜下著色區(qū)域較AS 模型組減少（P＜0.01），見(jiàn)圖2A和2C。HE 染色鏡下觀察正常對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑完整，AS 模型組小鼠主動(dòng)脈局部?jī)?nèi)膜明顯增厚，斑塊突向管腔，內(nèi)膜下有大量泡沫細(xì)胞聚集和脂質(zhì)沉積，中層彈力纖維破壞、排列紊亂，并有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，且斑塊面積比例較AS 模型組顯著增加（P＜0.01），而FPS-ZM1 干預(yù)組小鼠主動(dòng)脈只有少量泡沫細(xì)胞，斑塊面積較AS 模型組明顯減低（P＜0.01），見(jiàn)圖2B 和2D。

圖2 3 組小鼠主動(dòng)脈根部切片油紅O 染色、HE 染色結(jié)果比較（比例尺=100 μm；n=8；A 圖為3 組小鼠主動(dòng)脈根部切片油紅O 染色鏡下圖像比較；B 圖為3 組小鼠主動(dòng)脈根部切片HE 染色鏡下圖像比較；C 圖和D 圖分別為3 組小鼠主動(dòng)脈根部切片油紅O 染色、HE 染色結(jié)果比較柱狀圖）

2.3 3組小鼠主動(dòng)脈Western blot、主動(dòng)脈切片RAGE免疫組化染色比較

與對(duì)照組（CTRL）比較，AS 模型組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈Western blot 結(jié)果顯示RAGE 表達(dá)顯著增高（P＜0.01），F(xiàn)PS-ZM1 干預(yù)組（FZM1）小鼠RAGE蛋白表達(dá)量較AS 模型組降低（P＜0.05），見(jiàn)圖3A和3C。主動(dòng)脈切片免疫組化染色結(jié)果與蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)一致，AS 模型組小鼠主動(dòng)脈較對(duì)照組平均光密度值（AOD）顯著增加（P＜0.01），而FPSZM1 干預(yù)組（FZM1）小鼠主動(dòng)脈免疫組化染色較AS 模型組有所減低（P＜0.05），見(jiàn)圖3B 和3D。

圖3 3 組小鼠主動(dòng)脈Western blot、主動(dòng)脈切片RAGE 免疫組化染色比較（比例尺=100 μm；n=8；A 圖為3 組小鼠主動(dòng)脈RAGE 的Western blot 結(jié)果比較；B 圖為3 組小鼠3 組小鼠主動(dòng)脈切片RAGE 免疫組化染色鏡下圖像比較；C 圖為3 組小鼠主動(dòng)脈Western blot、主動(dòng)脈切片RAGE 免疫組化染色比較柱狀圖）

2.4 3組小鼠血漿酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果比較

與對(duì)照組（CTRL）比較，AS 模型組的ApoE-/-小鼠血漿中TNF-α、PAI-1 濃度均顯著升高（P＜0.01）；與AS 模型組比較，F(xiàn)PS-ZM1 干預(yù)后（FZM1）ApoE-/-小鼠血漿TNF-α、PAI-1 濃度下降（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 3 組ApoE-/-小鼠血漿TNF-α 和PAI-1 的ELISA測(cè)定結(jié)果比較（n=8）

3 討論

AS 是導(dǎo)致心血管疾病最常見(jiàn)的病理基礎(chǔ)，心血管疾病是以粥樣硬化斑塊形成為特點(diǎn)的大、中動(dòng)脈疾病，斑塊內(nèi)包括壞死組織、鈣化結(jié)晶、修飾的脂質(zhì)聚集、炎癥平滑肌細(xì)胞（SMCs）、內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）、白細(xì)胞和泡沫細(xì)胞。AS 斑塊的這些特征表明，AS 是一種復(fù)雜的疾病，血管、代謝和免疫系統(tǒng)的許多成分參與了這一過(guò)程。近年來(lái)，AS 的免疫和炎癥機(jī)制引起了人們極大的興趣，炎癥因子與炎癥細(xì)胞在AS 中起重要作用［3］。

AS 是大動(dòng)脈內(nèi)皮下脂質(zhì)驅(qū)動(dòng)的慢性炎癥過(guò)程，ApoE-/-小鼠高脂喂養(yǎng)可以最大限度地模擬人類(lèi)各個(gè)階段的AS 病變。本研究采用主動(dòng)脈切片油紅O 染色、HE 染色觀察小鼠主動(dòng)脈AS 病理形態(tài)學(xué)改變進(jìn)行AS 指標(biāo)定量檢測(cè)，結(jié)果均表明12 周高脂飲食可誘發(fā)ApoE-/-小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的高脂血癥和明顯的主動(dòng)脈病變。血脂檢測(cè)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)RAGE 拮抗劑FPS-ZM1 對(duì)ApoE 小鼠的高血脂各指標(biāo)均無(wú)影響，表明抑制RAGE 對(duì)AS 病變的影響與調(diào)控血脂無(wú)關(guān)，這與Mitchell 等［11］的研究結(jié)果一致，RAGE 的敲除對(duì)循環(huán)中脂質(zhì)無(wú)影響。

RAGE 是一種1 型跨膜糖蛋白，由于其胞外區(qū)域中存在多個(gè)Ig 樣結(jié)構(gòu)域，因而認(rèn)為是受體Ig 超家族的成員。細(xì)胞外區(qū)域包含三個(gè)Ig 結(jié)構(gòu)域，包括V 型結(jié)構(gòu)域，C1 型結(jié)構(gòu)域和C2 型結(jié)構(gòu)域。配體的結(jié)合主要發(fā)生在V 型結(jié)構(gòu)域中。細(xì)胞外區(qū)域后面是單個(gè)跨膜區(qū)域和一個(gè)短的，帶高電荷的胞內(nèi)段結(jié)構(gòu)域（ctRAGE），其與胞內(nèi)銜接蛋白結(jié)合對(duì)下游信號(hào)傳導(dǎo)至關(guān)重要［5，12］。RAGE 因能與AGE 結(jié)合而得名，后研究發(fā)現(xiàn)RAGE 基于電荷和多聚體狀態(tài)可結(jié)合許多內(nèi)源性非AGE 配體，比如S100/鈣粒蛋白家族、HMGB1 等等。S100/鈣粒蛋白家族、HMGB1、AGEs 均與炎癥反應(yīng)有密切關(guān)系，且在AS時(shí)表達(dá)有所增加［6，13-14］。這些配體與RAGE 結(jié)合可刺激活性氧（reactive oxygen species，ROS）、促炎性細(xì)胞因子、細(xì)胞黏附分子的產(chǎn)生和促血栓形成，活化核因子κB（nuclear factor Kappa-B，NF-κB）能進(jìn)一步上調(diào)RAGE 表達(dá)，使得炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)持續(xù)發(fā)生，這些都與心血管疾病的病理生理有關(guān)［15］。FPS-ZM1 可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RAGE V 型結(jié)構(gòu)域，阻礙RAGE 與其他配體結(jié)合，從而抑制RAGE 下游信號(hào)傳導(dǎo)［16］，從而減弱其生物效應(yīng)。由于RAGE胞漿結(jié)構(gòu)域缺乏內(nèi)源性激酶活性，其發(fā)出信號(hào)并影響轉(zhuǎn)錄程序和細(xì)胞功能的方式一直不明確，直到發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物透明蛋白1（forin diaphanous-1，DIAPH-1）才得以闡明。RAGE 的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域主要是氨基酸R366/Q367，通過(guò)與DIAPH-1 的福爾曼同源1（FH1）結(jié)構(gòu)域結(jié)合來(lái)傳導(dǎo)信號(hào)；當(dāng)這些氨基酸突變?yōu)楸彼峄驅(qū)IAPH-1 敲除后會(huì)導(dǎo)致RAGE 與DIAPH-1無(wú)法結(jié)合［17］，F(xiàn)PS-ZM1在RAGE 胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域與DIAPH-1相互作用中的影響有待探索。

本實(shí)驗(yàn)中，在ApoE-/-小鼠中應(yīng)用FPS-ZM1抑制RAGE 信號(hào)后發(fā)現(xiàn)AS 斑塊有所減輕，且抑制促炎因子TNF-α 的釋放，減輕AS 的炎癥。組織纖溶酶原激活劑（t-PA）和PAI-1 是纖溶系統(tǒng)的一對(duì)重要的調(diào)節(jié)因子，主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生和分泌。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞組織纖溶酶原激活劑/PAI-1 的動(dòng)態(tài)平衡被打破時(shí)，血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)增加。RAGE抑制劑在AS 模型小鼠中的使用可減少PAI-1 的釋放，從而降低心肌梗死并發(fā)癥的可能性。

綜上所述，本研究在高脂誘發(fā)的ApoE-/-小鼠AS 模型中，通過(guò)RAGE 阻斷劑FPS-ZM1 的干預(yù)減緩了AS 的進(jìn)展，且AS 斑塊的減少與血脂調(diào)控?zé)o關(guān)，同時(shí)FPS-ZM1 抑制了促炎因子TNF-α 和促血栓因子PAI-1 的釋放。本研究結(jié)果將為開(kāi)發(fā)以RAGE 為靶點(diǎn)的預(yù)防AS 藥物提供理論基礎(chǔ)。