接種地衣芽孢桿菌發(fā)酵的普洱茶品質(zhì)與微生物群落分析

劉琨毅， 王利妍， 安江珊， 王興華， 羅 慧，范家坤， 陳立佼， 馬 燕， 趙 明,2,*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶學(xué)院/食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南省藥用植物生物學(xué)重點實驗室/西南中藥材種質(zhì)創(chuàng)新與利用國家地方聯(lián)合工程研究中心， 云南 昆明 650201；3.宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院 五糧液技術(shù)與食品工程學(xué)院， 四川 宜賓 644003；4.普洱市茶葉科學(xué)研究所， 云南 普洱 665000)

云南普洱茶是國家地理標志保護產(chǎn)品，具有抗高脂血癥、抗氧化等多種保健功能[1-3]，深受消費者喜愛。2020年總產(chǎn)量約15.60萬t，其公用品牌價值70.35億元[4]。普洱茶生產(chǎn)過程主要依靠環(huán)境中的微生物發(fā)酵茶葉[5-6]，適宜在其中生長繁殖的微生物會產(chǎn)生多種酶類，而這些酶類有助于普洱茶形成獨特的品質(zhì)[7]。就目前實際情況看，傳統(tǒng)普洱茶生產(chǎn)處于開放的環(huán)境中，往往存在微生物來源復(fù)雜、不可控等問題，從而導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定[8]，因此，亟須對傳統(tǒng)普洱茶發(fā)酵工藝進行改進。

強化發(fā)酵是將一種或多種外源微生物接入到未經(jīng)滅菌的原料中進行發(fā)酵，以期提高發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)[9]。例如乳酸菌和酵母菌強化發(fā)酵四川泡菜可以明顯提高總酸、總酯含量，從而改善產(chǎn)品風(fēng)味[10]；接種酵母菌強化發(fā)酵醬油，可增加風(fēng)味物質(zhì)數(shù)量，改善感官品質(zhì)[11]。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)接菌強化發(fā)酵可縮短普洱茶加工時間，降低成本，提高茶葉感官品質(zhì)[12]，但對茶葉微生物群落和最終產(chǎn)品化學(xué)成分及感官特性的影響卻鮮有研究。

地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)是一種能產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、纖維素酶以及地衣素等令人愉悅的風(fēng)味物質(zhì)的細菌，在傳統(tǒng)發(fā)酵食品，如郫縣豆瓣[13]、醬香型白酒[14]、普洱茶[15-16]的生產(chǎn)過程中均起到積極作用[17]。王鵬[18]利用地衣芽孢桿菌強化發(fā)酵濃香型白酒顯著提高了其感官品質(zhì)。本團隊前期研究[6]發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌是普洱茶發(fā)酵過程中的優(yōu)勢細菌，在普洱茶品質(zhì)形成過程中有可能具有重要作用，有望用于普洱茶的強化發(fā)酵。作為一種在普洱茶發(fā)酵中存在的微生物，地衣芽孢桿菌進行的普洱茶強化發(fā)酵是否能夠影響發(fā)酵過程中的微生物群落，進而改善普洱茶的品質(zhì)特征，需要進一步研究。本研究將從普洱茶中分離鑒定得到的地衣芽孢桿菌接種于滅菌或未滅菌的曬青茶(RM)中，進行純菌發(fā)酵(pure fermentation，PF)和強化發(fā)酵(enhanced fermentation，EF)普洱茶，分析發(fā)酵樣品的感官特征、化學(xué)成分及微生物群落結(jié)構(gòu)，以期評估該菌用于普洱茶強化接菌發(fā)酵的可行性，為提高普洱茶品質(zhì)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

曬青茶(一芽三葉)，云南省普洱市茶葉科學(xué)研究所；兒茶素[(+)-catechin，C]、沒食子酸(gallic acid，GA)、表兒茶素[(-)-epicatechin，EC]、表沒食子兒茶素[(-)-epigallocatechin，EGC]、表兒茶素沒食子酸酯[(-)-epicatechin-3-gallate，ECG]、表沒食子兒茶素沒食子酸酯[(-)-epigallocatechin-3-gallate，EGCG]、沒食子兒茶素[(-)-gallocatechin，GC]、兒茶素沒食子酸酯[(-)-catechin gallate，CG]、沒食子兒茶素沒食子酸酯[(-)-gallocatechin gallate，GCG]、鞣花酸(ellagic acid，EA)、咖啡堿(caffeine，CA)、楊梅素(myricetin，MY)、槲皮素(quercetin，QU)、木犀草素(luteolin，LU)、山柰酚(kaempferol，KA)等物質(zhì)的標準品(純度均大于98.00%)，成都曼思特生物科技有限公司；真菌DNA提取試劑盒、細菌DNA提取試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；DNA聚合酶(2×Rapid Taq Master Mix)，南京諾唯贊生物科技公司；DNA分子量標準試劑、DNA染料，上海捷瑞生物工程公司。實驗所用試劑均為國產(chǎn)分析純。所有DNA引物由北京擎科生物科技有限公司昆明分公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

HH- S28S型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州市金壇大地自動化儀器廠；756CRT型紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；CP214型電子分析天平，上海奧豪斯儀器有限公司；CT15RE型離心機，日本日立公司；SW- CJ- 1B型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LRHS- 250- Ⅱ型生化培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；1200型高速液相色譜[配有TSKgel ODS- 80TM色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)]，美國安捷倫公司；Trident 960型基因擴增儀，上海力新儀器有限公司；DW- 86L626型醫(yī)用低溫保存箱，青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司；YS6060型色差儀，深圳市三恩時科技有限公司；血球計數(shù)板，上海求精生化試劑儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1地衣芽孢桿菌L1的分離鑒定

對從普洱茶中分離純化得到的菌株進行形態(tài)學(xué)觀察及16S rRNA基因序列測序分析[19]，并利用16S rRNA基因序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，明確菌株的系統(tǒng)分類學(xué)地位，命名為地衣芽孢桿菌L1。

1.3.2地衣芽孢桿菌L1菌懸液的制備

將分離鑒定得到的地衣芽孢桿菌L1接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)48 h。計數(shù)后用適量無菌生理鹽水稀釋成1×107個/mL的細胞菌懸液，將1%細胞菌懸液接種到茶葉培養(yǎng)基中，37 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)4 d。茶葉培養(yǎng)基是用2 L蒸餾水在100 ℃條件下提取100 g曬青茶30 min，4層紗布過濾后，121 ℃滅菌20 min制成。

1.3.3地衣芽孢桿菌L1純菌發(fā)酵普洱茶實驗

稱取100 g曬青茶置于500 mL三角瓶中，加入40 mL蒸餾水，濕熱滅菌(121 ℃，20 min)，冷卻后待用。將1 mL地衣芽孢桿菌L1的菌懸液(含1×107個細胞)接種于滅菌茶樣中，37 ℃、相對濕度60%的培養(yǎng)箱中發(fā)酵20 d，為PF組。將PF組樣品分為2份，一份用于感官審評，另一份-80 ℃貯藏用于化學(xué)成分測定及微生物分析。將滅菌茶樣不接菌進行相同操作為對照組(CK)。每組樣品進行3次重復(fù)實驗。

1.3.4地衣芽孢桿菌L1強化發(fā)酵普洱茶實驗

稱取曬青茶25 kg裝入發(fā)酵筐，加入10 L蒸餾水和250 mL地衣芽孢桿菌L1的菌懸液(含1×107個細胞)攪拌混勻后，進行發(fā)酵。每隔5 d翻堆一次，25 d后發(fā)酵完成。在每次翻堆前，采用五點取樣法取樣，分別命名為EF1～EF5。每次取樣后將樣品分為2份，一份用于感官審評，另一份-80 ℃貯藏用于化學(xué)成分測定及微生物分析。將每一翻自然發(fā)酵(normal fermentation，NF)的樣品(未接入地衣芽孢桿菌L1)命名為NF1～NF5，取樣方法和強化發(fā)酵一致。每組樣品進行3次重復(fù)實驗。

1.3.5茶葉化學(xué)成分測定及感官審評

參考Zhao等[5]分析茶葉特征成分的方法，分別采用恒重法、酒石酸亞鐵法、茚三酮比色法、蒽酮法測定茶葉樣品水浸出物(water extracts，WE)、茶多酚(tea polyphenols，TP)、游離氨基酸(free amino acids，F(xiàn)AA)、可溶性糖(soluble sugars，SS)的質(zhì)量分數(shù)；應(yīng)用萃取比色法[20]檢測茶紅素(thearubigins，TR)、茶黃素(theaflavins，TF)及茶褐素(theabrownins，TB)質(zhì)量分數(shù)；采用本課題組建立的高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)[6]定量分析茶葉樣品中GA、CA、EA、QU、LU、KA、MY、C、EC、EGC、ECG、EGCG、GC、GCG和CG的質(zhì)量比。9位評茶員根據(jù)GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》[21]對茶葉樣品的感官品質(zhì)進行審評；其中，采用定量描述分析法[22]對茶湯滋味特征進行評價，包括苦味、澀味、酸味、甜味和厚重感5個屬性，分數(shù)從0(無)到9(非常強烈)。同時用YS6060型色差儀對茶湯的顏色進行測定，a*值為紅綠色，b*值為黃藍色，L*值為明暗度。

1.3.6基于高通量測序的微生物多樣性分析

采用細菌DNA提取試劑盒、真菌DNA提取試劑盒分別提取接種發(fā)酵普洱茶樣品的細菌和真菌DNA，應(yīng)用DNA聚合酶(2×Rapid Taq Master Mix)進行聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)。其中，利用引物338F和806R擴增細菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)；以引物ITS1和ITS4擴增真菌ITS1區(qū)域。委托深圳微生態(tài)公司，應(yīng)用Illumina MiSeq測序平臺對PCR產(chǎn)物進行基因測序[15]。通過QIIME軟件檢查并剔除嵌合體序列等疑問序列，選擇序列比對工具對獲得的序列按97%的相似度進行聚類和OTU劃分，繪制稀疏曲線，計算α多樣性指數(shù)，評估每個樣本的多樣性水平[23]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用IBM SPSS Statistics 22.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，數(shù)值以平均值±標準差表示，統(tǒng)計分析采用LSD方差分析方法，顯著性用P<0.05表示；采用TBtools 1.09854對歸一化后的數(shù)據(jù)進行聚類熱圖的繪制；采用微科盟生科云在線工具(https://www.bioincloud.tech/#/)進行主成分分析(principal component analysis，PCA)和線性判別分析(linear discriminant analysis effect size，LEfSe)；基因測序結(jié)果已上傳至National Center for Biotechnology Information (NCBI)基因數(shù)據(jù)庫，編號為MZ675664和PRJNA691718。

2 結(jié)果與分析

2.1 地衣芽孢桿菌L1的分離鑒定結(jié)果

將菌株接種到PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后，菌落形態(tài)如圖1。菌株菌落呈乳白色凸起，顯微形態(tài)為長桿狀菌體。將菌株測序所得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對，選擇模式物種進行建樹分析，見圖2。結(jié)果表明，菌株與006270.3B.licheniformis聚為一支，證明為地衣芽孢桿菌L1(B.licheniformisL1)。

圖1 地衣芽孢桿菌L1的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of B. licheniformis L1

圖2 地衣芽孢桿菌L1 DNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic trees of DNA sequences of B. licheniformis L1

2.2 地衣芽孢桿菌L1純菌發(fā)酵對茶葉品質(zhì)的影響

地衣芽孢桿菌L1純菌發(fā)酵普洱茶樣品與對照(CK)樣品進行感官審評，PF組的茶湯呈橙紅色，滋味較為醇厚；CK組的茶湯為黃綠色，澀味較為突出。表明地衣芽孢桿菌L1純菌發(fā)酵能改普洱茶感官特征，并與傳統(tǒng)普洱茶的感官品質(zhì)(茶湯呈紅褐色，滋味醇厚回甘)相似[24]。采用高效液相色譜法和分光光度法測定了22種茶葉特征成分的含量，見圖3。與CK組相比，PF組中TP質(zhì)量分數(shù)和5種兒茶素(C、GCG、EGCG、ECG、CG)質(zhì)量比顯著降低(P<0.05)，驗證了PF組茶湯苦澀度降低感官評審結(jié)果；聚類分析結(jié)果也顯示TP、EGCG、GCG、CG和ECG聚為一簇，其他17種茶葉特征成分聚為另一簇(圖3)。因TB質(zhì)量分數(shù)顯著增加(P<0.05)，使得PF組茶湯由黃綠色變?yōu)槌燃t色。這些茶葉特征成分的變化也與傳統(tǒng)普洱茶發(fā)酵過程中物質(zhì)的變化相似[25]，故地衣芽孢桿菌L1對普洱茶的發(fā)酵起到積極作用。由于傳統(tǒng)普洱茶發(fā)酵的原料曬青茶未經(jīng)滅菌處理，并且是在開放式的環(huán)境中進行，因此需要對接種地衣芽孢桿菌的普洱茶強化發(fā)酵做進一步研究。

不同小寫字母表示同行數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖3 純菌發(fā)酵樣品中茶葉特征成分聚類分析Fig.3 Cluster analysis of tea characteristic components in samples of pure fermentation

2.3 地衣芽孢桿菌L1強化發(fā)酵對茶葉品質(zhì)的影響

對自然發(fā)酵及強化發(fā)酵樣品進行感官審評，結(jié)果見表1和圖4。經(jīng)NF和EF處理后，茶湯均呈紅褐色、滋味回甘、香氣純正，但EF組茶湯顏色更深，滋味更加醇厚，香氣帶有怡人的陳香。色差儀測定2組茶湯顏色結(jié)果見圖5。由圖5知，EF組的a*值(25.70±0.68)和b*值(77.06±1.07)較高，而L*值(71.58±0.83)較低。9位評茶員審評茶湯的滋味評分見圖6。由圖6可知，EF組的甜味(3.33±0.78)和厚重感(6.11±0.71)分值較高，而苦味(1.33±0.50)、澀味(0.67±0.50)和酸味(0.33±0.44)分值較低，進一步說明了EF組樣品具有更深的紅褐色和更愉悅的滋味。

NF組和EF組茶葉特征成分差異見圖7。由圖7可知，EF組中TB、TR和SS質(zhì)量分數(shù)顯著高于NF組(P<0.05)，與感官審評EF組具有更深的紅褐色和更顯著的甜味的結(jié)果相符；聚類分析結(jié)果也顯示TB、TR和SS聚為一類。而EF組的C、CG、EC、GCG、EGCG和EGC質(zhì)量比顯著低于NF組(P<0.05)，驗證了EF組的苦澀度較NF組更低。因此，地衣芽孢桿菌L1強化發(fā)酵可提高普洱茶的感官品質(zhì)。

表1 自然發(fā)酵與強化發(fā)酵樣品的感官審評結(jié)果Tab.1 Sensory evaluation results of samples of normal and enhanced fermentation

此外，NF組和EF組中GA的質(zhì)量比相對于CK組顯著降低(P<0.05)，與吳楨[26]、Zhao等[6]發(fā)現(xiàn)GA的含量在發(fā)酵結(jié)束后升高的結(jié)果不符，推測可能與原料和發(fā)酵工藝有關(guān)。折改梅等[27]的研究顯示嫩芽曬青茶(多酚類物質(zhì)含量較低)生產(chǎn)的普洱茶GA含量在發(fā)酵結(jié)束后是降低的，表明原料可以影響GA含量。本團隊研究發(fā)現(xiàn)同一家企業(yè)的兩款普洱茶，其GA含量相差約4倍[28]；另外，本團隊前期研究揭示了單寧酶對于茶葉酯型兒茶素的代謝作用，發(fā)現(xiàn)GA可被進一步氧化為鞣花酸或被降解，其含量與工藝控制相關(guān)[29]。

圖4 自然發(fā)酵與強化發(fā)酵后干茶、茶湯、葉底變化Fig.4 Changes of tea leaves, infusion and infused tea leaves after normal and enhanced fermentation

圖5 自然發(fā)酵與強化發(fā)酵樣品茶湯的色差值Fig.5 Color difference values of samples infusion of normal and enhanced fermentation

圖6 自然發(fā)酵與強化發(fā)酵樣品的滋味評分Fig.6 Taste scores of samples of normal and enhanced fermentation

不同小寫字母表示同行數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖7 自然發(fā)酵與強化發(fā)酵樣品中茶葉特征成分的聚類分析Fig.7 Cluster analysis of tea characteristic components in samples of normal and enhanced fermentation

2.4 地衣芽孢桿菌L1強化發(fā)酵對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

經(jīng)過QIIME軟件檢查并剔除嵌合體序列等疑問序列后，得到54 330～103 310個序列，歸類為482～1 603個細菌OTUs、503～833個真菌OTUs，結(jié)果如表2。由表2可知，隨著發(fā)酵的進行，EF組中細菌及真菌的豐富度和多樣性先顯著增加(P<0.05)，在發(fā)酵中后期(EF3～EF5)又顯著下降(P<0.05)，與NF組微生物的豐富度和多樣性在發(fā)酵中后期(NF3～NF5)繼續(xù)上升形成差異。EF組和NF組的細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)分析見圖8和圖9。由圖8(a)和圖9(a)可知，在發(fā)酵過程中EF組和NF組的微生物群落結(jié)構(gòu)動態(tài)變化，且在各個階段均存在差異，尤其在發(fā)酵中后期差異顯著。主要原因是發(fā)酵過程中化學(xué)成分與環(huán)境條件(溫度、濕度、pH值)的不斷變化，以及微生物之間的相互作用(如共生和拮抗作用)[30]。

茶葉樣品中細菌屬水平群落結(jié)構(gòu)如圖8(b)，原料曬青茶(RM)的優(yōu)勢細菌主要是腸桿菌(Enterococcus, 20.94%)、金黃桿菌(Chryseobacterium, 16.65%)和假單胞菌(Pseudomonas, 6.90%)。在強化發(fā)酵過程中，芽孢桿菌(Bacillus, 25.08%～39.81%)和假單胞菌(17.20%～32.36%)是發(fā)酵中前期(EF1、EF2)的優(yōu)勢細菌，隨著發(fā)酵的繼續(xù)進行，短狀桿菌(Brachybacterium, 14.02%～29.28%)、考克氏菌(Kocuria, 9.52%～26.57%)和葡萄球菌(Staphylococcus, 11.49%～56.59%)共同成為發(fā)酵中后期(EF3～EF5)的優(yōu)勢細菌。主要原因是整個發(fā)酵過程處于開放狀態(tài)，環(huán)境中的微生物也會進入發(fā)酵系統(tǒng)。因此，一些適合在茶葉上生長的微生物會在這種發(fā)酵體系中生長并大量繁殖。在傳統(tǒng)自然發(fā)酵過程中，發(fā)酵前期(NF1)的優(yōu)勢細菌主要是埃希氏菌(Escherichia, 32.41%)、克雷白氏菌(Klebsiella, 27.41%)和假單胞菌(24.54%)；芽孢桿菌(37.07%)在發(fā)酵中期(NF3)成為優(yōu)勢細菌；而在發(fā)酵后期(NF5)，埃希氏菌(16.46%)再次成為優(yōu)勢細菌。

茶葉樣品中真菌種水平群落結(jié)構(gòu)如圖9(b)，在RM中優(yōu)勢真菌為Brunneoclavisporabambusae(41.50%)、黑曲霉(Aspergillusniger, 21.18%)和馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus, 17.27%)。在強化發(fā)酵樣品中，微小根毛霉(Rhizomucorpusillus, 64.50%)是發(fā)酵初期(EF1)的優(yōu)勢真菌，隨著發(fā)酵進行，食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母(Blastobotrysadeninivorans, 12.95%～57.95%)迅速生長繁殖，在發(fā)酵中后期(EF3～EF5)與微小根毛霉(12.88%～24.70%)共同成為優(yōu)勢真菌；另外黑曲霉(17.92%～32.73%)在整個發(fā)酵階段均為優(yōu)勢真菌。作為對比，在傳統(tǒng)自然發(fā)酵過程中黑曲霉始終是優(yōu)勢真菌(26.64%～37.40%)；此外，在發(fā)酵初期(NF1)的優(yōu)勢真菌還包括馬克斯克魯維酵母(31.28%)，隨著發(fā)酵的進行，微小根毛霉(37.48%～61.22%)迅速繁殖，與黑曲霉共同組成發(fā)酵中后期(NF2～NF5)的優(yōu)勢真菌。

茶葉樣品微生物群落結(jié)構(gòu)線性判別分析見圖10。根據(jù)LEfSe分析結(jié)果，普洱茶通過發(fā)酵降低了原料中金黃桿菌(Chryseobacterium)、土地桿菌(Pedobacter)、Aureimonase、甲基桿菌(Methylobacterium)、根瘤菌(Rhizobium)、鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)、腸桿菌、假檸檬酸桿菌(Pseudocitrobacter)、假單胞菌、克魯維酵母、Chytridiumolla、Phlyctochytriumaureliae和Gromochytriummamkaevae的相對豐度。盡管在強化發(fā)酵的中后期(EF3～EF5)，地衣芽孢桿菌L1(0.2%～0.5%)不再是優(yōu)勢細菌，但相對于NF組，茶葉中其他微生物的相對豐度顯著變化，短桿菌(Brevibacterium)、食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母和Rogersellagriseliniae的相對豐度顯著增加(P<0.05)，無色桿菌(Achromobacter)、伯克氏菌(Burkholderia)、檸檬酸桿菌(Citrobacter)、歐文氏菌足桿菌(Erwinia)、埃希氏菌、克雷白氏菌和微小根毛霉的相對豐度顯著降低(P<0.05)。微生物相對豐度的變化解釋了強化發(fā)酵樣品的茶葉特征成分和感官特征變化的原因。

3 結(jié) 論

將地衣芽孢桿菌L1接種于滅菌或未滅菌的曬青茶中，分別進行純菌發(fā)酵與強化發(fā)酵。純菌發(fā)酵后茶葉中茶多酚質(zhì)量分數(shù)和5種兒茶素(C、GCG、EGCG、ECG、CG)質(zhì)量比顯著降低(P<0.05)，茶褐素質(zhì)量分數(shù)顯著增加(P<0.05)。強化發(fā)酵后茶褐素、茶紅素和可溶性糖質(zhì)量分數(shù)顯著高于傳統(tǒng)自然發(fā)酵(P<0.05)，而C、CG、EC、GCG、EGCG和EGC質(zhì)量比顯著降低(P<0.05)；茶湯的感官特征隨之發(fā)生變化，a*值、b*值及甜味和厚重感的感官評分增加，L*值及苦味、澀味和酸味感官評分降低。雖然地衣芽孢桿菌L1在強化發(fā)酵中后期不再是優(yōu)勢細菌，但其促使了其他幾種主要微生物相對豐度的顯著變化(P<0.05)，如增加了短桿菌、食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母和Rogersellagriseliniae的相對豐度，降低了無色桿菌、伯克氏菌、檸檬酸桿菌、歐文氏菌足桿菌、埃希氏菌、克雷白氏菌和微小根毛霉的相對豐度。因此，接種地衣芽孢桿菌L1進行的強化發(fā)酵可通過與其他微生物的協(xié)同作用改變普洱茶茶葉的特征成分，從而提高普洱茶的感官品質(zhì)。

表2 發(fā)酵茶葉樣品微生物群落的豐富度與α多樣性指數(shù)Tab.2 Richness and α diversity indexes of microbial communities in fermented tea samples

C：芽孢桿菌(Bacillus)，D：短狀桿菌(Brachybacterium)，E：短桿菌(Brevibacterium)，F(xiàn)：伯克氏菌(Burkholderia)，G：金黃桿菌(Chryseobacterium)，H：腸桿菌(Enterobacter)，I：腸球菌(Enterococcus)，J：歐文氏菌(Erwinia)，K：埃希氏菌(Escherichia)，L：克雷白氏菌(Klebsiella)，M：考克氏菌(Kocuria)，N：甲基桿菌(Methylobacterium)，O：微桿菌(Microbacterium)，P：蒼白桿菌(Ochrobactrum)，Q：擬桿菌(Paenibacillus)，R：假單胞菌(Pseudomonas)，S：羅爾斯頓菌(Ralstonia)，T：鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium)，U：葡萄球菌(Staphylococcus)，V：結(jié)核桿菌(Tuberibacillus)，W：Xylella，X：其他細菌。圖8 茶葉樣品中細菌群落結(jié)構(gòu)分析Fig.8 Structure analysis of bacterial communities in tea samples

C：微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)，D：食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母(Blastobotrys adeninivorans)，E：黑曲霉(Aspergillus niger)，F(xiàn)：Brunneoclavispora bambusae，G：馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)，H：煙曲霉(Aspergillus fumigatus)，I：Paraphysoderma sedebokerense，J：疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus)，K：Cyberlindnera sp. RODW5，L：Rogersella griseliniae，M：布蘭克假絲酵母(Candida blankii)，N：Endogone corticioides，O：Monoblepharis hypogyna，P：Gonapodya polymorpha，Q：阿曲霉(Aspergillus amstelodami)，R：其他真菌。圖9 茶葉樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)分析Fig.9 Structure analysis of fungal communities in tea samples

a：短桿菌，b：金黃桿菌，c：土地桿菌(Pedobacter)，d：Aureimonase，e：甲基桿菌，f：根瘤菌(Rhizobium)，g：鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)，h：無色桿菌(Achromobacter)，i：伯克氏菌，j：檸檬酸桿菌(Burkholderia)，k：腸桿菌，l：歐文氏菌足桿菌(Enterobacter)，m：埃希氏菌，n：克雷白氏菌，o：假檸檬酸桿菌(Pseudocitrobacter)，p：假單胞菌；q：克魯維酵母，r：食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母，s：Rogersella griseliniae，t：Chytridium olla，u：Phlyctochytrium aureliae，v：Gromochytrium mamkaevae，w：微小根毛霉。圖10 茶葉樣品中細菌與真菌群落的線性判別分析Fig.10 Linear discriminant analysis of bacterial and fungal communities in tea samples