超高效液相色譜指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)優(yōu)選掌葉大黃飲片炮制工藝

張正，施文婷，莫秋怡，曹嵌，鄧桂海，田清清，梁志毅

（廣東一方制藥有限公司，廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東佛山 528244）

大黃為蓼科大黃屬植物，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，至今已有1 000 多年的藥用歷史［1］。2020 年版《中國藥典》以掌葉大黃﹑藥用大黃﹑唐古特大黃的干燥根及根莖入藥［2］。大黃味苦性寒，歸脾﹑胃﹑大肝﹑心包經(jīng)，有瀉下攻積，清熱瀉火，涼血解毒，逐淤通經(jīng)，利濕退黃的功效［3］。大黃中含有豐富的蒽醌類﹑蒽酮類﹑鞣質(zhì)類﹑有機酸類﹑揮發(fā)油和多糖類成分［4–5］，其中以蒽醌類成分研究最為廣泛，游離型蒽醌主要有大黃酸﹑大黃素﹑大黃酚﹑蘆薈大黃素﹑大黃素甲醚等，結(jié)合型蒽醌衍生物為游離蒽醌類的葡萄糖苷或雙蒽酮苷，雙蒽酮苷類包括番瀉苷A﹑B﹑C﹑D﹑E﹑F 等［6］。現(xiàn)代藥理研究表明，大黃具有調(diào)節(jié)胃腸道功能﹑保護心腦血管﹑保肝利膽﹑免疫調(diào)節(jié)﹑抗炎﹑抗病毒﹑抗腫瘤等作用［7–8］。

2020 年版《中國藥典》一部大黃飲片項下炮制方法為“除去雜質(zhì)，洗凈，潤透，切厚片或塊，晾干”［2］，缺乏具體的工藝參數(shù)，不利于大黃飲片的質(zhì)量控制。關(guān)于掌葉大黃飲片炮制工藝的研究多以2020 年版《中國藥典》一部大黃項下的質(zhì)量控制指標為評價標準，較為單一，鮮見指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)研究掌葉大黃飲片炮制工藝的報道［9］。筆者通過建立UPLC（高效液相色譜）指紋圖譜并結(jié)合相似度評價﹑聚類分析﹑主成分分析和方差分析，對不同潤制時間﹑干燥方式﹑烘干溫度及時間的掌葉大黃飲片進行質(zhì)量評價，以期為掌葉大黃飲片具體炮制工藝參數(shù)的確定和質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜儀：Waters Arc 型，美國Waters公司。

電子天平：（1）XP26 型，感量為0.001 mg；（2）ME204E 型，感量為0.1 mg，瑞士METTLER TOLEDO 公司。

超純水系統(tǒng)：Milli–Q Direct 型，德國Merck 公司。

高速中藥粉碎機：111B 型，浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司。

數(shù)控超聲波清洗器：KQ–500DE 型，昆山市超聲儀器有限公司。

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DHG–9146A 型，上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

沒食子酸［批號：110831–201605，純度（質(zhì)量分數(shù)）為90.8%］﹑兒茶素［批號：110877–201604，純度（質(zhì)量分數(shù)）為99.2%］﹑番瀉苷A［批號：110824–201702，純度（質(zhì)量分數(shù)）為95.2%］﹑番瀉苷B［批號：110825–201603，純度（質(zhì)量分數(shù)）為95%］﹑蘆薈大黃素［批號：110795–201710，純度（質(zhì)量分數(shù)）為98.3%］﹑大黃酸［批號：110757–201607，純度（質(zhì)量分數(shù)）為99.3%］﹑大黃素［批號：110756–201913，純度（質(zhì)量分數(shù)）為96%］﹑大黃酚［批號：110796–201922，純度（質(zhì)量分數(shù)）為99.4%］﹑大黃素甲醚［批號：110758–201817，純度（質(zhì)量分數(shù)）為99.2%］對照品：中國食品藥品檢定研究院。

大黃酚-8-O- 葡萄糖苷對照品：批號為CFS201801，純度（質(zhì)量分數(shù)）98%，武漢天植生物技術(shù)有限公司。

大黃素8-O-β-D-葡萄糖苷對照品：批號為18080601，純度（質(zhì)量分數(shù)）98%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司。

甲醇：色譜純，德國Merck 公司。

磷酸：色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

實驗所用其余試劑均為分析純。

實驗用水為超純水。

大黃藥材：批號為YG1906003，產(chǎn)地為甘肅，經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為蓼科植物掌葉大黃的干燥根和根莖。

1.2 色譜條件

色譜柱：Waters CORTECS T3 色譜柱（150 mm×2.1mm，1.6μm，美國Waters 公司）；流動相：乙腈（A）–0.1%磷酸溶液（B）；梯度洗脫程序：0～5 min，3%～21%A；5～20min，21%～40%A；20～27 min，40%～50%A；27～40min，50%～58%A；40～50 min，58%～95%A；50～53min，95%～3%A；流量：0.25mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：260nm；進樣體積：1 μL［10–11］。

1.3 溶液配制

（1）混合對照品溶液的制備。精密稱取沒食子酸﹑兒茶素﹑番瀉苷A﹑番瀉苷B﹑大黃酚-8-O-葡萄糖苷﹑大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷﹑蘆薈大黃素﹑大黃酸﹑大黃素﹑大黃酚﹑大黃素甲醚對照品適量，加入甲醇，配制成質(zhì)量濃度均分別為6.603﹑5.321﹑8.950﹑

7.602﹑7.969﹑12.654﹑12.162﹑12.595﹑15.297﹑9.235﹑13.132 μg/mL 的混合對照品溶液。

（2）供試品溶液的制備。取掌葉大黃飲片粉末（過四號篩）約0.2g，精密稱定，置于25mL 具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10mL，超聲處理（功率300 W，頻率50 kHz）30min，取出，放冷，補重，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 專屬性試驗

分別精密吸取空白溶劑﹑混合對照品溶液及供試品溶液，按1.2 項下色譜條件進樣測定，色譜圖如圖1 所示，供試品溶液色譜在與對照品溶液色譜相應(yīng)的保留時間處有相同的色譜峰，且空白溶劑無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 專屬性試驗UPLC 色譜圖

2.2 精密度試驗

精密吸取按1.3 中混合對照品溶液，在1.2 色譜條件下連續(xù)進樣6 次，以圖1 中7 號色譜峰蘆薈大黃素為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積RSD 均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.3 重復(fù)性試驗

取同一批供試品粉末，平行稱定6 份，按1.3 中方法制備供試品溶液，在1.2 色譜條件下進樣測定，以7 號色譜峰蘆薈大黃素為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間和相對色譜峰面積的相對標準偏差，結(jié)果均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗

精密吸取1.3 中供試品溶液，按1.2 色譜條件分別在第0﹑2﹑4﹑6﹑8﹑12﹑24h 進樣測定，以7 號峰蘆薈大黃素為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積的相對標準偏差，結(jié)果均小于3.0%，表明供試品溶液在24h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 潤制時間考察

2.5.1 指紋圖譜的建立

取同一批掌葉大黃藥材進行潤制，分別于潤制0﹑2﹑4﹑8﹑12﹑24﹑36﹑48h 取樣（編號為S0～S7），切厚片，低溫干燥，見表1。按1.3 方法制備供試品溶液，在1.2 色譜條件下進樣測定。樣品數(shù)據(jù)依次采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012）進行評價。

表1 掌葉大黃飲片不同潤制時間考察

2.5.2 特征峰比較

計算不同潤制時間掌葉大黃飲片UPLC 指紋圖譜各共有峰的色譜峰面積–取樣量比值（mV·s·mg–1），結(jié)果見表2。

表2 不同潤制時間掌葉大黃飲片的峰面積–取樣量比值

由表2 可知，隨著潤制時間的延長，結(jié)合型蒽醌水解轉(zhuǎn)變成游離蒽醌，導(dǎo)致蘆薈大黃素﹑大黃酸﹑大黃素﹑大黃酚﹑大黃素甲醚的提取率呈上升趨勢；掌葉大黃飲片中兒茶素﹑番瀉苷A﹑番瀉苷B﹑大黃酚-8-O-葡萄糖苷﹑大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷的提取率均呈下降趨勢。表明潤制時間對掌葉大黃飲片各指標成分的影響顯著。

2.5.3 相似度評價

計算樣品S1～S7 的指紋圖譜與掌葉大黃藥材（S0）指紋圖譜的相似度，結(jié)果見表3。由表3 可知，潤制2h 以內(nèi)的掌葉大黃飲片與其藥材的相似度大于0.95，而潤制4h 以上掌葉大黃飲片與其藥材的相似度均小于0.90。表明隨著潤制時間的延長，掌葉大黃飲片各指標成分的含量較藥材的差異逐漸變大。

表3 不同潤制時間考察掌葉大黃飲片指紋圖譜相似度結(jié)果

2.5.4 聚類分析

采用SPSS 20.0 軟件對各特征峰的峰面積–取樣量比值進行聚類分析，建立不同潤制時間掌葉大黃飲片的聚類分析樹狀圖，結(jié)果如圖2 所示。通過分析可將不同潤制時間的掌葉大黃飲片聚為2 類，潤制2﹑4﹑8﹑12h 與掌葉大黃藥材聚為I 類，潤制24﹑36﹑48h 聚為II 類。表明潤制時間對掌葉大黃飲片指標成分含量的影響較顯著。

圖2 不同潤制時間時掌葉大黃飲片聚類分析（CA）樹狀圖

2.5.5 主成分分析

采用SPSS 20.0 軟件對掌葉大黃飲片11 個共有峰的峰面積–取樣量比值進行因子分析，結(jié)果見表4﹑表5，成分因子分析圖見圖3。根據(jù)主成分的提取原則，取特征值大于1 對應(yīng)的成分作為提取主成分［12］，因子載荷值反映大黃各指標成分對主成分載荷的相對大小和影響的方向，數(shù)值反映原變量對因子影響的大小，正負代表方向的差別［13］。

表4 主成分分析結(jié)果

表5 主成分因子載荷矩陣

圖3 主成分因子分析圖

由表4﹑表5 及圖3 可知，前兩個主成分累積貢獻率為94.915%，表明提取的2 個主成分基本能反映全部指標信息。主成分1 的特征值為8.917，方差貢獻率為81.060%，兒茶素﹑番瀉苷B﹑番瀉苷A﹑大黃酚-8-O-葡萄糖苷﹑大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷為負相關(guān)，蘆薈大黃素﹑大黃酸﹑大黃素﹑大黃酚和大黃素甲醚的載荷較高且均為正相關(guān)，表明其主要反映主成分1 的信息；主成分2 的特征值為1.524，方差貢獻率為13.855%，沒食子酸載荷較高且呈正相關(guān)，表明其主要反映主成分2 的信息。上述對掌葉大黃飲片指紋圖譜差異貢獻較大的成分，可能是掌葉大黃飲片炮制過程中含量變化的關(guān)鍵成分。

2.5.6 綜合評分

綜合評分由公式Fi=a1X1+a2X2+…….+ajXm（a為特征值，由成分矩陣中的第j列載荷除以對應(yīng)成分特征值的算術(shù)平方根所得，X為原始指標）計算［13–14］，計算得到F1﹑F2兩個主成分的表達式。將原始指標進行標準化處理，從而得到綜合評分函數(shù)（F=0.810 60F1+0.138 55F2，其中F1和F2為2 個主成分的得分，系數(shù)為各成分的方差貢獻率），即綜合評分，結(jié)果見表6。由表6 可知，當掌葉大黃飲片潤制36h 后，其綜合評分最高，表明掌葉大黃飲片的最佳潤制時間為36h。

表6 不同潤制時間考察掌葉大黃飲片綜合評分結(jié)果

2.6 干燥方式考察

2.6.1 指紋圖譜的建立

取同一批掌葉大黃藥材潤制36h 后，切厚片，分成三份，分別采用晾干﹑曬干﹑烘干（60 ℃）三種干燥方式進行干燥（編號分別為S8～S10），按1.3 方法制備供試品溶液，在1.2 色譜條件下進樣測定。不同干燥方式的掌葉大黃飲片的樣品數(shù)據(jù)依次采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012）進行評價。

2.6.2 相似度評價

計算樣品S8–S10 的指紋圖譜與掌葉大黃飲片潤制36h（S6）指紋圖譜的相似度，結(jié)果見表7。由表7 可見，各樣品相似度均大于0.95。

表7 不同干燥方式的掌葉大黃飲片指紋圖譜相似度結(jié)果

2.6.3t檢驗分析

3 份掌葉大黃飲片各特征峰的峰面積–取樣量比值結(jié)果見表8，采用SPSS 20.0 軟件對其進行獨立樣本–t檢驗分析。結(jié)果表明，不同干燥方式對掌葉大黃飲片的各成分含量無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)合生產(chǎn)實際考慮，確定掌葉大黃飲片的最佳干燥方式為烘干。

表8 不同干燥方式的掌葉大黃飲片色譜峰結(jié)果（n=2）

2.7 不同烘干溫度和烘干時間考察

2.7.1 指紋圖譜的建立

取同一批掌葉大黃藥材潤制36h 后，分別置于40﹑55﹑70 ℃鼓風(fēng)烘箱內(nèi)烘干，于干燥4﹑8﹑12﹑24h時取樣（編號分別為S11～S22，見表9），按1.3 方法制備供試品溶液，按1.2 色譜條件進樣測定。不同烘干溫度和烘干時間的掌葉大黃飲片樣品數(shù)據(jù)依次采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012）進行評價。

表9 掌葉大黃飲片不同烘干溫度及時間考察

2.7.2 相似度評價

計算樣品S11～S22 的指紋圖譜與掌葉大黃飲片潤制36h（S6）指紋圖譜的相似度，結(jié)果見表10。由表10 可見，各樣品相似度均大于0.95。

表10 不同烘干溫度及時間的掌葉大黃飲片指紋圖譜相似度結(jié)果

2.7.3t檢驗分析

12 份掌葉大黃飲片各特征峰的峰面積–取樣量比值結(jié)果見表11，采用SPSS 20.0 軟件對其進行t檢驗分析。結(jié)果表明，不同干燥方式對掌葉大黃飲片的各成分含量無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)合各實驗組飲片的水分結(jié)果，為提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，確定掌葉大黃飲片烘干工藝參數(shù)為50～70 ℃干燥8～12h。

表11 不同烘干溫度及時間的掌葉大黃飲片色譜峰面積–取樣量比值（n=2）

2.8 掌葉大黃飲片炮制工藝驗證試驗

根據(jù)優(yōu)選的掌葉大黃飲片炮制工藝參數(shù)，稱取三份掌葉大黃藥材，每份約200g，進行三份平行驗證試驗，分別潤制36h 后，切厚片，于70 ℃下烘10 h，將測得的數(shù)據(jù)代入數(shù)據(jù)組中進行分析，結(jié)果見表12。三份驗證的各特征峰峰面積–取樣量比值的RSD 值均小于3%，其綜合評分分別為35.94﹑36.23﹑36.07，表明優(yōu)選的掌葉大黃飲片炮制工藝穩(wěn)定可行。

表12 驗證試驗結(jié)果（n=2）

3 結(jié)語

優(yōu)選的掌葉大黃飲片最佳炮制工藝：潤制36h，切厚片，50～70 ℃干燥8～12h。研究表明潤制時間對掌葉大黃飲片的各指標成分含量影響顯著，相關(guān)文獻表明，大黃中的游離型蒽醌類成分與其“清熱解毒”功效呈正相關(guān)［15–16］，結(jié)合型蒽醌類成分則與其“瀉下攻積”功效呈正相關(guān)［17–18］，故臨床應(yīng)用可根據(jù)證候結(jié)合藥理作用，調(diào)整掌葉大黃飲片炮制過程中的工藝參數(shù)，提高治療的針對性。此外，不同干燥方式﹑不同的烘干溫度及時間對掌葉大黃飲片各指標成分的含量影響并不明顯。2020 年版《中國藥典》中規(guī)定掌葉大黃飲片的干燥方式為“晾干”，但晾干耗時長，物料長時間暴露在空氣中，易發(fā)生氧化降解和霉變，而烘干不受外界因素影響，且能縮短干燥時間，降低勞動強度，提高生產(chǎn)效率，更適用于掌葉大黃飲片的工業(yè)生產(chǎn)［19］。

中藥有效成分在炮制過程中充分的保留是保證中藥臨床療效發(fā)揮的重要前提，影響掌葉大黃飲片炮制工藝的因素眾多，本研究參照2020 年版《中國藥典》一部﹑各種炮制規(guī)范及相關(guān)文獻，對掌葉大黃飲片的炮制工藝參數(shù)進行研究，優(yōu)選出科學(xué)﹑合理﹑穩(wěn)定﹑可行的掌葉大黃飲片炮制工藝參數(shù)，為工業(yè)化生產(chǎn)質(zhì)量一致的掌葉大黃飲片提供參考。同時也為唐古特大黃飲片和藥用大黃飲片的炮制工藝研究奠定了基礎(chǔ)。