氣相色譜–質(zhì)譜法分析不同方法提取杜香揮發(fā)油的化學(xué)成分

利健文，謝春生，韋壽蓮

（1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院中藥學(xué)院，廣州 510520； 2. 肇慶學(xué)院，廣東肇慶 526061）

杜香為被子植物杜鵑花科杜香屬常綠灌木，主要分布于大﹑小興安嶺和吉林長(zhǎng)白山，是中國(guó)傳統(tǒng)中藥材，也是重要的香料植物。杜香以其揮發(fā)油入藥，主治化痰，止咳，平喘，兼有降壓﹑殺菌止癢﹑抗氧化等作用。杜香揮發(fā)油的提取方法及其成分分析鑒定一直是杜香的研究熱點(diǎn)［1–4］，目前主要的提取方法有CO2超臨界流提取(SFE)［5–6］﹑有機(jī)溶劑浸提［7，8］﹑超聲波輔助乙醇提?。?］﹑水蒸氣蒸餾(SD)［10–12］﹑復(fù)合溶劑水熱法［13］等。傳統(tǒng)提取方法存在或提取工藝時(shí)間長(zhǎng)﹑效率低﹑耗能高﹑儀器復(fù)雜昂貴成本高等問題。

筆者分別采用微波輔助水蒸氣蒸餾法和水蒸汽蒸餾提取杜香揮發(fā)油，采用毛細(xì)管氣相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用方法分析鑒定了其化學(xué)成分，并比較了兩種方法所得揮發(fā)油化學(xué)成分及物性，找出了提取時(shí)間短﹑效率高﹑耗能少﹑成本低，更加綠色安全的更合理的微波輔助水蒸氣蒸餾法（MAE–SD）取杜香揮發(fā)油提取工藝，為更好地開發(fā)利用杜香資源提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用儀：GCMS–QP2010 型，日本島津公司。

微波爐：Galanz wp800 型，順德格蘭仕微波爐有限公司。

電子調(diào)溫電熱套：98–1–B 型，重慶市吉祥教學(xué)設(shè)備有限公司。

托盤天平：JYT–5 型，常熟市佳衡天平儀器有限公司。

揮發(fā)油提取器：B–034812 型，實(shí)驗(yàn)室組裝，上海壘固儀器有限公司。

杜香：采自內(nèi)蒙古大興安嶺，由廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院汪小根教授鑒定。

實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.2 揮發(fā)油提取方法

1.2.1 水蒸氣蒸餾法

按2015 版《中國(guó)藥典》提取植物精油的方法，分別稱取一定量的樣品于揮發(fā)油提取器中，加水蒸餾3 h，無水硫酸鈉干燥，收集揮發(fā)油。

1.2.2 微波輔助水蒸氣蒸餾法

樣品經(jīng)粉碎過0.180 mm 孔徑篩，稱取一定量置于揮發(fā)油提取器中，按照比例加入蒸餾水，置于頂端開口的微波爐中，設(shè)定微波功率480 W﹑時(shí)間30 min﹑杜香–水質(zhì)量比為1∶9 進(jìn)行微波輔助水蒸氣蒸餾，收集揮發(fā)油，用無水硫酸鈉干燥。

1.3 儀器工作條件

（1）氣相色譜條件。色譜柱：RTX–5 石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm，美國(guó)Restek 公司）；升溫程序：初始溫度為80 ℃，以10 ℃/min 升溫到280 ℃；汽化室溫度：250 ℃；載氣：高純氦氣；載氣流量：0.94 mL/min；進(jìn)樣體積：1.0 μL。

（2）質(zhì)譜條件。電離方式為EI；燈絲電流：0.6 mA；電子能量：70 eV；倍增器電壓：1.0 kV；離子源溫度：200 ℃；質(zhì)量掃描范圍：m/z40～350；掃描周期：0.5 s；溶劑延遲：3 min。

1.4 定性與定量分析

經(jīng)查閱文獻(xiàn)及考察最終確定定性與定量分析條件如下［14–15］。

定性分析：分別取1.0 μL 揮發(fā)油，用氣相色譜–質(zhì)譜–計(jì)算機(jī)聯(lián)用儀進(jìn)行分析鑒定。通過NIST’02 譜庫自動(dòng)檢索獲得初步鑒定結(jié)果。根據(jù)所得質(zhì)譜圖與EPA/NIH 以及有關(guān)文獻(xiàn)［7，9–10，12］對(duì)照，再結(jié)合人工譜圖解析，以確認(rèn)揮發(fā)油中各化學(xué)成分。

定量分析：通過Shimadzu GC–MS solution 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，按照峰面積歸一法進(jìn)行定量分析，求出揮發(fā)油中各化學(xué)成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件選擇

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通過微調(diào)升溫程序，在初始溫度80℃，以10 ℃/min 升溫到280 ℃，樣品中各色譜峰可達(dá)到良好分離，這可能是因?yàn)镽TX–5 是弱極性柱，對(duì)香精油類有機(jī)化合物的分離具有高的選擇性，加上毛細(xì)管柱的柱效高的緣故。因此色譜升溫程序選擇初始溫度80 ℃，以10 ℃/min 升溫到280 ℃。

2.2 微波輔助水蒸氣蒸餾法優(yōu)化

在微波萃取工藝中，影響揮發(fā)油得率的因素主要有微波功率﹑提取時(shí)間﹑杜香–水質(zhì)量比。因此以微波功率﹑提取時(shí)間和杜香–水質(zhì)量比為考察因素，以得油率為考察指標(biāo)。根據(jù)表1 正交設(shè)計(jì)方法，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化微波輔助萃取的條件，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2，正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表1 因素水平表

表2 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

表3 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3 可見，微波功率﹑萃取時(shí)間﹑杜香–水質(zhì)量比三因素的極差分別為2﹑0.3﹑1.1，表明微波功率對(duì)揮發(fā)油提取率的影響最顯著，萃取時(shí)間對(duì)微波輔助提取揮發(fā)油萃取率影響較小。根據(jù)K值試驗(yàn)結(jié)果可見，A：K3>K1>K2；B：K2>K1>K3；C：K3>K2>K1，因此揮發(fā)油的最佳組合萃取條件為A3﹑B2﹑C3，即微波功率為480 W﹑時(shí)間為30 min﹑杜香–水質(zhì)量比為1∶9。根據(jù)優(yōu)化條件進(jìn)行提取，得油率為2.1%。

2.3 不同提取方法的比較

2.3.1 得油率和物性的比較

水蒸氣蒸餾提取按實(shí)驗(yàn)1.2.1 方法進(jìn)行，微波輔助水蒸氣蒸餾提取按1.2.2 進(jìn)行，不同提取方法揮發(fā)油的產(chǎn)率和物性見表4。結(jié)果表明，微波輔助提取30 min 的得油率顯著高于水蒸氣蒸餾法3 h 的得油率，微波輔助提取所得揮發(fā)油的顏色也較SD 法的淺。由此可見，采用微波輔助提取不僅可以快速提取杜香揮發(fā)油，而且可以提高揮發(fā)油的得油率并保證其物性不受影響。

表4 不同提取方法提取揮發(fā)油的提取率和理化性質(zhì)

2.3.2 揮發(fā)油的GC–MS 分析

采用GC–MS 分析不同提取方法所得揮發(fā)油。揮發(fā)油的總離子流圖如圖1﹑圖2 所示。經(jīng)檢索NIST’02 質(zhì)譜庫﹑參考相關(guān)文獻(xiàn)及根據(jù)各組分的特征性碎片離子進(jìn)行質(zhì)譜解析，相似度在90%以上的化合物及其相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)見表5。

表5 不同提取方法提取杜香揮發(fā)油的化學(xué)成分及相對(duì)含量

圖1 水蒸氣蒸餾法所得杜香揮發(fā)油的總離子流色譜圖

圖2 微波輔助水蒸氣蒸餾法所得杜香揮發(fā)油的總離子流色譜圖

（1）由表5 可知，兩種不同的提取方法所得樣品總共有50 種成分，其主要成分為單萜﹑倍半萜及其氧化物。水蒸氣蒸餾所得的杜香揮發(fā)油中鑒定出34 種化合物；微波輔助水蒸氣提取所得揮發(fā)油種鑒定出33 種化合物。用面積歸一法測(cè)定了兩種樣品各成分的相對(duì)百分含量，各占總峰面積的96.57%﹑95.43%。

（2）表6﹑表7 為兩種不同提取方法所得杜香揮發(fā)油的主要成分。兩種不同提取方法所得杜香揮發(fā)油的成分存在差異，其中β-水芹烯(beta-Phellandrene)﹑γ-松油烯(gamma.–Terpinen)﹑1-甲基-異丙基苯(1-methyl-2–(1-methylethyl)–Benzene)﹑異松油烯（terpinolene）﹑1- 萜品-4 醇（1–Terpinen-4-ol）﹑α- 側(cè)柏醛alpha-thujena﹑松油醇（p-Menth-1-en-8-ol）﹑乙酸龍腦酯（bornyl acetate）﹑水芹醛（phellandral）﹑桃金娘烯醇（myrtenol）等17 種化合物為兩種揮發(fā)油樣品所共有。

表6 SD 提取杜香揮發(fā)油的主要成分

表7 MAE–SD 提取杜香揮發(fā)油的主要成分

（3）由表6 和表7 可見，兩種不同提取方法所得杜香揮發(fā)油的主要成分不盡相同，但其中1-甲基-異丙基苯(1-methyl-2-(1-methylethyl)–Benzene)﹑1- 萜品-4 醇(1-Terpinen-4-ol)﹑α- 側(cè)柏醛(alphathujena)在兩種揮發(fā)油中都有較高的比例，是杜香揮發(fā)油香氣的主要成分。

（4）作為我國(guó)的傳統(tǒng)中藥材杜香擁有諸多生理作用。比如，含量較多的α-側(cè)柏醛具有鎮(zhèn)咳﹑祛痰﹑平喘﹑鎮(zhèn)靜，同時(shí)還具有抑菌等作用；4-萜品醇具有顯著的平喘作用；α-松油醇既有殺菌效果，又是良好的天然香料；α-蒎烯具有明顯的祛痰﹑鎮(zhèn)咳作用，同時(shí)還有抗真菌﹑驅(qū)蟲作用。由此可見，杜香揮發(fā)油含有的主要成分不但可作為重要的香料成分，也是其殺蟲﹑抗菌﹑平喘等作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

（1）通過正交試驗(yàn)研究確定了各因素對(duì)杜香油提取率的影響順序：微波功率>杜香–水質(zhì)量比>提取時(shí)間。最優(yōu)條件為微波中低火，時(shí)間30 min，杜香–水質(zhì)量比為1∶9。

（2）在微波輔助水蒸氣提取杜香揮發(fā)油實(shí)驗(yàn)中，微波功率的大小對(duì)提取時(shí)間﹑出油率有影響，而對(duì)揮發(fā)油成分影響較小。

（3）與傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法相比，微波輔助提取法具有設(shè)備簡(jiǎn)單﹑適用范圍廣﹑萃取效率高﹑重現(xiàn)性好﹑節(jié)省時(shí)間﹑節(jié)省試劑﹑污染小等特點(diǎn)，可用于提取各類新鮮香料植物的揮發(fā)油。