干擾旋毛蟲GAD 基因?qū)ζ淇顾崮芰τ绊懙难芯?/h1>
2022-04-25 00:57:32孟小晴王姍姍宋銘忻
中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào) 2022年2期
張 妍，孟 詩，孟小晴，高 遠(yuǎn)，王 爽，趙 亞，王姍姍，郭 琨，宋銘忻
（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物源性人獸共患病黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030）
旋毛形線蟲（Trichinella spiralis）是臨床上最小但最重要的營(yíng)寄生生活的線蟲之一，也是引起旋毛蟲病的主要病原。旋毛蟲病已在全世界約55 個(gè)國(guó)家有報(bào)道，尤其在發(fā)展中國(guó)家非常普遍，是目前世界上分布最廣泛的人獸共患病之一[1-2]。根據(jù)旋毛蟲成蟲和肌幼蟲寄生的部位不同，將旋毛蟲的生活史劃分為腸期和肌肉期兩個(gè)階段[3]。人和動(dòng)物因吞食含有肌幼蟲的包囊而感染。包囊在胃液的作用下釋放出旋毛蟲肌幼蟲，幼蟲經(jīng)過十二指腸遷移入小腸并在小腸絨毛內(nèi)寄生，大約30 h 后經(jīng)過4 次蛻皮發(fā)育為成蟲。從旋毛蟲的整個(gè)生活史可以看出，旋毛蟲能否感染宿主關(guān)鍵在于包囊中的感染性幼蟲能否成功通過胃部酸性環(huán)境侵入小腸上皮細(xì)胞[4]。從旋毛蟲致宿主患病的原因推測(cè)，旋毛蟲幼蟲可以耐受極酸的環(huán)境。
谷氨酸依賴型抗酸系統(tǒng)2（Glutamic acid resistance 2，AR2）是谷氨酸脫羧酶在催化谷氨酸發(fā)揮脫羧作用過程中消耗細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)子，進(jìn)而發(fā)揮抗酸作用的一種抗酸機(jī)制。谷氨酸脫羧酶是催化谷氨酸脫羧生成γ-氨基丁酸（γ-aminobutyrate，GABA）的關(guān)鍵酶[5]。同時(shí)谷氨酸的脫羧產(chǎn)物GABA 會(huì)被反轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白（Antitransporter protein，GadC）轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外并且交換到新的底物—谷氨酸，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的pH，以緩解細(xì)胞外低pH 對(duì)細(xì)胞的影響，AR2 是最有效的抗酸途徑之一[6]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的酸性降低時(shí)，谷氨酸脫羧酶就會(huì)通過催化谷氨酸脫羧消耗質(zhì)子，以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的酸堿平衡[7]。RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是一種分子生物學(xué)上由雙鏈RNA 誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，其機(jī)制是通過阻礙特定基因的轉(zhuǎn)錄或者翻譯來抑制基因表達(dá)，是降低基因表達(dá)有效和特異的方法。本研究利用RNAi 技術(shù)干擾旋毛蟲谷氨酸脫羧酶（Glutamate，GAD）基因的表達(dá)，結(jié)合體外酸性環(huán)境培養(yǎng)旋毛蟲肌幼蟲及其感染小鼠的體內(nèi)試驗(yàn)，研究干擾GAD 基因表達(dá)對(duì)旋毛蟲肌幼蟲在酸性條件下的存活率與繁殖力的影響，并探究旋毛蟲谷氨酸依賴型抗酸機(jī)制在其抗酸環(huán)境過程中發(fā)揮的作用。以期為抗旋毛蟲藥物的研發(fā)提供新的作用靶點(diǎn)。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑BALB/c 小鼠購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（HiScript Q Select RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper））、硝酸纖維素膜、熒光定量PCR 試劑盒（AceQ qPCR SYBR Green Master Mix）、TRIzol 試劑購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 購(gòu)自Thermo Fisher Scientific；GABA 標(biāo)準(zhǔn)品和L-谷氨酸（L-Glu）購(gòu)自Sigma 公司；表達(dá)GAD 蛋白的重組菌、兔源GAPDH單克隆抗體（MAb）和兔源GAD 免疫血清由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物源性人獸共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（IgG-HRP）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。
1.2 熒光定量PCR 引物與siRNA 的設(shè)計(jì)與合成旋毛蟲GAD 和內(nèi)參GAPDH 基因的熒光定量PCR 引物參考文獻(xiàn)[4]合成。根據(jù)GenBank 登錄的旋毛蟲GAD mRNA 參考序列（XM_003375768.1）設(shè)計(jì)3 條靶向GAD 的siRNA 和一條contro siRNA（NC siRNA），GAD-siRNA1 正義鏈序列為GCGACTGTACACTTGGA AATG，反義鏈序列為CATTTCCAAGTGTACAGTC；GAD-siRNA2 正義鏈序列為GCGACTGTACACTTGGA AATG，反義鏈序列為CATTTCCAAGTGTACAGTCG C；GAD-siRNA3 正義鏈序列為CCAAGGGUAUGAAU GGCUUTT，反義鏈序列為AAGCCAUUCAUACCCUU GGTT；NC siRNA 正義鏈序列為AUCGGCUACCAAG UCAUACTT，反義鏈序列為GUAUGACUUGGUAGCC GAUTT，引物及siRNA 均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。
1.3 最佳siRNA 及其轉(zhuǎn)染劑量的篩選將無菌的旋毛蟲肌幼蟲（后均簡(jiǎn)寫為肌幼蟲）分為siRNA1、siRNA2、siRNA3、NC siRNA 和PBS 等5 組，分別置于RPMI 1640 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，參照文獻(xiàn)[8]，采用浸染法利用2 μL Lipofectin 2000 分別與終濃度為2 μmol/L的siRNA1、siRNA2、siRNA3、NC siRNA 和等體積的PBS 轉(zhuǎn)染各組肌幼蟲，篩選出最佳干擾的siRNA。
將旋毛蟲各組培養(yǎng)板置于37 ℃5%CO2培養(yǎng)12 h后，收集蟲體，利用TRIzol 法提取各組肌幼蟲總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 作為模板，以GAPDH 基因?yàn)閮?nèi)參，利用熒光定量PCR 檢測(cè)各組肌幼蟲GAD 基因mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平[4]；將各組蟲體研磨、離心后即獲得了各組肌幼蟲的粗蛋白并經(jīng)SDS-PAGE 電泳，分別以兔源GAD 免疫血清[4]（1∶100）、兔源GAPDH MAb（1∶5 000）為一抗，以羊抗兔IgG-HRP（1∶5 000）為二抗，采用western blot 檢測(cè)siRNA 干擾后GAD 基因表達(dá)水平的變化。根據(jù)上述檢測(cè)結(jié)果初步篩選最佳的siRNA。
將肌幼蟲分為5 組（每組5 000 條），按照上述方法分別以1 μmol/L、2 μmol/L 和4 μmol/L 的劑量轉(zhuǎn)染已篩選出的最佳siRNA，以轉(zhuǎn)染2 μmol/L 的NC siRNA 及等體積的PBS 分別做為陰性對(duì)照和空白對(duì)照，12 h 后更換RPMI 1640 培養(yǎng)液后繼續(xù)在37 ℃5%CO2培養(yǎng)3 d，收集蟲體，采用上述熒光定量PCR 和western blot檢測(cè)各組肌幼蟲GAD基因的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)，以確定最佳siRNA 的最適轉(zhuǎn)染劑量。
1.4 酸環(huán)境對(duì)GAD 基因干擾后的肌幼蟲存活率的影響將肌幼蟲分為最佳siRNA 組、NC siRNA 組和PBS 組，每組設(shè)置3 個(gè)平行孔，每孔300 條肌幼蟲，分別在pH 值2.5、4.0、6.6 和8.0 的培養(yǎng)液中利用浸染法分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)的siRNA 和PBS，在37 ℃、5%CO2分別培養(yǎng)0.5 h、1 h 和2 h 時(shí)經(jīng)顯微鏡觀察蟲體活性，記錄活蟲數(shù)，分析酸環(huán)境對(duì)GAD 基因干擾后肌幼蟲存活率的影響。存活率=（總蟲數(shù)-死亡數(shù)）/總蟲數(shù)×100%。
1.5 不同酸環(huán)境培養(yǎng)GAD 基因干擾后的肌幼蟲GAD 基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)按照1.4 的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分組并轉(zhuǎn)染后分別培養(yǎng)0.5 h、1 h 和2 h 收集蟲體，利用TRIzol 法提取各組肌幼蟲總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH 為內(nèi)參基因，按照1.3 的熒光定量PCR 方法檢測(cè)各組肌幼蟲GAD 基因轉(zhuǎn)錄水平，分析酸性環(huán)境對(duì)誘導(dǎo)GAD 基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。
1.6 不同酸環(huán)境培養(yǎng)GAD 基因干擾后的肌幼蟲培養(yǎng)液中GAD 酶活性及其pH 值的測(cè)定分別收集上述各組肌幼蟲培養(yǎng)0.5 h 后的培養(yǎng)液，參照文獻(xiàn)[4]，采用比色法以不同濃度的GABA 標(biāo)準(zhǔn)液和不同濃度的L-Glu 標(biāo)準(zhǔn)液按等摩爾濃度（如8 mmol/L L-Glu 和2 mmol/L GABA 為一組）的策略組成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以混合后標(biāo)準(zhǔn)液中各GABA 的濃度為橫坐標(biāo)，以混合液對(duì)應(yīng)的OD640nm值為縱坐標(biāo)，建立GABA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。取不同酸性條件下培養(yǎng)的肌幼蟲，研磨、離心制備GAD 粗酶液，測(cè)定OD640nm處的吸收值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得GAD 粗酶液中GABA 的濃度，按照酶活力計(jì)算公式：酶活力=（GAD 粗酶液中GABA 濃度×酶反應(yīng)總體積）/ GABA 的相對(duì)分子質(zhì)量計(jì)算各組培養(yǎng)液中GAD 的酶活性；利用pH 儀檢測(cè)各組肌幼蟲培養(yǎng)液的pH 值，比較肌幼蟲在不同pH 培養(yǎng)前后培養(yǎng)液pH 值的變化，分析干擾GAD 基因表達(dá)后培養(yǎng)液中GAD 酶活性與培養(yǎng)液pH 值的相關(guān)性。
1.7 GAD 基因干擾后的肌幼蟲對(duì)小鼠感染能力及其子代肌幼蟲保姆細(xì)胞影響的檢測(cè)將2 月齡左右的健康BALB/c 小鼠分為3 組，9 只/組。實(shí)驗(yàn)組小鼠分別經(jīng)口接種2 μmol/L siRNA1 和NC siRNA 各2 μL 轉(zhuǎn)染的肌幼蟲（NC 組），設(shè)口服等體積PBS 侵染的肌肉蟲作為空白對(duì)照，接種量均為300 條肌幼蟲。在感染后7 d，通過脫臼法隨機(jī)迫殺各組中的3只小鼠，去除皮毛、內(nèi)臟和脂肪，胴體稱重，搗碎后轉(zhuǎn)移至廣口瓶，利用體外消化法和改良的貝爾曼收集裝置收集成蟲，計(jì)算成蟲減蟲率[4]。減蟲率=（NC 組肌幼蟲感染組的成蟲數(shù)－RNAi 干擾肌幼蟲組的成蟲數(shù)）/NC 組肌幼蟲感染組的成蟲數(shù)×100%。在感染后42 d，采用上述方法收集各組肌幼蟲，計(jì)算肌幼蟲的減蟲率、肌幼蟲的繁殖力指數(shù)（Reproductive capacity index，RCI）和每克肌幼蟲數(shù)（Larvae per gram，LPG）。RCI=接種小鼠后所獲得的幼蟲數(shù)/接種的幼蟲數(shù)；LPG=每克肌肉消化后獲得的幼蟲數(shù)；采用上述方法迫殺每組剩余的3 只小鼠，采集膈肌，經(jīng)固定脫水、透明、石蠟包埋等步驟后制作病理切片，HE染色后，經(jīng)顯微鏡觀察各組肌幼蟲保姆細(xì)胞。
1.8 統(tǒng)計(jì)分析采用GraphPad Prism 5 用于siRNA 轉(zhuǎn)染條件的篩選，采用Excel 統(tǒng)計(jì)并計(jì)算幼蟲的存活率。并采用單因素方差分析法分析組間差異，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié) 果
2.1 最佳GAD-siRNA 及其轉(zhuǎn)染劑量的篩選結(jié)果通過浸染法將終濃度分別為2 μmol/L 的siRNA1、siRNA2、siRNA3 和NC siRNA（NC 組）分別轉(zhuǎn)染至肌幼蟲體內(nèi)，12 h 后分別利用熒光定量PCR 和western blot 檢測(cè)各siRNA 的干擾效果，篩選出最佳干擾的siRNA。結(jié)果顯示，siRNA1、siRNA2、siRNA3 轉(zhuǎn)染組肌幼蟲組GAD 基因轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)于PBS 組分別降低了48.03%、61.14%和83.12%，NC 組與PBS 組肌幼蟲GAD 基因的轉(zhuǎn)錄水平無差異（圖1A）；western blot 結(jié)果顯示，與PBS 和NC 組相比，上述siRNA 轉(zhuǎn)染組肌幼蟲GAD 的表達(dá)量分別降低了43.30%、69.50%和84.80%（P＜0.01），而NC 組GAD 基因轉(zhuǎn)錄水平與PBS 組無顯著差異（圖1C、圖1E，P＞0.05）。表明siRNA1 對(duì)肌幼蟲GAD 基因的干擾效果最好，因此選擇siRNA1 用于后續(xù)試驗(yàn)。
采用浸染法分別將1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L GAD-siRNA1 和2 μmol/L NC siRNA 轉(zhuǎn)染肌幼蟲體內(nèi)培養(yǎng)3 d 后，采用熒光定量PCR 和western blot 檢測(cè)每組GAD 基因的轉(zhuǎn)錄水平和其蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，相對(duì)于PBS組和NC組，1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L siRNA1 轉(zhuǎn)染組GAD 基因轉(zhuǎn)錄水平分別降低79.80%、47.70%和41.20%，NC 組與PBS 組GAD 基因轉(zhuǎn)錄水平無差異（圖1B）；Western blot 結(jié)果顯示，相對(duì)于PBS 組，上述各濃度siRNA1 轉(zhuǎn)染組GAD基因表達(dá)量分別降低了76.80%、49.70%和40.20%（P＜0.01），其中2 μmol/L 和4 μmol/L 的siRNA1 干擾效率均較高，NC 組GAD 基因表達(dá)量與PBS 組無差異（圖1D、圖1F），出于成本考慮選擇2 μmol/L siRNA1 用于后續(xù)試驗(yàn)。
圖1 最佳siRNA及其最佳轉(zhuǎn)染劑量的篩選結(jié)果Fig.1 The screening of the best siRNA and concentration
2.2 酸環(huán)境對(duì)GAD 基因干擾后肌幼蟲存活率的影響將siRNA1 組、NC 組和PBS 組肌幼蟲在不同pH值的培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)0.5 h、1 h 和2 h 時(shí)檢測(cè)肌幼蟲的存活率，結(jié)果顯示，同一pH 值的培養(yǎng)液中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，各組肌幼蟲的存活率均降低，其中siRNA1 組肌幼蟲的存活率明顯低于PBS 組和NC 組（P＜0.05），siRNA1 組在pH2.5 培養(yǎng)2 h 的存活率最低為30%；各組肌幼蟲在pH6.6 時(shí)的存活率最高。NC 組肌幼蟲的存活率則與PBS 組無明顯差異（P＞0.05）（表1）。表明干擾GAD 基因后，肌幼蟲在酸性環(huán)境中的存活率降低。
表1 各組肌幼蟲在不同酸環(huán)境中的存活率檢測(cè)結(jié)果Table 1 The survival rate of muscle larval in different acid medium
2.3 不同酸環(huán)境培養(yǎng)GAD 基因干擾后肌幼蟲GAD基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)結(jié)果將siRNA1 組、NC 組和PBS 組肌幼蟲分別在pH 值為2.5、4.0、6.6 和8.0 的培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)0.5 h、1 h 和2 h 后，經(jīng)熒光定量PCR 檢測(cè)各組肌幼蟲GAD 基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，在相同pH 培養(yǎng)條件下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，siRNA1 組GAD 基因的轉(zhuǎn)錄水平均顯著低于PBS組（P＜0.05）；在相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，與PBS 和NC 組相比，隨著培養(yǎng)液pH 值的減小，siRNA1 組肌幼蟲GAD 基因的轉(zhuǎn)錄水平均升高；siRNA1 組肌幼蟲在pH2.5 時(shí)GAD 基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于其pH6.6時(shí)GAD 基因的轉(zhuǎn)錄水平（P＜0.05），在pH6.6 與pH8.0時(shí)該組肌幼蟲GAD 基因的轉(zhuǎn)錄水平差異不顯著（P＞0.05）；NC 組肌幼蟲GAD 基因的轉(zhuǎn)錄水平無論是在不同的培養(yǎng)條件還是不同的培養(yǎng)時(shí)間均與PBS 組差異不顯著（P＞0.05）（圖2）。表明酸性環(huán)境可以誘導(dǎo)旋毛蟲肌幼蟲GAD 基因轉(zhuǎn)錄水平的升高。
圖2 不同培養(yǎng)時(shí)間和pH值條件下GAD基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Expression of GAD gene under different culture time and pH value
2.4 不同酸環(huán)境培養(yǎng)GAD 基因干擾后的肌幼蟲培養(yǎng)液GAD 的酶活性及其pH 值的測(cè)定結(jié)果將siRNA1 組、NC 組和PBS 組肌幼蟲分別在pH 值為2.5、4.0、6.6 和8.0 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)0.5 h 后，采用比色法繪制GABA 的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和酶活公式計(jì)算各組肌幼蟲培養(yǎng)液中GAD 的酶活性；同時(shí)分別測(cè)定各組肌幼蟲培養(yǎng)液的pH值。結(jié)果顯示，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.1591x+0.0293，相關(guān)系數(shù)R2為0.9912，接近于1，符合線性化標(biāo)準(zhǔn)（圖3A）。經(jīng)計(jì)算結(jié)果顯示，相同pH 條件下，siRNA1 組肌幼蟲培養(yǎng)液中GAD 的酶活性均比PBS 組和NC 組低，且該組肌幼蟲在pH2.5 和pH4.0 時(shí)GAD 的酶活性顯著高于pH6.6 和pH8.0 時(shí)的該酶活性（P＜0.05）；不同pH 值培養(yǎng)條件下NC 組肌幼蟲培養(yǎng)液中GAD 的酶活性均與PBS 組差異不顯著（P＞0.05）（圖3B）。表明干擾GAD 基因后會(huì)降低肌幼蟲GAD 的酶活性，且在酸性條件下該酶活性較高。
pH 值測(cè)定結(jié)果顯示，siRNA1 組肌幼蟲在不同pH 條件下培養(yǎng)后的pH 值均略升高，但均與PBS 組和NC 組培養(yǎng)液的pH 值差異不顯著；且該組在pH 8.0 培養(yǎng)后pH 值略降低，但與兩個(gè)組對(duì)照組差異均不顯著（P＞0.05）（圖3C）。上述結(jié)果也顯示，相同pH 條件下，隨著培養(yǎng)液中肌幼蟲GAD 酶活性的降低，該培養(yǎng)液中的pH 值則略升高，二者呈負(fù)相關(guān)性。表明TGAD 基因干擾后的旋毛蟲肌幼蟲調(diào)節(jié)細(xì)胞外pH 值的能力減弱。
圖3 肌幼蟲在不同pH培養(yǎng)0.5 h后GABA的標(biāo)準(zhǔn)曲線（A）、GAD酶活性（B）和pH值（C）的測(cè)定結(jié)果Fig.3 The GABA standard curve(A),the determination results of GAD enzyme activity(B)and pH(C)of Trichinella spiralis muscle larvae cultured with different pH for 0.5 h
2.5 GAD 基因干擾后的肌幼蟲對(duì)小鼠的感染力及其子代保姆細(xì)胞影響的檢測(cè)結(jié)果小鼠經(jīng)口分別接種siRNA1 組、NC 組和PBS 組肌幼蟲，感染后7 d 和42 d 迫殺各組小鼠后分別收集成蟲及肌幼蟲蟲體，計(jì)算感染后7 d 小鼠機(jī)體成蟲的減蟲率及感染后42 d小鼠機(jī)體肌幼蟲的減蟲率、肌幼蟲的RCI 及LPG（感染后42 d），采集感染后42 d 小鼠的膈肌，制作病理切片并經(jīng)顯微鏡觀察保姆細(xì)胞及其周圍狀態(tài)。結(jié)果顯示，感染后7 d siRNA1 組小鼠機(jī)體旋毛蟲成蟲的減蟲率為31.50%；感染后42 d，該組小鼠機(jī)體肌幼蟲的減蟲率為49.05%；感染后42 d siRNA1 組小鼠機(jī)體肌幼蟲的RCI、LPG 分別為62.51±7.32 和1250.22±146.48，NC 組小鼠肌幼蟲的RCI、LPG 分別為119.03±3.60 和2380.57±71.91，且均與siRNA1 組小鼠差異顯著（P＜0.05），但與PBS 組小鼠機(jī)體肌幼蟲的RCI、LPG 差異均不顯著（P＞0.05）。表明GAD 基因干擾后的旋毛蟲對(duì)宿主體內(nèi)的抗酸能力降低，以至于對(duì)小鼠的感染力也降低。
感染后42 d 小鼠膈肌病理切片的觀察結(jié)果顯示， siRNA1 組小鼠機(jī)體內(nèi)F1 代旋毛蟲保姆細(xì)胞壁周圍存在大量炎性細(xì)胞，保姆細(xì)胞裂解。NC 組和PBS 組肌幼蟲保姆細(xì)胞周圍未觀察到炎性細(xì)胞，且保姆細(xì)胞完整（圖4，箭頭所指為保姆細(xì)胞）。表明GAD 基因干擾后的肌幼蟲抗酸能力降低，對(duì)宿主體內(nèi)免疫系統(tǒng)的抵抗力減弱。
圖4 各組小鼠膈肌中F1代肌幼蟲保姆細(xì)胞的觀察結(jié)果Fig.4 Nurse cells in the diaphragm of mice in each group
3 討 論
胃液作為生態(tài)過濾器呈酸性，可以殺死大部分微生物，因此食源性致病菌必須經(jīng)受極端的酸性環(huán)境才能通過胃進(jìn)入腸道而感染、增殖，最終致宿主疾病的發(fā)生[9]。近年來有很多關(guān)于食源性致病菌抗酸機(jī)制研究，尤以致病性大腸桿菌抗酸系統(tǒng)的研究成果最為顯著。旋毛蟲作為一種食源性病原，其生活史決定旋毛蟲肌幼蟲必須通過宿主極酸的胃環(huán)境，在胃內(nèi)停留數(shù)小時(shí)才能到達(dá)腸道，侵入小腸內(nèi)引起宿主感染致病，這說明肌幼蟲也應(yīng)具有很強(qiáng)抗酸性環(huán)境的能力，但目前其是否存在抗酸機(jī)制尚未見報(bào)道。細(xì)菌耐酸性的判斷依據(jù)是將其接種在pH2.0～pH2.5 的酸性培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h 后檢測(cè)其存活率，若存活率大于10%就認(rèn)定為該細(xì)菌具有抗酸性。本研究的前期預(yù)試驗(yàn)利用熒光定量PCR 方法，檢測(cè)不同酸性條件下培養(yǎng)的肌幼蟲GAD 基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，隨著pH 值的降低，旋毛蟲GAD mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高，在pH2.5 時(shí)GAD mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于pH4.0、pH6.6 和pH9.0 時(shí)的轉(zhuǎn)錄水平，并且培養(yǎng)不同時(shí)間后旋毛蟲GAD mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平也不同，培養(yǎng)1 h 旋毛蟲GAD mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平高于培養(yǎng)0.5 h 和2 h 的轉(zhuǎn)錄水平[4]。研究結(jié)果表明，強(qiáng)酸環(huán)境能顯著誘導(dǎo)旋毛蟲肌幼蟲GAD 基因轉(zhuǎn)錄水平的升高。
RNAi 技術(shù)已被用于確定各種蠕蟲中的特定關(guān)鍵基因，包括曼氏血吸蟲、日本血吸蟲、華支睪吸蟲和旋毛蟲。本研究利用siRNA 干擾旋毛蟲GAD基因的表達(dá)后將其分別置于pH2.5、pH4.0、pH6.6和pH8.0的培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)0.5 h、1 h和2 h后，檢測(cè)旋毛蟲的抗酸性，結(jié)果表明GAD基因干擾后旋毛蟲的抗酸性降低，旋毛蟲的抗酸性與其GAD基因相關(guān)。
AR2 的抗酸能力與細(xì)胞中谷氨酸的含量有關(guān)，當(dāng)谷氨酸含量降低時(shí)，該系統(tǒng)將不能有效調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的pH 值，進(jìn)而會(huì)導(dǎo)致旋毛蟲的死亡。當(dāng)在體外酸性環(huán)境中培養(yǎng)GAD 基因干擾后的旋毛蟲，熒光定量PCR 結(jié)果顯示，pH2.5 時(shí)旋毛蟲GAD 基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于pH6.0 時(shí)GAD 基因的轉(zhuǎn)錄水平，但在pH6.0 的條件下時(shí)旋毛蟲的存活率高于pH2.5 時(shí)的存活率，這說明酸刺激雖然可以誘導(dǎo)GAD 基因的高轉(zhuǎn)錄但并不意味著會(huì)提高旋毛蟲的存活率。GAD 是一種吡哆醛5′-磷酸（PLP）依賴性酶，其活性的最適pH值為3.8～4.6，具有六聚體的晶體結(jié)構(gòu)。在中性pH下，GadB（GAD 酶的一種形式）僅位于細(xì)胞質(zhì)中，而在酸性條件下，它被募集到細(xì)胞膜中，并在此與Glu/GABA/GadC 協(xié)同作用[4]。體外酸性環(huán)境培養(yǎng)GAD基因干擾后的旋毛蟲，培養(yǎng)2 h 后與PBS 組和NC 組相比，其培養(yǎng)液的pH 值升高不明顯。在相同pH 條件下培養(yǎng)旋毛蟲， siRNA1 組旋毛蟲GAD 的酶活性比PBS 組低，且在pH2.5 和pH4.0 時(shí)該組旋毛蟲GAD的酶活性高于pH6.6和pH8.0的該酶活性，結(jié)果證明通過siRNA干擾旋毛蟲的GAD基因會(huì)降低其GAD的酶活性，該酶在酸性條件下的活性高，該結(jié)果與GAD的生物特性相符[5]。利用GAD 基因干擾的旋毛蟲感染小鼠，siRNA1組小鼠的成蟲減蟲率為31.5%，肌幼蟲的減蟲率為49.05%。是因?yàn)榕c兩個(gè)對(duì)照組相比，GAD基因干擾后的旋毛蟲耐受胃部酸性環(huán)境的能力減弱，當(dāng)經(jīng)過胃部時(shí)會(huì)有大量旋毛蟲死亡，因此獲得成蟲和肌幼蟲的數(shù)量減少，因而相應(yīng)的減蟲率會(huì)升高。
保姆細(xì)胞是新生幼蟲侵入宿主肌細(xì)胞后在原肌細(xì)胞的基礎(chǔ)上結(jié)合毛細(xì)血管而形成的一種獨(dú)立的結(jié)構(gòu)，是新生幼蟲在宿主體內(nèi)生存的保護(hù)屏障。siRNA1 組小鼠膈肌的病理切片觀察結(jié)果顯示， GAD 基因干擾后，子代旋毛蟲的保姆細(xì)胞周圍存在大量炎性細(xì)胞，這些炎性細(xì)胞會(huì)破壞保姆細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，使旋毛蟲幼蟲失去保護(hù)屏障，致其存活率降低，這可能與旋毛蟲GAD 基因干擾后的抗酸能力降低，子代肌幼蟲抵抗宿主免疫應(yīng)答的能力減弱有關(guān)。以上結(jié)果均表明GAD 基因干擾后旋毛蟲的抗酸能力減弱，且旋毛蟲的抗酸能力與GAD 基因相關(guān)。
本研究證明siRNA 可以干擾旋毛蟲GAD 基因的表達(dá)，并通過對(duì)GAD 基因干擾后的肌幼蟲體外和體內(nèi)抗酸能力的研究，證明GAD 在旋毛蟲耐受胃酸環(huán)境時(shí)發(fā)揮了重要作用。利用siRNA 干擾技術(shù)能夠使旋毛蟲耐酸能力發(fā)生改變，為預(yù)防旋毛蟲病提供了新思路。
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張 妍，孟 詩，孟小晴，高 遠(yuǎn)，王 爽，趙 亞，王姍姍，郭 琨，宋銘忻
（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物源性人獸共患病黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030）
旋毛形線蟲（Trichinella spiralis）是臨床上最小但最重要的營(yíng)寄生生活的線蟲之一，也是引起旋毛蟲病的主要病原。旋毛蟲病已在全世界約55 個(gè)國(guó)家有報(bào)道，尤其在發(fā)展中國(guó)家非常普遍，是目前世界上分布最廣泛的人獸共患病之一[1-2]。根據(jù)旋毛蟲成蟲和肌幼蟲寄生的部位不同，將旋毛蟲的生活史劃分為腸期和肌肉期兩個(gè)階段[3]。人和動(dòng)物因吞食含有肌幼蟲的包囊而感染。包囊在胃液的作用下釋放出旋毛蟲肌幼蟲，幼蟲經(jīng)過十二指腸遷移入小腸并在小腸絨毛內(nèi)寄生，大約30 h 后經(jīng)過4 次蛻皮發(fā)育為成蟲。從旋毛蟲的整個(gè)生活史可以看出，旋毛蟲能否感染宿主關(guān)鍵在于包囊中的感染性幼蟲能否成功通過胃部酸性環(huán)境侵入小腸上皮細(xì)胞[4]。從旋毛蟲致宿主患病的原因推測(cè)，旋毛蟲幼蟲可以耐受極酸的環(huán)境。
谷氨酸依賴型抗酸系統(tǒng)2（Glutamic acid resistance 2，AR2）是谷氨酸脫羧酶在催化谷氨酸發(fā)揮脫羧作用過程中消耗細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)子，進(jìn)而發(fā)揮抗酸作用的一種抗酸機(jī)制。谷氨酸脫羧酶是催化谷氨酸脫羧生成γ-氨基丁酸（γ-aminobutyrate，GABA）的關(guān)鍵酶[5]。同時(shí)谷氨酸的脫羧產(chǎn)物GABA 會(huì)被反轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白（Antitransporter protein，GadC）轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外并且交換到新的底物—谷氨酸，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的pH，以緩解細(xì)胞外低pH 對(duì)細(xì)胞的影響，AR2 是最有效的抗酸途徑之一[6]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的酸性降低時(shí)，谷氨酸脫羧酶就會(huì)通過催化谷氨酸脫羧消耗質(zhì)子，以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的酸堿平衡[7]。RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是一種分子生物學(xué)上由雙鏈RNA 誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，其機(jī)制是通過阻礙特定基因的轉(zhuǎn)錄或者翻譯來抑制基因表達(dá)，是降低基因表達(dá)有效和特異的方法。本研究利用RNAi 技術(shù)干擾旋毛蟲谷氨酸脫羧酶（Glutamate，GAD）基因的表達(dá)，結(jié)合體外酸性環(huán)境培養(yǎng)旋毛蟲肌幼蟲及其感染小鼠的體內(nèi)試驗(yàn)，研究干擾GAD 基因表達(dá)對(duì)旋毛蟲肌幼蟲在酸性條件下的存活率與繁殖力的影響，并探究旋毛蟲谷氨酸依賴型抗酸機(jī)制在其抗酸環(huán)境過程中發(fā)揮的作用。以期為抗旋毛蟲藥物的研發(fā)提供新的作用靶點(diǎn)。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑BALB/c 小鼠購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（HiScript Q Select RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper））、硝酸纖維素膜、熒光定量PCR 試劑盒（AceQ qPCR SYBR Green Master Mix）、TRIzol 試劑購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 購(gòu)自Thermo Fisher Scientific；GABA 標(biāo)準(zhǔn)品和L-谷氨酸（L-Glu）購(gòu)自Sigma 公司；表達(dá)GAD 蛋白的重組菌、兔源GAPDH單克隆抗體（MAb）和兔源GAD 免疫血清由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物源性人獸共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（IgG-HRP）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。
1.2 熒光定量PCR 引物與siRNA 的設(shè)計(jì)與合成旋毛蟲GAD 和內(nèi)參GAPDH 基因的熒光定量PCR 引物參考文獻(xiàn)[4]合成。根據(jù)GenBank 登錄的旋毛蟲GAD mRNA 參考序列（XM_003375768.1）設(shè)計(jì)3 條靶向GAD 的siRNA 和一條contro siRNA（NC siRNA），GAD-siRNA1 正義鏈序列為GCGACTGTACACTTGGA AATG，反義鏈序列為CATTTCCAAGTGTACAGTC；GAD-siRNA2 正義鏈序列為GCGACTGTACACTTGGA AATG，反義鏈序列為CATTTCCAAGTGTACAGTCG C；GAD-siRNA3 正義鏈序列為CCAAGGGUAUGAAU GGCUUTT，反義鏈序列為AAGCCAUUCAUACCCUU GGTT；NC siRNA 正義鏈序列為AUCGGCUACCAAG UCAUACTT，反義鏈序列為GUAUGACUUGGUAGCC GAUTT，引物及siRNA 均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。
1.3 最佳siRNA 及其轉(zhuǎn)染劑量的篩選將無菌的旋毛蟲肌幼蟲（后均簡(jiǎn)寫為肌幼蟲）分為siRNA1、siRNA2、siRNA3、NC siRNA 和PBS 等5 組，分別置于RPMI 1640 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，參照文獻(xiàn)[8]，采用浸染法利用2 μL Lipofectin 2000 分別與終濃度為2 μmol/L的siRNA1、siRNA2、siRNA3、NC siRNA 和等體積的PBS 轉(zhuǎn)染各組肌幼蟲，篩選出最佳干擾的siRNA。
將旋毛蟲各組培養(yǎng)板置于37 ℃5%CO2培養(yǎng)12 h后，收集蟲體，利用TRIzol 法提取各組肌幼蟲總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 作為模板，以GAPDH 基因?yàn)閮?nèi)參，利用熒光定量PCR 檢測(cè)各組肌幼蟲GAD 基因mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平[4]；將各組蟲體研磨、離心后即獲得了各組肌幼蟲的粗蛋白并經(jīng)SDS-PAGE 電泳，分別以兔源GAD 免疫血清[4]（1∶100）、兔源GAPDH MAb（1∶5 000）為一抗，以羊抗兔IgG-HRP（1∶5 000）為二抗，采用western blot 檢測(cè)siRNA 干擾后GAD 基因表達(dá)水平的變化。根據(jù)上述檢測(cè)結(jié)果初步篩選最佳的siRNA。
將肌幼蟲分為5 組（每組5 000 條），按照上述方法分別以1 μmol/L、2 μmol/L 和4 μmol/L 的劑量轉(zhuǎn)染已篩選出的最佳siRNA，以轉(zhuǎn)染2 μmol/L 的NC siRNA 及等體積的PBS 分別做為陰性對(duì)照和空白對(duì)照，12 h 后更換RPMI 1640 培養(yǎng)液后繼續(xù)在37 ℃5%CO2培養(yǎng)3 d，收集蟲體，采用上述熒光定量PCR 和western blot檢測(cè)各組肌幼蟲GAD基因的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)，以確定最佳siRNA 的最適轉(zhuǎn)染劑量。
1.4 酸環(huán)境對(duì)GAD 基因干擾后的肌幼蟲存活率的影響將肌幼蟲分為最佳siRNA 組、NC siRNA 組和PBS 組，每組設(shè)置3 個(gè)平行孔，每孔300 條肌幼蟲，分別在pH 值2.5、4.0、6.6 和8.0 的培養(yǎng)液中利用浸染法分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)的siRNA 和PBS，在37 ℃、5%CO2分別培養(yǎng)0.5 h、1 h 和2 h 時(shí)經(jīng)顯微鏡觀察蟲體活性，記錄活蟲數(shù)，分析酸環(huán)境對(duì)GAD 基因干擾后肌幼蟲存活率的影響。存活率=（總蟲數(shù)-死亡數(shù)）/總蟲數(shù)×100%。
1.5 不同酸環(huán)境培養(yǎng)GAD 基因干擾后的肌幼蟲GAD 基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)按照1.4 的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分組并轉(zhuǎn)染后分別培養(yǎng)0.5 h、1 h 和2 h 收集蟲體，利用TRIzol 法提取各組肌幼蟲總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH 為內(nèi)參基因，按照1.3 的熒光定量PCR 方法檢測(cè)各組肌幼蟲GAD 基因轉(zhuǎn)錄水平，分析酸性環(huán)境對(duì)誘導(dǎo)GAD 基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。
1.6 不同酸環(huán)境培養(yǎng)GAD 基因干擾后的肌幼蟲培養(yǎng)液中GAD 酶活性及其pH 值的測(cè)定分別收集上述各組肌幼蟲培養(yǎng)0.5 h 后的培養(yǎng)液，參照文獻(xiàn)[4]，采用比色法以不同濃度的GABA 標(biāo)準(zhǔn)液和不同濃度的L-Glu 標(biāo)準(zhǔn)液按等摩爾濃度（如8 mmol/L L-Glu 和2 mmol/L GABA 為一組）的策略組成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以混合后標(biāo)準(zhǔn)液中各GABA 的濃度為橫坐標(biāo)，以混合液對(duì)應(yīng)的OD640nm值為縱坐標(biāo)，建立GABA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。取不同酸性條件下培養(yǎng)的肌幼蟲，研磨、離心制備GAD 粗酶液，測(cè)定OD640nm處的吸收值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得GAD 粗酶液中GABA 的濃度，按照酶活力計(jì)算公式：酶活力=（GAD 粗酶液中GABA 濃度×酶反應(yīng)總體積）/ GABA 的相對(duì)分子質(zhì)量計(jì)算各組培養(yǎng)液中GAD 的酶活性；利用pH 儀檢測(cè)各組肌幼蟲培養(yǎng)液的pH 值，比較肌幼蟲在不同pH 培養(yǎng)前后培養(yǎng)液pH 值的變化，分析干擾GAD 基因表達(dá)后培養(yǎng)液中GAD 酶活性與培養(yǎng)液pH 值的相關(guān)性。
1.7 GAD 基因干擾后的肌幼蟲對(duì)小鼠感染能力及其子代肌幼蟲保姆細(xì)胞影響的檢測(cè)將2 月齡左右的健康BALB/c 小鼠分為3 組，9 只/組。實(shí)驗(yàn)組小鼠分別經(jīng)口接種2 μmol/L siRNA1 和NC siRNA 各2 μL 轉(zhuǎn)染的肌幼蟲（NC 組），設(shè)口服等體積PBS 侵染的肌肉蟲作為空白對(duì)照，接種量均為300 條肌幼蟲。在感染后7 d，通過脫臼法隨機(jī)迫殺各組中的3只小鼠，去除皮毛、內(nèi)臟和脂肪，胴體稱重，搗碎后轉(zhuǎn)移至廣口瓶，利用體外消化法和改良的貝爾曼收集裝置收集成蟲，計(jì)算成蟲減蟲率[4]。減蟲率=（NC 組肌幼蟲感染組的成蟲數(shù)－RNAi 干擾肌幼蟲組的成蟲數(shù)）/NC 組肌幼蟲感染組的成蟲數(shù)×100%。在感染后42 d，采用上述方法收集各組肌幼蟲，計(jì)算肌幼蟲的減蟲率、肌幼蟲的繁殖力指數(shù)（Reproductive capacity index，RCI）和每克肌幼蟲數(shù)（Larvae per gram，LPG）。RCI=接種小鼠后所獲得的幼蟲數(shù)/接種的幼蟲數(shù)；LPG=每克肌肉消化后獲得的幼蟲數(shù)；采用上述方法迫殺每組剩余的3 只小鼠，采集膈肌，經(jīng)固定脫水、透明、石蠟包埋等步驟后制作病理切片，HE染色后，經(jīng)顯微鏡觀察各組肌幼蟲保姆細(xì)胞。
1.8 統(tǒng)計(jì)分析采用GraphPad Prism 5 用于siRNA 轉(zhuǎn)染條件的篩選，采用Excel 統(tǒng)計(jì)并計(jì)算幼蟲的存活率。并采用單因素方差分析法分析組間差異，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié) 果
2.1 最佳GAD-siRNA 及其轉(zhuǎn)染劑量的篩選結(jié)果通過浸染法將終濃度分別為2 μmol/L 的siRNA1、siRNA2、siRNA3 和NC siRNA（NC 組）分別轉(zhuǎn)染至肌幼蟲體內(nèi)，12 h 后分別利用熒光定量PCR 和western blot 檢測(cè)各siRNA 的干擾效果，篩選出最佳干擾的siRNA。結(jié)果顯示，siRNA1、siRNA2、siRNA3 轉(zhuǎn)染組肌幼蟲組GAD 基因轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)于PBS 組分別降低了48.03%、61.14%和83.12%，NC 組與PBS 組肌幼蟲GAD 基因的轉(zhuǎn)錄水平無差異（圖1A）；western blot 結(jié)果顯示，與PBS 和NC 組相比，上述siRNA 轉(zhuǎn)染組肌幼蟲GAD 的表達(dá)量分別降低了43.30%、69.50%和84.80%（P＜0.01），而NC 組GAD 基因轉(zhuǎn)錄水平與PBS 組無顯著差異（圖1C、圖1E，P＞0.05）。表明siRNA1 對(duì)肌幼蟲GAD 基因的干擾效果最好，因此選擇siRNA1 用于后續(xù)試驗(yàn)。
采用浸染法分別將1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L GAD-siRNA1 和2 μmol/L NC siRNA 轉(zhuǎn)染肌幼蟲體內(nèi)培養(yǎng)3 d 后，采用熒光定量PCR 和western blot 檢測(cè)每組GAD 基因的轉(zhuǎn)錄水平和其蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，相對(duì)于PBS組和NC組，1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L siRNA1 轉(zhuǎn)染組GAD 基因轉(zhuǎn)錄水平分別降低79.80%、47.70%和41.20%，NC 組與PBS 組GAD 基因轉(zhuǎn)錄水平無差異（圖1B）；Western blot 結(jié)果顯示，相對(duì)于PBS 組，上述各濃度siRNA1 轉(zhuǎn)染組GAD基因表達(dá)量分別降低了76.80%、49.70%和40.20%（P＜0.01），其中2 μmol/L 和4 μmol/L 的siRNA1 干擾效率均較高，NC 組GAD 基因表達(dá)量與PBS 組無差異（圖1D、圖1F），出于成本考慮選擇2 μmol/L siRNA1 用于后續(xù)試驗(yàn)。
圖1 最佳siRNA及其最佳轉(zhuǎn)染劑量的篩選結(jié)果Fig.1 The screening of the best siRNA and concentration
2.2 酸環(huán)境對(duì)GAD 基因干擾后肌幼蟲存活率的影響將siRNA1 組、NC 組和PBS 組肌幼蟲在不同pH值的培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)0.5 h、1 h 和2 h 時(shí)檢測(cè)肌幼蟲的存活率，結(jié)果顯示，同一pH 值的培養(yǎng)液中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，各組肌幼蟲的存活率均降低，其中siRNA1 組肌幼蟲的存活率明顯低于PBS 組和NC 組（P＜0.05），siRNA1 組在pH2.5 培養(yǎng)2 h 的存活率最低為30%；各組肌幼蟲在pH6.6 時(shí)的存活率最高。NC 組肌幼蟲的存活率則與PBS 組無明顯差異（P＞0.05）（表1）。表明干擾GAD 基因后，肌幼蟲在酸性環(huán)境中的存活率降低。
表1 各組肌幼蟲在不同酸環(huán)境中的存活率檢測(cè)結(jié)果Table 1 The survival rate of muscle larval in different acid medium
2.3 不同酸環(huán)境培養(yǎng)GAD 基因干擾后肌幼蟲GAD基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)結(jié)果將siRNA1 組、NC 組和PBS 組肌幼蟲分別在pH 值為2.5、4.0、6.6 和8.0 的培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)0.5 h、1 h 和2 h 后，經(jīng)熒光定量PCR 檢測(cè)各組肌幼蟲GAD 基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，在相同pH 培養(yǎng)條件下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，siRNA1 組GAD 基因的轉(zhuǎn)錄水平均顯著低于PBS組（P＜0.05）；在相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，與PBS 和NC 組相比，隨著培養(yǎng)液pH 值的減小，siRNA1 組肌幼蟲GAD 基因的轉(zhuǎn)錄水平均升高；siRNA1 組肌幼蟲在pH2.5 時(shí)GAD 基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于其pH6.6時(shí)GAD 基因的轉(zhuǎn)錄水平（P＜0.05），在pH6.6 與pH8.0時(shí)該組肌幼蟲GAD 基因的轉(zhuǎn)錄水平差異不顯著（P＞0.05）；NC 組肌幼蟲GAD 基因的轉(zhuǎn)錄水平無論是在不同的培養(yǎng)條件還是不同的培養(yǎng)時(shí)間均與PBS 組差異不顯著（P＞0.05）（圖2）。表明酸性環(huán)境可以誘導(dǎo)旋毛蟲肌幼蟲GAD 基因轉(zhuǎn)錄水平的升高。
圖2 不同培養(yǎng)時(shí)間和pH值條件下GAD基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Expression of GAD gene under different culture time and pH value
2.4 不同酸環(huán)境培養(yǎng)GAD 基因干擾后的肌幼蟲培養(yǎng)液GAD 的酶活性及其pH 值的測(cè)定結(jié)果將siRNA1 組、NC 組和PBS 組肌幼蟲分別在pH 值為2.5、4.0、6.6 和8.0 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)0.5 h 后，采用比色法繪制GABA 的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和酶活公式計(jì)算各組肌幼蟲培養(yǎng)液中GAD 的酶活性；同時(shí)分別測(cè)定各組肌幼蟲培養(yǎng)液的pH值。結(jié)果顯示，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.1591x+0.0293，相關(guān)系數(shù)R2為0.9912，接近于1，符合線性化標(biāo)準(zhǔn)（圖3A）。經(jīng)計(jì)算結(jié)果顯示，相同pH 條件下，siRNA1 組肌幼蟲培養(yǎng)液中GAD 的酶活性均比PBS 組和NC 組低，且該組肌幼蟲在pH2.5 和pH4.0 時(shí)GAD 的酶活性顯著高于pH6.6 和pH8.0 時(shí)的該酶活性（P＜0.05）；不同pH 值培養(yǎng)條件下NC 組肌幼蟲培養(yǎng)液中GAD 的酶活性均與PBS 組差異不顯著（P＞0.05）（圖3B）。表明干擾GAD 基因后會(huì)降低肌幼蟲GAD 的酶活性，且在酸性條件下該酶活性較高。
pH 值測(cè)定結(jié)果顯示，siRNA1 組肌幼蟲在不同pH 條件下培養(yǎng)后的pH 值均略升高，但均與PBS 組和NC 組培養(yǎng)液的pH 值差異不顯著；且該組在pH 8.0 培養(yǎng)后pH 值略降低，但與兩個(gè)組對(duì)照組差異均不顯著（P＞0.05）（圖3C）。上述結(jié)果也顯示，相同pH 條件下，隨著培養(yǎng)液中肌幼蟲GAD 酶活性的降低，該培養(yǎng)液中的pH 值則略升高，二者呈負(fù)相關(guān)性。表明TGAD 基因干擾后的旋毛蟲肌幼蟲調(diào)節(jié)細(xì)胞外pH 值的能力減弱。
圖3 肌幼蟲在不同pH培養(yǎng)0.5 h后GABA的標(biāo)準(zhǔn)曲線（A）、GAD酶活性（B）和pH值（C）的測(cè)定結(jié)果Fig.3 The GABA standard curve(A),the determination results of GAD enzyme activity(B)and pH(C)of Trichinella spiralis muscle larvae cultured with different pH for 0.5 h
2.5 GAD 基因干擾后的肌幼蟲對(duì)小鼠的感染力及其子代保姆細(xì)胞影響的檢測(cè)結(jié)果小鼠經(jīng)口分別接種siRNA1 組、NC 組和PBS 組肌幼蟲，感染后7 d 和42 d 迫殺各組小鼠后分別收集成蟲及肌幼蟲蟲體，計(jì)算感染后7 d 小鼠機(jī)體成蟲的減蟲率及感染后42 d小鼠機(jī)體肌幼蟲的減蟲率、肌幼蟲的RCI 及LPG（感染后42 d），采集感染后42 d 小鼠的膈肌，制作病理切片并經(jīng)顯微鏡觀察保姆細(xì)胞及其周圍狀態(tài)。結(jié)果顯示，感染后7 d siRNA1 組小鼠機(jī)體旋毛蟲成蟲的減蟲率為31.50%；感染后42 d，該組小鼠機(jī)體肌幼蟲的減蟲率為49.05%；感染后42 d siRNA1 組小鼠機(jī)體肌幼蟲的RCI、LPG 分別為62.51±7.32 和1250.22±146.48，NC 組小鼠肌幼蟲的RCI、LPG 分別為119.03±3.60 和2380.57±71.91，且均與siRNA1 組小鼠差異顯著（P＜0.05），但與PBS 組小鼠機(jī)體肌幼蟲的RCI、LPG 差異均不顯著（P＞0.05）。表明GAD 基因干擾后的旋毛蟲對(duì)宿主體內(nèi)的抗酸能力降低，以至于對(duì)小鼠的感染力也降低。
感染后42 d 小鼠膈肌病理切片的觀察結(jié)果顯示， siRNA1 組小鼠機(jī)體內(nèi)F1 代旋毛蟲保姆細(xì)胞壁周圍存在大量炎性細(xì)胞，保姆細(xì)胞裂解。NC 組和PBS 組肌幼蟲保姆細(xì)胞周圍未觀察到炎性細(xì)胞，且保姆細(xì)胞完整（圖4，箭頭所指為保姆細(xì)胞）。表明GAD 基因干擾后的肌幼蟲抗酸能力降低，對(duì)宿主體內(nèi)免疫系統(tǒng)的抵抗力減弱。
圖4 各組小鼠膈肌中F1代肌幼蟲保姆細(xì)胞的觀察結(jié)果Fig.4 Nurse cells in the diaphragm of mice in each group
3 討 論
胃液作為生態(tài)過濾器呈酸性，可以殺死大部分微生物，因此食源性致病菌必須經(jīng)受極端的酸性環(huán)境才能通過胃進(jìn)入腸道而感染、增殖，最終致宿主疾病的發(fā)生[9]。近年來有很多關(guān)于食源性致病菌抗酸機(jī)制研究，尤以致病性大腸桿菌抗酸系統(tǒng)的研究成果最為顯著。旋毛蟲作為一種食源性病原，其生活史決定旋毛蟲肌幼蟲必須通過宿主極酸的胃環(huán)境，在胃內(nèi)停留數(shù)小時(shí)才能到達(dá)腸道，侵入小腸內(nèi)引起宿主感染致病，這說明肌幼蟲也應(yīng)具有很強(qiáng)抗酸性環(huán)境的能力，但目前其是否存在抗酸機(jī)制尚未見報(bào)道。細(xì)菌耐酸性的判斷依據(jù)是將其接種在pH2.0～pH2.5 的酸性培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h 后檢測(cè)其存活率，若存活率大于10%就認(rèn)定為該細(xì)菌具有抗酸性。本研究的前期預(yù)試驗(yàn)利用熒光定量PCR 方法，檢測(cè)不同酸性條件下培養(yǎng)的肌幼蟲GAD 基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，隨著pH 值的降低，旋毛蟲GAD mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高，在pH2.5 時(shí)GAD mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于pH4.0、pH6.6 和pH9.0 時(shí)的轉(zhuǎn)錄水平，并且培養(yǎng)不同時(shí)間后旋毛蟲GAD mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平也不同，培養(yǎng)1 h 旋毛蟲GAD mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平高于培養(yǎng)0.5 h 和2 h 的轉(zhuǎn)錄水平[4]。研究結(jié)果表明，強(qiáng)酸環(huán)境能顯著誘導(dǎo)旋毛蟲肌幼蟲GAD 基因轉(zhuǎn)錄水平的升高。
RNAi 技術(shù)已被用于確定各種蠕蟲中的特定關(guān)鍵基因，包括曼氏血吸蟲、日本血吸蟲、華支睪吸蟲和旋毛蟲。本研究利用siRNA 干擾旋毛蟲GAD基因的表達(dá)后將其分別置于pH2.5、pH4.0、pH6.6和pH8.0的培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)0.5 h、1 h和2 h后，檢測(cè)旋毛蟲的抗酸性，結(jié)果表明GAD基因干擾后旋毛蟲的抗酸性降低，旋毛蟲的抗酸性與其GAD基因相關(guān)。
AR2 的抗酸能力與細(xì)胞中谷氨酸的含量有關(guān)，當(dāng)谷氨酸含量降低時(shí)，該系統(tǒng)將不能有效調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的pH 值，進(jìn)而會(huì)導(dǎo)致旋毛蟲的死亡。當(dāng)在體外酸性環(huán)境中培養(yǎng)GAD 基因干擾后的旋毛蟲，熒光定量PCR 結(jié)果顯示，pH2.5 時(shí)旋毛蟲GAD 基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于pH6.0 時(shí)GAD 基因的轉(zhuǎn)錄水平，但在pH6.0 的條件下時(shí)旋毛蟲的存活率高于pH2.5 時(shí)的存活率，這說明酸刺激雖然可以誘導(dǎo)GAD 基因的高轉(zhuǎn)錄但并不意味著會(huì)提高旋毛蟲的存活率。GAD 是一種吡哆醛5′-磷酸（PLP）依賴性酶，其活性的最適pH值為3.8～4.6，具有六聚體的晶體結(jié)構(gòu)。在中性pH下，GadB（GAD 酶的一種形式）僅位于細(xì)胞質(zhì)中，而在酸性條件下，它被募集到細(xì)胞膜中，并在此與Glu/GABA/GadC 協(xié)同作用[4]。體外酸性環(huán)境培養(yǎng)GAD基因干擾后的旋毛蟲，培養(yǎng)2 h 后與PBS 組和NC 組相比，其培養(yǎng)液的pH 值升高不明顯。在相同pH 條件下培養(yǎng)旋毛蟲， siRNA1 組旋毛蟲GAD 的酶活性比PBS 組低，且在pH2.5 和pH4.0 時(shí)該組旋毛蟲GAD的酶活性高于pH6.6和pH8.0的該酶活性，結(jié)果證明通過siRNA干擾旋毛蟲的GAD基因會(huì)降低其GAD的酶活性，該酶在酸性條件下的活性高，該結(jié)果與GAD的生物特性相符[5]。利用GAD 基因干擾的旋毛蟲感染小鼠，siRNA1組小鼠的成蟲減蟲率為31.5%，肌幼蟲的減蟲率為49.05%。是因?yàn)榕c兩個(gè)對(duì)照組相比，GAD基因干擾后的旋毛蟲耐受胃部酸性環(huán)境的能力減弱，當(dāng)經(jīng)過胃部時(shí)會(huì)有大量旋毛蟲死亡，因此獲得成蟲和肌幼蟲的數(shù)量減少，因而相應(yīng)的減蟲率會(huì)升高。
保姆細(xì)胞是新生幼蟲侵入宿主肌細(xì)胞后在原肌細(xì)胞的基礎(chǔ)上結(jié)合毛細(xì)血管而形成的一種獨(dú)立的結(jié)構(gòu)，是新生幼蟲在宿主體內(nèi)生存的保護(hù)屏障。siRNA1 組小鼠膈肌的病理切片觀察結(jié)果顯示， GAD 基因干擾后，子代旋毛蟲的保姆細(xì)胞周圍存在大量炎性細(xì)胞，這些炎性細(xì)胞會(huì)破壞保姆細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，使旋毛蟲幼蟲失去保護(hù)屏障，致其存活率降低，這可能與旋毛蟲GAD 基因干擾后的抗酸能力降低，子代肌幼蟲抵抗宿主免疫應(yīng)答的能力減弱有關(guān)。以上結(jié)果均表明GAD 基因干擾后旋毛蟲的抗酸能力減弱，且旋毛蟲的抗酸能力與GAD 基因相關(guān)。
本研究證明siRNA 可以干擾旋毛蟲GAD 基因的表達(dá)，并通過對(duì)GAD 基因干擾后的肌幼蟲體外和體內(nèi)抗酸能力的研究，證明GAD 在旋毛蟲耐受胃酸環(huán)境時(shí)發(fā)揮了重要作用。利用siRNA 干擾技術(shù)能夠使旋毛蟲耐酸能力發(fā)生改變，為預(yù)防旋毛蟲病提供了新思路。
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