三種鐮孢菌對不同苜蓿品種致病性的比較研究

劉東霞， 楊 莉， 宋連昭， 楊志敏， 王 芳， 劉貴河*

(1. 河北北方學(xué)院， 河北 張家口 075000； 2. 張家口市草原監(jiān)理站， 河北 張家口 075000； 3. 河北省張家口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 河北 張家口075000)

苜蓿(Medicagosativa)是廣泛栽培的多年生豆科優(yōu)質(zhì)牧草，素有“牧草之王”的美譽(yù),其不僅含有豐富營養(yǎng)物質(zhì)，而且抗逆性強(qiáng)，可以改良土壤特性，具有良好的生態(tài)效益、經(jīng)濟(jì)效益和社會效益[1]。隨著苜蓿種植面積的增加和種植年限的延長，苜蓿根腐病已成為致使苜蓿植株衰落和產(chǎn)量下降的首要病害。20世紀(jì)70～80年代，加拿大阿爾伯塔的平河地區(qū)和不列顛哥倫比亞省苜蓿種植區(qū)根腐病發(fā)病嚴(yán)重，其中受害面積達(dá)68%[2]。1991和2003年，美國內(nèi)華達(dá)州和猶他州出現(xiàn)苜蓿根腐病。2009—2010年，美國的威斯康星州和明尼蘇達(dá)州發(fā)現(xiàn)苜蓿根腐病，其中7個種植區(qū)受害嚴(yán)重[3-4]。我國自1991年首次報道根腐病以來，先后在新疆、黑龍江、甘肅、內(nèi)蒙古等地陸續(xù)有報道[5-8]。據(jù)在新疆苜蓿根腐病的調(diào)查，根腐病可造成苜蓿死亡率高達(dá)60.08%～73.45%，已經(jīng)成為限制新疆苜蓿生產(chǎn)的主要因素[5]。1999年，黑龍江省8個地市的紫花苜蓿種植區(qū)普遍發(fā)生根腐病，嚴(yán)重地塊發(fā)病率高達(dá)92%[6]。近幾年甘肅草業(yè)異軍突起，苜蓿已成為主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)，苜蓿根腐病發(fā)病日趨嚴(yán)重。甘肅定西2003年5月份根腐病發(fā)病率高達(dá)43%[7]。2013年鄂爾多斯苜蓿越冬死亡率和苜蓿根腐病發(fā)生嚴(yán)重，給當(dāng)?shù)剀俎Ｉa(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失[8]。根腐病對紫花苜蓿生長的各個時期均可造成嚴(yán)重危害,主要導(dǎo)致根的中柱腐爛,根頸和根中部變空,根系分枝數(shù)減少,側(cè)根大量腐爛死亡,使其固氮能力降低,壽命和利用年限明顯縮短[9-10]。據(jù)研究報道，可引起該病的病原已有30種,其中鐮孢菌15種，其他病原真菌12種，細(xì)菌2種，線蟲1種[4,6,7]。我國幅員遼闊，不同地區(qū)氣候和環(huán)境條件差異較大，致使各地區(qū)病原菌種類多樣[11]。2001年陳雅君等對黑龍江省紫花苜蓿根腐病進(jìn)行了調(diào)查和研究，確定了引發(fā)苜蓿根腐病的優(yōu)勢致病菌為鐮孢菌和絲核菌[6,12]。甘肅省引起苜蓿根腐病的病原主要是茄鐮孢(F.solani)、串珠鐮孢(F.moniliforme)、尖孢鐮孢(F.oxysporum)、銳頂鐮孢(F.acuminatum)和半裸鐮孢(F.semitectum)[7,13]。在甘肅武威市首次報道了厚垣鐮孢菌(F.chlamydosporum)可引起苜蓿根腐病[4]。內(nèi)蒙古赤峰市引起苜蓿根腐病的主要病原為擬枝孢鐮孢菌(F.sporotrichioide)[14]，臨河的優(yōu)勢致病菌為三線鐮孢菌(F.tritinctum)和茄鐮孢菌(F.solani)[15]。通過對河北廊坊及山西陽高縣根腐病調(diào)查和病原的分子檢測，發(fā)現(xiàn)河北廊坊根腐病優(yōu)勢致病菌為三線鐮孢菌(F.tritinctum)，山西陽高縣采樣區(qū)的優(yōu)勢致病菌為茄鐮孢菌(F.solani)和層出鐮孢菌(F.proliferatum)。其中，首次報道層出鐮孢菌是可引起苜蓿根腐病的病原菌[15]。魏然等對北疆苜蓿根腐病病原進(jìn)行分子檢測，發(fā)現(xiàn)立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、木賊鐮孢菌(F.equiseti)、銳頂鐮孢菌(F.acuminatum)、茄鐮孢菌(F.solani)和尖孢鐮孢菌(F.oxysporum)在病株樣品中普遍存在，是北疆地區(qū)苜蓿根腐病的主要致病菌[16]。引起苜蓿根腐病的病原菌則以鐮孢菌為主(Fusariumspp.)，其中尖鐮孢(Fusariumoxysporum)、茄鐮孢(F.solani)和燕麥鐮孢(F.avenaceum)等被認(rèn)為是侵染根部的真菌中的優(yōu)勢菌種[12-16]。本研究采用菌液接種和菌餅接種兩種感染方式探究茄鐮孢(F.solani)、尖孢鐮孢(F.oxysporum)和木賊鐮孢(F.equiseti)3種鐮孢菌對苜蓿的致病性，并分析病原菌的病原特征及侵染過程，旨在為綜合防治苜蓿根腐病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用的BF1(F.equiseti)、BF28(F.oxysporum)、BF36-2(F.solani)3個菌株由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供，所有菌株分離自2016年在河北省張家口農(nóng)科院試驗基地采集的苜蓿根腐病樣品，采用常規(guī)組織分離法進(jìn)行病原分離和純化，利用基于DGS(引物CNL12/CNS1)的分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定[17]，菌株來源見表1。苜蓿品選擇河北壩下廣泛種植的品種金黃后(秋眠級2～3)、阿爾岡金(秋眠級2)、WL343(秋眠級4)及南方廣泛種植的WL525(秋眠級8)苜蓿品種。

1.2 試驗地點

苜蓿根腐病病菌侵染試驗在河北北方學(xué)院組培室進(jìn)行。

1.3 試驗方法

1.3.1供試鐮孢菌的生物學(xué)特性研究 為了使菌株接種量和所用菌絲菌齡保持一致，本研究正式進(jìn)行之前將3個供試菌株接種于PDA平板(培養(yǎng)皿直徑為9 cm)上，在25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d后備用[18]。

將3個供試菌株分別重新接種于新的PDA平板上，觀測并比較不同菌株菌落的形態(tài)、生長情況以及產(chǎn)孢量。利用直徑為6 mm的無菌打孔器取菌落邊緣長勢均勻的菌餅，接種于PDA平板中央，每處理重復(fù)3次，放于25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d后，利用十字交叉法測定菌落的直徑，并觀察菌絲的顏色和形態(tài)。培養(yǎng)10 d后，每個培養(yǎng)基平板中加入10 mL無菌水，用無菌毛筆刷輕輕刷擦菌絲，使孢子充分混入無菌水中，再用移液槍從中吸取5 mL注入100 mL容量瓶中，用無菌水定容。將孢子懸浮液滴在血球計數(shù)板(25格×16格)上，利用普通光學(xué)顯微鏡觀察測定各個培養(yǎng)基平板中菌株的產(chǎn)孢量，重復(fù)3次，取其平均值即為產(chǎn)孢量，每個菌株設(shè)置3個重復(fù)[18]。產(chǎn)孢量的計算公式如下：

(1)

1.3.2鐮孢菌菌液接種致病性觀測 試驗為紫花苜蓿品種和病菌種類兩個因素，紫花苜蓿品種分別為金皇后、阿爾崗金、WL525、WL343。菌種分別為BF1(F.equiseti)、BF28(F.oxysporum)、BF36-2(F.solani)。將供試菌種接種到經(jīng)過滅菌消毒處理的固體PDA培養(yǎng)基中，放入25℃光照培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。

分別從4個供試苜蓿品種中選取籽粒飽滿的健康種子，將種子于無菌水中浸泡24 h，用75%的乙醇浸泡30 s，再用0.1%的HgCl處理10 min[19]。然后接種于MS培養(yǎng)基中，每瓶接種20粒苜蓿種子，每個品種接種20瓶，將接種好的組培瓶放入25℃，光照14 h/黑暗10 h的光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)20 d，待長出完整的葉片和根系后進(jìn)行病原接種侵染試驗。

利用1 cm的無菌打孔器從BF1、BF28、BF36-2三種菌落邊緣打取長勢均勻的菌餅置于無菌培養(yǎng)皿中，然后用移液槍移入5 mL PDB(馬鈴薯葡萄糖水)液體培養(yǎng)基，用毛筆將表面的孢子及菌絲體刷至液體培養(yǎng)基中，使其充分落入液體培養(yǎng)基中，再將液體培養(yǎng)基菌液分別接種到金皇后、阿爾岡金、WL525、WL343苜蓿無菌苗組培瓶中，共12個處理，每個處理重復(fù)3次。對苜蓿組培苗的感病情況進(jìn)行觀察記錄。

1.3.3菌餅接種致病性觀測 菌種及苜蓿組培苗的培養(yǎng)同菌液接種方法。利用1 cm的無菌打孔器從BF1、BF28、BF36三種菌落邊緣打取長勢均勻的菌餅倒置于無菌金屬網(wǎng)盤中央，再將金屬網(wǎng)盤分別置于金皇后、阿爾岡金、WL525、WL343苜蓿無菌苗組培瓶的頂部。共12個處理，每個處理重復(fù)3次。觀察并記錄苜蓿組培苗的感病情況。幼苗感病率的計算公式如下：

(2)

從接種菌餅的處理中取出不同感染程度的苜蓿，用刀片從感病苜蓿葉片、根部或根頸部切取材料制成臨時玻片放于普通光學(xué)顯微鏡下觀察苜蓿組織感染狀況及病原特征。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

試驗記錄的數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，比較不同水平之間的差異，多重比較采用LSD法。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試鐮孢菌菌落直徑及產(chǎn)孢量比較

供試鐮孢菌的菌落直徑及產(chǎn)孢量統(tǒng)計結(jié)果見表2。結(jié)果表明，尖孢鐮孢菌株BF28的菌落直徑較大，達(dá)到5.45 cm。茄鐮孢菌株BF36-2和木賊鐮孢菌株BF1菌落直徑較小，分別為4.68 cm和4.67 cm，三個菌種在菌落直徑上差異不顯著。尖孢鐮孢BF28與茄鐮孢BF36-2在PDA培養(yǎng)基上都能產(chǎn)生鐮刀狀孢子，其中，BF28產(chǎn)孢量最多，BF36-2次之，BF1產(chǎn)生的孢子量較少。3種鐮孢菌產(chǎn)孢量存在顯著差異(P<0.05)。

表2 三種鐮孢菌菌落直徑與產(chǎn)孢量統(tǒng)計

2.2 三種鐮孢菌的菌落形態(tài)特征觀察

不同菌種外部形態(tài)、顏色等存在較大差異(圖1)。BF28菌落表面氣生菌絲稀疏，無色呈羊毛狀，質(zhì)地均勻，表面有明顯的輪狀，邊緣較整齊，顏色與中心顏色不一致，較透明，菌落為規(guī)則的圓形。BF36-2菌落正面氣生菌絲為白色或乳白色呈致密的氈狀，表面粗糙干燥，有明顯的白色輪狀，邊緣粗糙淡黃色，與中心顏色不一致，不透明，菌落為規(guī)則圓形。BF1菌落正面菌絲繁茂呈致密的絲柔狀，粉色，菌落厚，邊緣粗糙，與中心顏色不一致，有部分呈淡粉色近白色，不透明，菌落近圓形。

圖1 3種菌株的菌落形態(tài)特征圖

2.3 菌液接種的苜蓿組培苗感病率

苜蓿組培苗菌液接種后感病較快，接種3 d后，各個處理的培養(yǎng)基上均出現(xiàn)明顯菌絲，BF1菌絲體分布不均勻，菌絲聚集于根系附近(圖2A)，而BF28和BF36-2菌絲均勻分布在培養(yǎng)基上。苜蓿植株也開始出現(xiàn)感病癥狀，根系褐化。有相關(guān)研究表明，當(dāng)病原菌的生長環(huán)境適宜時，距離寄主根部很近或與根部直接接觸的鐮孢菌病原分生孢子受到根冠細(xì)胞分泌的碳或氮等營養(yǎng)物質(zhì)的刺激，開始萌發(fā)形成芽管或菌絲[20]。

圖2 菌液接種后感病苜蓿癥狀

接種5 d后BF28和BF36-2處理病原菌菌絲布滿整個培養(yǎng)基(圖2D和圖2E)，BF1菌絲除了在苜蓿根系處密集分布外，菌絲也遍布整個培養(yǎng)基(圖2B和圖2C)，苜蓿根系表現(xiàn)出明顯的感病癥狀，地上部癥狀不明顯。接種一周后，所有處理菌絲體密布培養(yǎng)基表面，形成較厚的毛氈層，苜蓿植株體表現(xiàn)出明顯的感病癥狀，葉片失綠，黃化，萎蔫，根系嚴(yán)重褐化，植株倒伏。接種11 d后所有處理的植株全部倒伏，腐爛，植株被菌絲包埋(圖2F、圖2G、圖2H)。苜蓿各品種之間未見顯著差異(P>0.05)。

2.4 菌餅接種的苜蓿組培苗感病率

苜蓿單株感病特征見圖3。從圖3A與圖3B的外部形態(tài)觀察到感病苜蓿植株出現(xiàn)根頸縊縮、腐爛、主根皮層變色腐爛，分枝減少，病部呈褐色或紅褐色等癥狀，而地上部分在發(fā)病初期并未表現(xiàn)明顯的感病癥狀，后期地上部則出現(xiàn)生長不良，植株矮小，細(xì)弱，葉片由外向內(nèi)逐漸變黃，莖干萎蔫，之后整株倒伏，最終枯死。

圖3 病株根腐病癥狀

苜蓿組培苗接種菌餅后，菌絲體垂直向下生長。14 d以后，接種BF28各個處理的培養(yǎng)基上均出現(xiàn)明顯菌絲團(tuán)，被菌絲包圍的植株感病癥狀明顯，根頸褐化腐爛，葉片出現(xiàn)黃色病斑，植株倒伏(圖4A)。BF36接種的WL343苜蓿品種培養(yǎng)基上出現(xiàn)菌絲團(tuán)(圖4B)，而其他三個苜蓿品種未出現(xiàn)菌絲體。BF36接種的WL525苜蓿品種雖然培養(yǎng)基上未出現(xiàn)菌絲體，但苜蓿植株表現(xiàn)出明顯的感病癥狀，主要表現(xiàn)為苜蓿根頸部及植株基部莖節(jié)嚴(yán)重褐化，上部葉片失綠黃化(圖4C)。BF1各處理未出現(xiàn)菌絲團(tuán)，苜蓿感病癥狀不明顯。接種1個月后，接種BF1的各處理培養(yǎng)基上未出現(xiàn)菌絲團(tuán)，苜蓿植株開始出現(xiàn)感病癥狀，根頸部褐化甚至腐爛，葉片也出現(xiàn)黃色病斑。

圖4 菌餅接種后感病苜蓿癥狀圖

接種BF28及BF36的處理于接種14 d統(tǒng)計其感病植株，計算感病率；接種BF1的處理于接種30天后統(tǒng)計其感病植株，并計算感病率，統(tǒng)計結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，供試的三種菌株的感病率存在顯著性差異(P<0.05)。其中，菌株BF28對苜蓿侵染致病最為嚴(yán)重，各苜蓿品種感染率均在70%以上；菌株BF36-2對苜蓿的侵染致病程度僅次于BF28菌株，感染率在50%～70%之間；菌株BF1的侵染致病程度較前兩種小，感染率在40%以下。菌種的致病性與菌落直徑及其產(chǎn)孢能力有關(guān)，產(chǎn)孢量大的菌種，菌落直徑也較大，繁殖能力強(qiáng)，致病性也較強(qiáng)。

圖5 菌餅接種方式下三種鐮孢菌株對苜蓿的感染率

2.5 苜蓿感病部位解剖結(jié)構(gòu)觀察

為進(jìn)一步了解病菌的侵染過程，對感病植株的葉片和根部進(jìn)行了組織切片觀察。侵染初期，苜蓿病葉組織周圍存在大量厚垣孢子，大孢子分生出小孢子，附著在葉片組織表面，通過傷口或氣孔侵入，并沿著細(xì)胞間隙不斷向深層組織蔓延，厚垣孢子受到葉肉細(xì)胞的擠壓，形成了許多不規(guī)則厚垣孢子(圖6A，圖6B)?；蛘咝℃咦用劝l(fā)形成菌絲或芽管，伸入葉肉組織，并向葉肉組織釋放細(xì)胞壁溶解物，致使葉肉細(xì)胞分解，形成潰爛病斑(圖6C)。

侵染中后期，厚垣孢子快速分生，形成大量厚垣孢子，集聚于葉肉組織中(圖6D)，并萌發(fā)形成大量菌絲(圖6E)，菌絲在葉肉組織中形成縱橫交錯的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，葉肉細(xì)胞葉綠體受損，葉片失綠，在葉片組織中積累了大量的黃褐色病原菌代謝物，致使葉片褐化腐爛(圖6F)。

圖6 病葉組織切片

從圖7A至圖7F的苜蓿根系組織切片中可以看出，發(fā)病初期鐮孢菌的厚垣孢子或菌絲體侵入苜蓿根頸部的表皮組織，致使苜蓿根頸表皮組織產(chǎn)生褐色壞死斑。隨著時間的推移，厚垣孢子或菌絲體不斷分生并向組織內(nèi)部入侵至根的中柱層，導(dǎo)致根部中柱腐爛變?yōu)樯詈稚?，根頸和根中部變空。隨著菌絲的快速繁殖，根部布滿菌絲，使得根系表層出現(xiàn)白色霉菌層。病原侵入根部致使維管束內(nèi)的導(dǎo)管與篩管組織被破壞，使根系失去吸收水分與營養(yǎng)物質(zhì)的能力，不能為植株地上部分提供生長所需水分與營養(yǎng)，根頸變色溢縮，植株出現(xiàn)生長不良，矮小等癥狀。失去水分的莖干則漸漸變軟萎蔫，葉片逐漸黃化，嚴(yán)重者則出現(xiàn)整株倒伏，枯死現(xiàn)象。

圖7 病株根部組織切片

3 討論

不同苜蓿品種對鐮刀菌的抗性不同，主要與苜蓿的秋眠等級、抗寒性及根系特點有關(guān)。丁守彥[21]和李敏權(quán)[22]分別對不同苜蓿品種抗病性進(jìn)行鑒定，得出苜蓿品種間抗病性差異顯著，篩選出德里蘭德、新疆大葉、苜蓿王、草原2號、阿爾岡金、圖牧2號和甘農(nóng)2號等抗性較強(qiáng)的品種。Michand在加拿大魁北克省用適合于當(dāng)?shù)氐?4個紫花苜蓿品種進(jìn)行的抗鐮孢菌根腐病研究，結(jié)果顯示，所有品種都感染了根腐病，品種間抗病性差異顯著，抗寒品種根腐爛程度要比中等抗寒品種輕[23]。鄧蓉對不同來源的19個苜蓿品種的抗病性研究，也得出相似結(jié)論，苜蓿對根腐病的抗性與苜蓿的秋眠特性有關(guān)，秋眠數(shù)高的品種抗病性強(qiáng)，秋眠數(shù)低的品種易感染根腐病[24]。而本研究中，不同秋眠級苜蓿品種間抗病性差異不顯著。陳雅君等認(rèn)為選育根系生長迅速、側(cè)根發(fā)達(dá)、能有效地制造和貯存糖類及其他養(yǎng)分、忍耐逆境能力強(qiáng)的紫花苜蓿品種可有效地減輕和控制根腐病的發(fā)生[12]。本研究的四個苜蓿品種在根系類型上存在較大差異，四個苜蓿品種在致病力方面未發(fā)現(xiàn)顯著差異，可能是由于侵染階段處于幼苗階段，根系之間的差異還沒有表現(xiàn)出來。另外，選擇的品種較少，代表性不夠，不同品種對鐮孢菌的抗性還有待進(jìn)一步研究。

有關(guān)鐮孢菌入侵過程研究較少，目前研究認(rèn)為，病菌能夠成功侵染寄主植物最關(guān)鍵的是寄主與病原物的信號識別。病菌入侵階段，根系分泌物為根際微生物提供所需的能源，影響病原菌的定植和生長，從而導(dǎo)致根際微生物的數(shù)量和種群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[25]。楊瑞秀的研究表明,甜瓜根系分泌物中酚酸物質(zhì)對尖孢鐮孢菌菌絲生長和孢子萌發(fā)有不同程度的促進(jìn)作用，丁香酸、阿魏酸、肉桂酸、苯甲酸與尖孢鐮孢菌的協(xié)同作用比較明顯[25]。根系分泌物還對不同鐮孢菌有選擇性，相關(guān)研究表明，番茄根系分泌物能促進(jìn)茄鐮孢分生孢子的萌發(fā)[26]，而對尖鐮孢的生長幾乎沒有選擇性[27]。本研究也得出類似的結(jié)論，苜蓿根系分泌物對木賊鐮孢BF1具有親和性，侵染初期菌絲在苜蓿根系附近聚集。而苜蓿分泌物對尖孢鐮孢和茄鐮孢不具有親和性，根系附近沒有菌絲的聚集，而是均勻的分布在整個培養(yǎng)上。Herman等利用GFP基因標(biāo)記甜瓜尖鐮孢，發(fā)現(xiàn)接種1～2 d病原菌在甜瓜根毛聚集，其認(rèn)為根系分泌的碳氮營養(yǎng)有關(guān)，在距離根系較近的分生孢子受到根根冠細(xì)胞分泌的碳、氮營養(yǎng)的刺激，開始萌發(fā)產(chǎn)生大量的芽管和菌絲[28]。根系分泌物對病原菌的選擇和促進(jìn)作用使得病原菌首先在根系中定植和生長。在本研究中，菌餅接種于組培瓶頂部，菌絲先接觸到苜蓿葉片，但苜蓿出現(xiàn)感病癥狀則是從苜蓿根頸部開始，而且根部癥狀更為明顯，這可能也與苜蓿根系分泌物對鐮孢菌有選擇親和性有關(guān)。孫惠芳等研究了茄鐮孢菌對鐵皮石斛的致病性，結(jié)果表明茄鐮孢對石斛根部的致病性比葉部更為嚴(yán)重，癥狀更為明顯，與本研究的結(jié)果一致[29]。

在不同栽培基質(zhì)及接菌方式下，鐮孢菌的侵染速度和引起發(fā)病程度不同。Charest等通過原位顯微技術(shù)研究水培條件下番茄尖鐮孢菌侵染寄主的過程，發(fā)現(xiàn)接種1 d后菌絲就能侵入根部，侵染速度比土培條件下快，在土壤中孢子需要時間感受到根生長的信號，然后萌發(fā)，再到根表面，而水培的菌絲或孢子直接接觸根表面[30]。在本研究中，在不同的接菌方式下，以菌液方式接種的無菌苗處理3天便出現(xiàn)了感病癥狀，5 d菌絲布滿培養(yǎng)基表面，接種11 d所有接種的無菌苗處理全部倒伏，腐爛；而以菌餅方式接種的無菌苗14 d時才出現(xiàn)感病癥狀。分析其原因，可能是菌液方式下的濕度要明顯大于菌餅中的濕度，環(huán)境濕度越大越有利于菌絲的生長，根頸表面會迅速產(chǎn)生白色霉層；菌餅置于培養(yǎng)瓶的瓶口距植物培養(yǎng)基有一定距離，孢子及菌絲需要經(jīng)過一定時間的生長、繁殖才能掉落到底部培養(yǎng)基上，進(jìn)而感知根系信號的誘導(dǎo)而萌發(fā)。病原菌侵染苜蓿試驗常采用米粒法、浸根法、注射法等接菌方法，大都模擬了土壤環(huán)境。本研究菌餅接種采用金屬網(wǎng)架法，則模擬了大氣環(huán)境條件下鐮孢菌的入侵過程。

寄主植物與病原菌之間相互作用體系較為復(fù)雜，關(guān)于鐮孢菌侵染過程的研究主要集中在細(xì)胞壁降解酶和寄主植物防御酶上[31-33]。一方面，病原菌要突破細(xì)胞壁進(jìn)入植物體，首先需要分泌細(xì)胞壁降解酶，通過酶解植物多糖來破壞和分解細(xì)胞壁，以提供病原菌自身營養(yǎng)并促進(jìn)其對寄主組織的侵入和擴(kuò)展[31]。目前,已研究發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞壁降解酶十余種。主要包括羧甲基纖維素酶、多聚半乳糖醛酸酶、果膠甲基半乳糖醛酸酶和β-葡萄糖苷酶。不同的鐮孢菌之間，在同一培養(yǎng)條件下，產(chǎn)生的同種細(xì)胞壁降解酶活性差異很大，其中強(qiáng)致病菌株接骨木鐮孢和燕麥鐮孢菌在植物體內(nèi)培養(yǎng)條件下，細(xì)胞降解酶的活性較高，而弱致病菌株擬枝鐮孢菌和擬絲孢鐮孢菌產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶活性較低[34]。在本研究中通過解剖構(gòu)造觀察，發(fā)現(xiàn)木賊鐮孢BF1通過菌絲或厚垣孢子在根、葉部細(xì)胞間隙中擴(kuò)展，而寄主植物細(xì)胞較為完整，組織機(jī)體的損傷較小。而受尖孢鐮孢BF28侵染的葉片組織則出現(xiàn)了較為嚴(yán)重的細(xì)胞壁解離，組織潰爛。這可能與致病菌株產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶的種類和活性有關(guān)。曹麗霞的研究也表明，不同的鐮孢菌對苜蓿的致病性存在較大差異，茄鐮孢和尖孢鐮孢致病性較強(qiáng)[35]。另一方面，植物受病原菌或毒素侵染后，為抵抗病原菌的侵入和危害，體內(nèi)自發(fā)產(chǎn)生應(yīng)激防御機(jī)制，并伴隨著一些列生理生化變化，如體內(nèi)防御酶的變化。防御酶通常被作為對真菌和細(xì)菌病害的防御作用的抗性指標(biāo)。馬靜芳等報道，苜蓿根腐病抗性強(qiáng)的品種丙氨酸解氨酶的活性高于感病品種，可用該酶的活性指標(biāo)來測定品種的抗病性[36]。病原菌侵入寄主植物后，毒素可以降低植物體內(nèi)防御酶的活性，導(dǎo)致活性氧過量積累，從而對寄主細(xì)胞造成破壞[37]。不同病原菌對植物組織破壞解離程度不同，可能與病原菌對植物體內(nèi)防御酶活性的改變有關(guān)。

有些病原菌在致病過程中會分泌一些毒性物質(zhì)，而這些有毒物質(zhì)會通過改變細(xì)胞間的營養(yǎng)、細(xì)胞膜的透性而使得細(xì)胞的代謝紊亂、活力降低、液泡破裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，植物表現(xiàn)出萎蔫、壞死和病斑。已報道的鐮孢菌毒素有多種，主要包括單端孢霉烯族化合物、玉米赤霉烯酮、丁烯酸內(nèi)酯、串珠鐮刀菌素、伏馬菌素等[31，38-40]。臺蓮梅等用2個濃度的尖鐮孢菌粗毒素處理大豆胚根，結(jié)果表明，毒素處理后，胚根細(xì)胞質(zhì)壁分離；質(zhì)膜、線粒體膜、核膜、液泡膜局部斷裂；細(xì)胞壁變形、斷裂、有的細(xì)胞解體[41]。毒素濾液對苜蓿種子萌發(fā)和胚根生長具有明顯抑制作用，并對苜蓿幼苗具有很強(qiáng)的致萎性[32,42]。關(guān)于鐮孢菌產(chǎn)生的毒素類型、致毒力以及其與侵染過程中寄主組織受損程度之間的相關(guān)關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

尖孢鐮孢和茄鐮孢菌絲生長快，菌落直徑大，產(chǎn)孢量大，致病性強(qiáng)。菌液接種苜蓿組培苗感病快，菌餅接種方式感病較慢。根頸部感病快，感病程度嚴(yán)重。病原菌從根或根頸部入侵，根部組織腐爛壞死，進(jìn)而葉片腐爛，倒伏，最終整株死亡。不同菌種侵染途徑及與根系的互作機(jī)制不同,木賊鐮孢BF1菌絲在根系附近聚集；而尖孢鐮孢BF28及茄鐮孢BF36-2則菌絲在培養(yǎng)基上均勻分布。菌種與根系的互作機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。