豬源腸外致病性大腸桿菌抗體間接ELISA檢測方法的建立

程家園，李 亮，邢 剛，劉雪蘭，孫 裴，魏建忠，李 郁

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，安徽 合肥 230036；2.馬鞍山史記動物健康管理有限公司，安徽 馬鞍山 238251）

大腸埃希氏菌（Escherichia coli, E.coli）俗稱大腸桿菌，根據(jù)E.coli致病性特征以及發(fā)病機制的不同，可將其分為共生型E.coli、腸內(nèi)致病型E.coli和腸外致病型E.coli[1]。腸外致病性E.coli（Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli,ExPEC）是一組異質(zhì)類E.coli，不僅可正常定植于人和動物的腸道，而且能侵入機體引起菌血癥，并誘發(fā)敗血癥或局部腸道外感染，如腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎、心內(nèi)膜炎等。養(yǎng)豬生產(chǎn)中常使用抗生素防治大腸桿菌病，但隨著抗生素的不合理使用，ExPEC耐藥菌株日漸增多，故在減抗、限抗和禁抗已成為養(yǎng)殖行業(yè)發(fā)展趨勢的背景下，疫苗免疫不失為一種有效策略。當前市面上暫無豬源ExPEC商品化疫苗，研發(fā)有效的疫苗對于防控豬源ExPEC感染至關(guān)重要。豬源ExPEC血清型眾多，不同血清型之間的交叉免疫能力較弱。疫苗的合理選擇及其免疫效果的科學評價將是有效預(yù)防該病以提高生產(chǎn)效益的重要環(huán)節(jié)?？贵w檢測不僅能掌握豬群中ExPEC免疫抗體的消長情況和評估疫苗免疫的效果，而且有助于對未經(jīng)疫苗免疫的豬群進行ExPEC感染的調(diào)查和診斷。因此，建立和應(yīng)用一種快速、敏感且特異的檢測豬源ExPEC抗體的方法意義顯著。

用于檢測E.coli抗體的方法有試管凝集試驗、間接血凝試驗和玻板凝集試驗等。試管凝集試驗工作量大，且需大量凝集抗原和動物血清，費時費力；間接血凝試驗操作步驟繁瑣、穩(wěn)定性差、成本耗費較高；玻板凝集試驗雖操作簡單，但僅適用于定性檢測而不適用于定量檢測。微量凝集試驗（Microagglutination Test, MAT）是對試管凝集試驗的改良，具有微量、簡便、穩(wěn)定性和特異性好等特點，但其結(jié)果主要是依靠肉眼觀察判定結(jié)果，具有一定的主觀性[2]。而酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay, ELISA）則具備成本低、敏感性強、特異性好、準確性高、能定量檢測血清中抗體水平的特點[3]。本研究將豬源ExPEC超聲裂解所得菌體蛋白包被酶標板，建立了基于豬源ExPEC全菌體蛋白的間接ELISA抗體檢測方法，為豬源ExPEC抗體檢測和血清流行病學調(diào)查提供了技術(shù)儲備。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

試驗于2021年6月18日在安徽農(nóng)業(yè)大學動物傳染病實驗室進行。

1.2 菌株、血清和培養(yǎng)基

豬源ExPEC血清O38型（編號為SDjie18-10）、O127型（編號為HByan18-2）受試菌株，安徽農(nóng)業(yè)大學動物傳染病實驗室分離鑒定和保存；豬源ExPEC O38型及O127型、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）、產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（STEC）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）陽性血清、豬源ExPEC O38型及O127型陰性血清，安徽農(nóng)業(yè)大學動物傳染病實驗室制備和保存；副豬嗜血桿菌4型（Haemophilus parasuis 4, HPS4）陽性血清，鄭州百基生物科技有限公司；豬鏈球菌2型（Streptococcus suis 2, SS2）陽性血清，馬鞍山史記動物健康管理有限公司惠贈；豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus 2, PCV2）、豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies Virus, PRV）、豬瘟病毒（Classical Swine Fever Virus, CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcinereproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV）陽性血清均來自IDEXX公司相應(yīng)的ELISA檢測試劑盒；臨床檢測應(yīng)用的豬血清樣品采自安徽地區(qū)部分豬場；LB肉湯，紹興天恒生物科技有限公司。

1.3 主要試劑和儀器

牛血清蛋白（BSA），生工生物工程（上海）股份有限公司；脫脂奶粉，Sigma公司；HRP標記羊抗豬IgG抗體，Solarbio公司；酶標板，Corning公司；全波長酶標儀，美國博騰公司。

1.4 豬源ExPEC凝集抗原的制備

將滅活的豬源ExPEC血清O38型（編號為SDjie18-10）、O127型（編號為HByan18-2）菌株等體積混合制備凝集抗原用于MAT[4]。

1.5 豬源ExPEC陽性血清的制備

將臨床送檢的豬血清通過MAT進行豬源ExPEC O38型、O127型陽性血清的篩選[5]，判定結(jié)果為陽性的豬血清置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 豬源ExPEC抗體間接ELISA檢測方法的建立

1.6.1 豬源ExPEC全菌體蛋白的制備 將培養(yǎng)至穩(wěn)定期（培養(yǎng)8 h）的受試菌株等體積混合，經(jīng)8 000 r/min離心10 min后收集菌體，加入10 mL滅菌PBS（pH=7.4）重懸沉淀，同時采用超聲波破碎的方式充分釋放菌體抗原。將破碎后的菌體經(jīng)8 000 r/min離心10 min，取上清液置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 間接ELISA操作步驟 將包被液（pH=9.6的碳酸鹽緩沖液）稀釋后的全菌體蛋白（20 μg/mL）以100 μL/孔包被酶標板，4 ℃過夜，棄去包被液；PBST洗滌后（洗板3次，每次加入洗滌液200 μL，振蕩1 min），每孔加入200 μL 0.5%脫脂奶粉，37 ℃封閉2 h后PBST洗滌；將陽性血清用PBST稀釋至1∶1 600加入孔內(nèi)，同時設(shè)立豬源ExPEC陰、陽性血清對照，37 ℃作用1 h后，PBST洗滌；每孔加入100 μL羊抗豬IgG（1∶3 000稀釋），37 ℃作用1 h，PBST洗滌；每孔加入100 μL TMB顯色液，37 ℃避光顯色10 min；每孔加入100 μL H2SO4終止反應(yīng)，于450 nm波長讀取OD值并計算P/N值（P：待檢血清OD450nm值；N：陰性對照OD450nm值）[6]。每種反應(yīng)條件作3個重復(fù)，取其平均值，以P/N值最大的孔所對應(yīng)的優(yōu)化條件為最佳[7]。

1.6.3 最佳抗原包被濃度和血清稀釋度的確定 采用方陣滴定法確定最佳抗原包被濃度和血清稀釋度。以pH=9.6的碳酸鹽緩沖液將豬源ExPEC全菌體蛋白稀釋至終濃度分別為20.0、15.0、10.0、5.0 μg/mL，每孔100 μL包被96孔酶標板，4 ℃過夜。豬源ExPEC陽性血清和陰性血清均按1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400倍比稀釋后進行方陣滴定試驗，測定OD450nm，計算P/N值以確定最佳抗原包被濃度和血清稀釋度。

1.6.4 最佳抗原包被條件的確定 以最佳的抗原濃度進行包被，將包被條件分成5種：37 ℃ 2 h+4 ℃過夜、37 ℃ 1 h+4 ℃過夜、4 ℃過夜、37 ℃ 2 h及37 ℃ 1 h，分別按照間接ELISA抗體檢測方法的程序進行操作，測定OD450nm，計算P/N值以確定最佳抗原包被條件。

1.6.5 最佳封閉液及封閉時間的確定 以最佳的抗原包被濃度和條件包被酶標板，分別以1%BSA、2%BSA、5%脫脂奶粉、5%胎牛血清為封閉液，按照間接ELISA操作程序篩選出最佳封閉液。將該封閉液分別于37 ℃封閉1 h、2 h、3 h后進行間接ELISA抗體檢測，測定OD450nm，計算P/N值以確定最佳封閉時間。

1.6.6 最佳血清作用時間的確定 按照確定好的最佳條件依次進行包被、封閉、加入血清，分別在37 ℃作用 30、45、60、75 min后進行間接ELISA抗體檢測，測定OD450nm，計算P/N值以確定最佳血清作用時間。

1.6.7 最佳酶標二抗?jié)舛燃白饔脮r間的確定 加入血清后，將羊抗豬IgG-HRP分別進行1∶3 000、1∶5 000、1∶10 000、1∶15 000稀釋后進行間接ELISA檢測。確定最佳酶標二抗?jié)舛群笥?7 ℃分別孵育30、45、60、75 min，按照間接ELISA方法步驟進行抗體檢測，測定OD450nm，計算P/N值以確定最佳酶標二抗作用時間。

1.6.8 最佳顯色時間的確定 按照篩選的最佳條件進行間接ELISA抗體檢測，加入TMB顯色液后分別于37 ℃避光顯色5、10、15 min，測定OD450nm，計算P/N值以確定最佳顯色時間。

1.6.9 臨界值的確定 按照上述優(yōu)化的方法檢測30份已知豬源ExPEC抗體陰性血清，測定其OD450nm值，計算平均值（X）和標準方差（SD），以O(shè)D450nm≤X+3SD作為陰性判定標準，OD450nm>X+3SD作為陽性判定標準。

1.7 特異性試驗

采用優(yōu)化的方法檢測E T E C、S T E C、Salmonella、HPS、SS、PCV2、PRV、CSFV、PRRSV陽性血清，同時設(shè)立豬源ExPEC陽性血清和陰性血清作對照，以評估該方法的特異性。

1.8 敏感性試驗

將豬源ExPEC陽性血清用PBST按照1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200、1∶102 400稀釋，利用優(yōu)化的方法進行抗體滴度的檢測，以評估該方法的敏感性。

1.9 重復(fù)性試驗

取3份豬源ExPEC陽性血清和3份豬源ExPEC陰性血清樣品，用同一批次的豬源ExPEC全菌體蛋白包被酶標板，對該6份血清樣品進行ELISA檢測，每份樣品重復(fù)3次操作，結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，以檢測批內(nèi)重復(fù)性；相同條件下，使用3個不同批次包被的酶標板分別檢測該6份血清樣品，結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，以檢測批間重復(fù)性。

1.10 符合率試驗

應(yīng)用建立的間接ELISA方法對30份未經(jīng)豬源ExPEC疫苗接種的豬血清樣品進行抗體檢測，同時與MAT作平行比較，計算符合率以考察該方法的可靠性。符合率=（陽性結(jié)果相同樣本數(shù)+陰性結(jié)果相同樣本數(shù)）/總樣本數(shù)×100%。

1.11 臨床豬血清樣品的感染抗體檢測

利用建立的間接ELISA和MAT對安徽10個地市200份未經(jīng)豬源ExPEC疫苗接種的豬血清樣品進行感染抗體檢測，以驗證該方法的應(yīng)用性。

1.12 統(tǒng)計分析

采用單因素ANOVA檢驗和Kappa檢驗對結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬源ExPEC陽性血清制備

由圖1可見，96孔微量反應(yīng)板A、B孔邊緣有明顯的凝集片，與C、D孔（對照孔）的圓點有明顯的區(qū)別，A、B孔加入的血清即為豬源ExPEC陽性血清。

圖1 豬源ExPEC陽性血清制備結(jié)果

2.2 豬源ExPEC抗體間接ELISA檢測方法的建立

2.2.1 間接ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化 通過確定最佳抗原包被濃度、溫度和時間，最佳血清稀釋度和作用時間，最佳封閉液和封閉時間，最佳酶標二抗?jié)舛群妥饔脮r間，以及最佳顯色時間等一系列試驗，優(yōu)化了間接ELISA的反應(yīng)條件，具體如下：包被抗原濃度為15 μg/mL，37 ℃ 1 h+4 ℃過夜；2%BSA于37 ℃封閉2 h；血清稀釋度為1∶800，37 ℃孵育30 min；酶標二抗稀釋度為1∶5 000，37 ℃作用30 min；顯色時間為37 ℃ 15 min。

2.2.2 臨界值的確定 按照上述優(yōu)化的方法檢測30份已知豬源ExPEC抗體陰性血清，測定其OD450nm值，計算平均值X=0.269，標準方差SD=0.015，臨界值X+3SD=0.314，即當血清樣品的OD450nm值>0.314為陽性，OD450nm值≤0.314為陰性。

2.3 特異性試驗

表1結(jié)果顯示，用建立的豬源ExPEC抗體間接ELISA方法檢測ETEC、STEC、Salmonella、HPS、SS、PCV2、PRV、CSFV、PRRSV陽性血清的OD450nm值均小于0.314，而且豬源ExPEC陽性血清和陰性血清對照均成立。表明該方法與常見病原陽性血清無交叉反應(yīng)，具有良好的特異性。

表1 特異性試驗結(jié)果

2.4 敏感性試驗

表2結(jié)果顯示，建立的豬源ExPEC抗體間接ELISA方法能檢測到最高稀釋度為1∶6 400的豬源ExPEC陽性血清，具有良好的敏感性。

表2 敏感性試驗結(jié)果

2.5 重復(fù)性試驗

表3結(jié)果顯示，批內(nèi)變異系數(shù)均小于8%（1.92%～7.60%），批間變異系數(shù)均小于5%（1.50%～4.72%）。批內(nèi)及批間重復(fù)試驗的結(jié)果表明建立的豬源ExPEC抗體間接ELISA方法具有良好的重復(fù)性。

表3 重復(fù)性試驗結(jié)果

2.6 符合率試驗

表4結(jié)果顯示，在30份未經(jīng)豬源ExPEC疫苗接種的豬血清樣品中，豬源ExPEC抗體間接ELISA方法檢測出4份豬源ExPEC陽性血清，而MAT檢測出2份豬源ExPEC陽性血清，與該方法的總符合率為93.33%，具有較高的一致性。

表4 豬源ExPEC抗體間接ELISA與MAT檢測結(jié)果比較

2.7 臨床豬血清樣品的感染抗體檢測

在200份未經(jīng)豬源ExPEC免疫接種的豬血清樣品中，間接ELISA檢出38份陽性血清，162份陰性血清，感染率為19.00%；MAT檢出35份陽性血清，165份陰性血清，感染率為17.50%。兩種方法檢測同為陽性樣品有31份、陰性樣品有158份，符合率為94.50%，檢測結(jié)果無顯著性差異，高度一致（P>0.05，K=0.816），見表5。卡方檢驗結(jié)果顯示：合肥與馬鞍山、蕪湖、亳州、阜陽、蚌埠、池州、安慶、淮南、六安9個地市之間感染率差異顯著（P<0.05）；馬鞍山與亳州、蚌埠、池州、安慶、六安5個地市之間感染率差異不顯著（P>0.05），而與合肥、阜陽、淮南、蕪湖4個地市之間感染率差異顯著（P<0.05）；蕪湖、阜陽、淮南3個地市與合肥、馬鞍山、亳州、蚌埠、池州、安慶、六安7個地市之間感染率差異顯著（P<0.05）。表明安徽10個地市均存在不同程度的豬源ExPEC感染，其中合肥感染率最高（表6）。

表5 間接ELISA和MAT的檢測結(jié)果比較

表6 間接ELISA對安徽10個地區(qū)豬源ExPEC感染抗體的檢測結(jié)果

3 討論與結(jié)論

近年來，豬源ExPEC已成為影響我國養(yǎng)豬業(yè)最重要的細菌性病原體之一，在臨床上的檢出率呈現(xiàn)逐年升高的態(tài)勢[8-11]。由于發(fā)病率、死亡率升高和體重降低情況的增多，以及治療、疫苗和飼料添加劑的成本增加，ExPEC引起的豬大腸桿菌病導(dǎo)致的經(jīng)濟損失日趨顯著。豬源ExPEC血清型的種類繁多，不同血清型菌株之間缺乏交叉免疫保護，優(yōu)勢血清型在不同地區(qū)、不同時段上的流行分布均存在一定差異，呈現(xiàn)動態(tài)過程[12]。鑒于此，本實驗室前期對某集團公司分布在安徽、江蘇、山東、河北、廣西5個省區(qū)家庭農(nóng)場以及安徽地區(qū)不同規(guī)模養(yǎng)豬場（戶）進行豬細菌病學調(diào)查，確定ExPEC血清型O38、O127為優(yōu)勢菌株，進而依據(jù)抗原性試驗篩選出抗原性良好的血清O38型（編號為SDjie18-10）、O127型（編號為HByan18-2）受試菌株，將其超聲裂解蛋白作為包被抗原，通過對抗原濃度、血清、酶標二抗稀釋度及反應(yīng)時間等條件優(yōu)化，建立了檢測豬源ExPEC血清O38、O127型抗體間接ELISA方法。

選擇合適的包被抗原是建立間接ELISA抗體檢測方法的關(guān)鍵。采用超聲裂解蛋白作為包被抗原，其優(yōu)勢是包被抗原制備過程簡單，只需將菌體超聲裂解即得，且包被抗原穩(wěn)定易保藏，冷凍保藏期可達半年以上[13]，缺點在于用全菌體超聲裂解蛋白作為包被抗原理論上存在特異性差的可能[7]。本研究結(jié)果則顯示，建立的豬源ExPEC抗體間接ELISA方法與ETEC、STEC、Salmonella、HPS、SS、PCV2、PRV、CSFV、PRRSV共9種常見細菌和病毒陽性血清無交叉反應(yīng)，豬源ExPEC陽性血清稀釋至1∶6 400仍可檢出，批內(nèi)及批間變異系數(shù)均小于10%，表明該方法具有特異性強、敏感性高、重復(fù)性好等優(yōu)點，可進行臨床樣品豬源ExPEC血清抗體檢測的應(yīng)用。

在間接ELISA和MAT中，同一血清型菌株的抗原與抗體能發(fā)生特異性反應(yīng)，而不同血清型菌株的抗原與抗體往往不發(fā)生反應(yīng)或因共性抗原的存在，發(fā)生不同程度的交叉反應(yīng)。本研究應(yīng)用以血清O38、O127型豬源ExPEC制備包被抗原和凝集抗原建立的間接ELISA和MAT進行符合率試驗及對臨床豬血清樣品感染抗體的同步檢測，兩者的符合率分別為93.33%和94.50%，感染抗體陽性檢出率分別為19.00%和17.50%，符合率與陽性檢出率均無顯著性差異，且感染抗體檢測結(jié)果Kappa檢驗一致性極高。這不僅表明間接ELISA同MAT均一性較高，均可用于臨床血清O38、O127型豬源ExPEC抗體的檢測；而且進一步顯示豬源ExPEC在臨床上存在普遍感染現(xiàn)象。但在臨床大批量檢測時，間接ELISA所需的包被抗原量遠少于MAT所需的凝集抗原，可有效減少抗原制備成本。同時MAT主要是依靠肉眼觀察測定結(jié)果，具有一定的主觀性；間接ELISA結(jié)果則由樣品吸光值進行判斷，客觀準確。而且，當血清中抗體水平較低時，凝集抗原往往不易與相應(yīng)抗體發(fā)生明顯的凝集反應(yīng)，從而影響判斷，導(dǎo)致假陰性出現(xiàn)，與之相比，低抗體滴度的血清應(yīng)用間接ELISA則更容易檢出[14]。因此，本研究建立的間接ELISA用于臨床特定血清型豬源ExPEC抗體檢測和流行病學調(diào)查時，更具有普適性和準確性。當前豬源ExPEC血清型眾多，各地區(qū)優(yōu)勢血清型存在較大差異，呈現(xiàn)動態(tài)過程，建立同步檢測多種血清型豬源ExPEC抗體的方法勢在必行。本研究著實為豬源ExPEC抗體檢測方法的深入研究奠定了良好基礎(chǔ)。