我國豬圓環(huán)病毒的分類、流行現(xiàn)狀及分子生物學(xué)檢測方法研究進(jìn)展

李天芝，于新友，李 峰

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600 ；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

豬圓環(huán)病毒病是由圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV）感染后引起的一類疾病，各日齡和品種豬均可發(fā)生，其中仔豬和母豬受到的危害嚴(yán)重。豬圓環(huán)病毒病發(fā)病率高，分布廣泛，在世界主要養(yǎng)豬國家均有發(fā)生和流行，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。PCV屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬，病毒粒子呈二十面體對稱[1]，無囊膜，直徑大小約13～25 nm，是最小的動物病毒之一。病毒基因組為單股負(fù)鏈環(huán)狀DNA，大約2 000 bp。PCV對外界環(huán)境抵抗力很強[2]，對酒精、氯仿、碘酒等脂溶性消毒劑以及酸堿等具有一定耐受力。在56 ℃環(huán)境能存活，82 ℃環(huán)境中15 min才被殺滅。消毒劑可選用苯酚、氫氧化鈉和氧化劑等。PCV可分為豬圓環(huán)病毒1型（PCV1）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬圓環(huán)病毒3型（PCV3）及豬圓環(huán)病毒4型（PCV4）4種類型[3]。

1 豬圓環(huán)病毒分類及流行現(xiàn)狀

1.1 豬圓環(huán)病毒1型

PCV1于1974年首次被報道[4]，存在于PK-15培養(yǎng)物中，但不產(chǎn)生細(xì)胞病變，1982年才被證實為一種病毒。PCV1基因組結(jié)構(gòu)與PCV2類似，在研制嵌合病毒疫苗時以PCV1作為載體，構(gòu)建存在PCV2 ORF2基因的嵌合病毒。PCV1 基因組大小為1 758～1 760 bp， PCV1和PCV2核苷酸序列有76%以上同源性，在豬群中混感現(xiàn)象普遍，仔豬經(jīng)PCV1感染后可在肺臟、腸道等組織中檢測到，因此，PCV1具有一定的潛在致病性。PCV1可以在豬腎細(xì)胞、多種豬源細(xì)胞系中復(fù)制，也可以在Vero細(xì)胞中復(fù)制，但在Vero細(xì)胞中傳代時間的延長會導(dǎo)致病毒的抗原改變。

1.2 豬圓環(huán)病毒 2型

PCV2于1998年首次被報道，廣泛存在于世界各地豬場中，具有較強的致病性。可導(dǎo)致豬只多種疾病，如斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、豬皮炎腎病綜合征（PDNS）、繁殖障礙綜合征（SMIJDI）、豬呼吸障礙綜合征（PRDC）、先天性震顫（CT）等。PCV2可在豬腎細(xì)胞系中復(fù)制，且能引起明顯的細(xì)胞病變。PCV2 基因組大小為 1 766～1 769 bp，根據(jù)Cap基因序列差異，PCV2可分為8個基因型，即PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e、PCV2f、PCV2g和PCV2h[5]，其中PCV2a、PCV2b和PCV2d型流行廣泛，PCV2a為2000年的優(yōu)勢基因型，隨后，PCV2b基因型成主流病毒，當(dāng)前PCV2d基因型在豬場流行增多。

金喜新等[6]對來自河南省12個不同地區(qū)的250個疑似PCV2感染送檢樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)總體陽性率為91.20%。河南東部、西部、南部、北部、中部地區(qū)部分養(yǎng)豬場PCV2的陽性率分別為81.82%、90.70%、89.66%、96.30%和93.75%。不同規(guī)模養(yǎng)豬場的PCV2陽性率也存在差異，大型養(yǎng)豬場、中型養(yǎng)豬場、小型養(yǎng)豬場的PCV2陽性率分別為94.19%、92.68%和86.59%。萬云等[7]對采自湖北省武漢市22個大型規(guī)模化豬場的330份豬口腔液樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8個場的55份樣本檢出PCV2核酸陽性，場群表觀流行率為36.4%，真實流行率為38.0%。 連慧香等[8]對2015—2018年豫南地區(qū)157份疑似PCV2感染的組織樣品進(jìn)行PCR檢測，并對部分PCV2陽性樣品進(jìn)行了全基因組克隆測序和序列分析。結(jié)果顯示，43份為PCV2陽性，陽性率為27.39%，對部分陽性樣品進(jìn)行克隆測序獲得了13株全基因組序列。經(jīng)序列比較和遺傳進(jìn)化樹分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，13株豫南株中有1株屬于PCV2a， 2株屬于PCV2b，10株屬于PCV2d。 羅弼豪等[9]對2018—2019年采自陜西省咸陽和楊凌地區(qū)生豬屠宰企業(yè)的300份血樣進(jìn)行PCV2病原學(xué)檢測，結(jié)果顯示，38份血樣PCV2病原學(xué)檢測為陽性，陽性率為12.67%。顏友榮等[10]對蘇中地區(qū)未免疫PCV2 疫苗的15個豬場進(jìn)行PCV2病原檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCV2陽性率為 10.7%，其中大、中、小型豬場病料PCV2 陽性率分別為 4.9%、7.1%、18.8%。

1.3 豬圓環(huán)病毒3型

2016年，美國學(xué)者首次報道了患病豬體內(nèi)PCV3的存在，隨后波蘭、意大利、韓國、瑞典和俄羅斯等相繼有病毒存在的報道。但回溯性研究表明，最早的PCV3感染病例可追溯到1966年，甚至更早。由于PCV3臨床癥狀與PCV2類似，且存在一定的混感，易被忽視。PCV3發(fā)生無明顯的季節(jié)性，可感染所有年齡的豬，會侵害豬免疫系統(tǒng)，致豬免疫能力下降，臨床可表現(xiàn)為發(fā)熱、厭食、母豬繁殖障礙，皮膚出現(xiàn)多灶性丘疹和斑疹。能夠水平和垂直傳播，豬對PCV3具有高度易感性。病豬和隱性感染豬是主要傳染源。PCV3感染率的高低與豬體的健康狀況相關(guān)，病豬中的陽性率明顯高于健康豬，感染PCV3豬所有組織中均可檢測到PCV3，尤其是腦組織、肺部、扁桃體、淋巴結(jié)、腎臟等組織器官。PCV3還可以跨物種傳播，犬、牛、小鼠、狍及巖羚羊等多種動物可感染，但不會出現(xiàn)明顯的臨床癥狀及病變。PCV3 基因組相對較大，約為 2 000 bp，GC 含量為 50%，包含3個主要的開放閱讀框（ORF）：ORF1、ORF2和ORF3，其中ORF1編碼復(fù)制酶蛋白Rep，ORF2編碼衣殼蛋白Cap，ORF3編碼未知蛋白。PCV3可分為PCV3a、PCV3b和PCV3c 3種基因型。PCV3可在豬原代腎細(xì)胞和PK-15細(xì)胞系細(xì)胞質(zhì)內(nèi)增殖，但不產(chǎn)生細(xì)胞病變。

張帆帆等[11]對2016—2017年江西省256份樣品進(jìn)行PCR檢測后發(fā)現(xiàn)，PCV3感染率為1.17%。溫海京等[12]對2018—2019年京津冀地區(qū)120份仔豬樣品進(jìn)行PCR檢測后發(fā)現(xiàn)，PCV3感染率為40.8%。劉相聰?shù)萚13]檢測來自華南地區(qū)177家豬場的1 078份樣品后發(fā)現(xiàn)，華南地區(qū)的豬場也存在PCV3，豬場陽性率為4.6%，而樣品陽性率為29.04%。肖興等[14]用PCR方法檢測了湖南省與京津冀地區(qū)523頭斷奶仔豬血清樣品中的病毒核酸。結(jié)果顯示，豬圓環(huán)病毒3型的豬場核酸陽性率為68.75%，個體陽性率為31.74%，整體存在極顯著差異（P<0.01）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，病毒核酸陽性率超過20%的豬場達(dá)到50%，超過70%的豬場占18.75%，為0的豬場占31.25%。

1.4 豬圓環(huán)病毒4型

PCV4 是 2019 年在我國湖南省患呼吸道、消化道疾病和 PDNS病豬群中首次被檢測出，其基因序列與PCV1～3 型差異明顯?；仡櫺匝芯勘砻?，國內(nèi)PCV4最早出現(xiàn)于2017 年。PCV4 基因組大小為 1 770 bp，包含 12 個ORF，其中 ORF1 和ORF2 為主要的ORF，ORF1編碼Rep蛋白，ORF2編碼 Cap蛋白，基因組與其它 PCV 的核苷酸相似性為 43.2%～51.5%。與 PCV2 和 PCV3 相似，PCV4也是導(dǎo)致豬 PDNS 和 PMWS 的病原體。病豬和隱性感染豬是主要傳染源，PCV4隨感染豬的鼻液、糞便、唾液等排出體外，污染飼料、飲水及周邊環(huán)境，并經(jīng)消化道、呼吸道等水平途徑傳播，此外，還可以通過垂直方式由母豬傳給仔豬。

Tian等[15]于2018年2月至2019年12月對63份采自河南省和山西省的24個不同豬場的臨床樣本進(jìn)行PCV4檢測。結(jié)果顯示，PCV4豬場陽性率為50%，樣本陽性率為25.4%。

Zhang等[16]將2019年3—12月間從中國安徽省收集的42頭臨床癥狀為呼吸系統(tǒng)疾病、皮膚病和腹瀉的病豬進(jìn)行PCV4篩查。結(jié)果顯示，實時PCR的陽性檢出率為10.71%。何世成等[17]對來自湖南省14個市州的821份臨床病料和屠宰場豬淋巴結(jié)樣品進(jìn)行PCV4熒光PCR檢測。結(jié)果顯示：在821份樣品中，PCV4陽性檢出率為1.10%。

2 分子生物學(xué)檢測方法

2.1 常規(guī)PCR

PCR檢測方法是針對病原核酸的一種檢測方法，借助引物與相應(yīng)的酶試劑和反應(yīng)液等體外擴(kuò)增病原核酸，實現(xiàn)病原檢測，敏感性高、特異性好，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動物疾病檢測領(lǐng)域。王林青等[18]參考GenBank中已發(fā)表的PCV2和PCV3基因組序列，針對其保守區(qū)分別設(shè)計了2對特異性引物，建立了能快速檢測和鑒別PCV2/PCV3雙重?zé)晒舛縋CR方法。結(jié)果表明，該方法能同時特異地檢測PCV2和PCV3，而對其他5種豬病原均未檢測到熒光信號，PCV2和PCV3的最低檢測值分別為41.1拷貝/μL、27.0拷貝/μL，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于1%。徐通等[19]參考GenBank中PCV2和PCV4基因組序列，分別在PCV2 Rep和PCV4 Cap基因高度保守區(qū)設(shè)計2對特異性引物，經(jīng)雙重PCR條件優(yōu)化，建立同時快速檢測PCV2/4的雙重PCR方法。該方法能同時擴(kuò)增出264 bp（PCV2）和391 bp（PCV4）2條特異性片段，而對其他8種常見豬病原擴(kuò)增均為陰性，PCV2/4的最低檢測量分別為61.1、54.9拷貝/μL。

2.2 熒光PCR

熒光PCR是在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種核酸檢測技術(shù)，后續(xù)不需要電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，可直接根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果，還能實現(xiàn)病原定量檢測，敏感性更高，具有很好的特異性，封閉檢測，降低實驗室氣溶膠污染風(fēng)險，可分為染料法和探針法兩種。駱輝等[20]根據(jù)GenBank中PCV3全基因組序列高度保守區(qū)域設(shè)計了一對特異性引物和探針，通過對反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了能夠特異性檢測PCV3的熒光定量PCR方法。該方法對7.87×103～7.87×109拷貝/μL的PCV3標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，最低檢出濃度為7.87×101拷貝/μL，比常規(guī)PCR的靈敏度高100倍。與PRV（偽狂犬病病毒）、PCV2、PPV（細(xì)小病毒）、PRRSV（藍(lán)耳病病毒）、JEV（乙型腦炎病毒）、TGEV（傳染性胃腸炎病毒）和PEDV（豬流行性腹瀉病毒）均無交叉反應(yīng)，具有良好的特異性。不同濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗結(jié)果均顯示變異系數(shù)小于1%，重復(fù)性較好。吳江等[21]根據(jù)PCV2和PCV3保守區(qū)域基因序列，設(shè)計2對特異性的引物和2種TaqMan探針。經(jīng)過引物篩選和條件優(yōu)化，建立可鑒別檢測PCV2和PCV3的雙重?zé)晒舛縋CR方法。該方法能同時特異性地檢測鑒別PCV2和PCV3，且與CSFV、PRV、ASFV、SVDV、FMDV、SVA（A型塞內(nèi)卡病毒）病毒核酸沒有交叉反應(yīng)。靈敏性強，PCV2和PCV3的最小檢出量分別為48.1拷貝/μL和58.3拷貝/μL。組間和組內(nèi)試驗變異系數(shù)不超過1.5%，重復(fù)性好。田瑤等建立了一種快捷、特異、敏感的PCV1、PCV2、PCV3的SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR鑒別檢測方法，結(jié)果表明：檢測下限分別為PCV1：40.3拷貝/μL、PCV2：25.2拷貝/μL、PCV3：22.4拷貝/μL。與CSFV、PRRSV、PRV、PPV均無交叉反應(yīng)，批內(nèi)及批間變異系數(shù)均小于1%。張倩等[22]參照GenBank收錄的PCV4 ORF2基因保守序列，設(shè)計合成了1對特異性引物和TaqMan探針，建立了針對PCV4的實時熒光PCR方法。結(jié)果顯示，該方法的Ct值與標(biāo)準(zhǔn)品在1.53×103～1.53×107拷貝/μL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，R2值為0.999，特異性強，僅對PCV4呈特異性擴(kuò)增，與PCV1、PCV2、PCV3以及其他多種豬常見病原均無交叉反應(yīng)，敏感性高，最低檢測限為1.53×101拷貝/μL，重復(fù)性好，組內(nèi)、組間變異系數(shù)均小于2%。

2.3 微滴式數(shù)字PCR

微滴式數(shù)字PCR技術(shù)是在擴(kuò)增前先對反應(yīng)體系進(jìn)行微滴化處理，使得反應(yīng)體系分成數(shù)萬個納米級微滴，每個微滴含不同量待檢核酸靶分子，每個微滴就是一個獨立的反應(yīng)體系。根據(jù)泊松分布的原理以及出現(xiàn)熒光信號的微滴個數(shù)與比例，可實現(xiàn)靶分子的絕對定量檢測。最低可檢測單拷貝待檢靶核酸分子。吳朦晨等[23]針對PCV2 ORF1基因設(shè)計引物和探針，經(jīng)各反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立檢測PCV2的微滴式數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ddPCR）檢測方法。該方法除了對PCV2檢測結(jié)果為陽性外，對PCV1、PCV3和其他常見豬病病原的檢測均未見陽性微滴，特異性較強。對10倍倍比稀釋的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品檢測敏感性試驗，結(jié)果顯示最低檢測限達(dá)2.93拷貝/μL，比熒光PCR高10倍以上，敏感性較高。批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗結(jié)果顯示，其變異系數(shù)均小于10%，重復(fù)性較好。

2.4 恒溫擴(kuò)增技術(shù)

恒溫擴(kuò)增技術(shù)較PCR檢測技術(shù)最大的優(yōu)勢是不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，僅用水浴鍋即能實現(xiàn)核酸體外迅速大量擴(kuò)增，當(dāng)前成熟的恒溫擴(kuò)增檢測技術(shù)主要有環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）和重組酶介導(dǎo)等溫擴(kuò)增方法（RAA）。謝志勤等[24]根據(jù)CSFV E2基因和PCV2 ORF2基因序列保守區(qū)域，分別設(shè)計并合成了2組特異性引物和2條探針，建立了同時檢測CSFV和PCV2的二重?zé)晒釲AMP檢測方法區(qū)分，對該方法中的反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行特異性、敏感性和干擾性測試以及臨床樣品驗證測試。結(jié)果表明，建立的方法可鑒別CSFV和PCV2，特異性試驗顯示，該方法只檢測出CSFV或PCV2，且與參試的對照病毒無交叉反應(yīng)，特異性好。該方法最低檢測CSFV或PCV2為100拷貝/μL，敏感性好。臨床樣品的檢測結(jié)果與熒光定量PCR檢測結(jié)果一致。建立的CSFV和PCV2二重?zé)晒釲AMP檢測方法具有良好的特異性和敏感性，可適用于CSFV和PCV2的鑒別檢測。 姜辰龍等[25]根據(jù)PCV3 ORF2基因保守序列，設(shè)計特異性引物，建立了PCV3 LAMP檢測方法。結(jié)果顯示，59 ℃恒溫擴(kuò)增36 min即可出現(xiàn)梯形條帶，且產(chǎn)物亦可通過SYBR Green Ⅰ染色進(jìn)行判斷。該方法最低檢測限為1.0×101拷貝/μL，與PRRSV、PRV、CSFV、PCV1及PCV2等均無交叉反應(yīng)。田瑤等[26]根據(jù)GenBank公布的PCV1全基因組序列，在其保守區(qū)設(shè)計了4條特異性LAMP引物，并通過反應(yīng)條件優(yōu)化、敏感性試驗、特異性試驗以及臨床樣本檢測，首次建立了PCV1的LAMP檢測方法。結(jié)果表明，62 ℃水浴60 min為最佳反應(yīng)條件，LAMP的檢出限為1×101拷貝/μL，普通PCR最低檢測限為1×103拷貝/μL，對PPV、PRV、PCV2、PCV3進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示為陰性。吳江等[27]根據(jù)PCV3 Cap基因的保守序列設(shè)計引物和探針，建立了一種實時熒光RAA檢測方法，結(jié)果表明僅能擴(kuò)增PCV3核酸，與CSFV、PRRSV、PCV2、SVA和FMDV（口蹄疫病毒）等核酸無交叉反應(yīng)，可在39 ℃下20 min內(nèi)快速特異完成，方法靈敏度較高，最低檢出濃度為102拷貝/μL。

3 小結(jié)

豬圓環(huán)病毒病是危害世界養(yǎng)豬業(yè)最重要的一種疾病，病原種類較多，基因組結(jié)構(gòu)差別大，宿主范圍廣泛，多種動物均有檢出。豬群中常見的圓環(huán)病毒有4種，PCV1、PCV2、PCV3和PCV4，目前認(rèn)為除PCV1外均能對豬致病，可導(dǎo)致豬只免疫機能受損，對疫苗免疫應(yīng)答保護(hù)力減弱，免疫常規(guī)疫苗后效果不理想，料重比升高，生長發(fā)育不良，易繼發(fā)細(xì)菌感染，母豬可表現(xiàn)為繁殖障礙如流產(chǎn)、死胎等，是影響豬場效力的重要疾病。

目前，臨床對PCV病原檢測主要采用分子生物學(xué)方法，常用的分子生物學(xué)方法有常規(guī)PCR方法、熒光PCR方法、微滴式數(shù)字PCR方法和恒溫擴(kuò)增檢測方法。這些檢測方法各有利弊，不同單位可根據(jù)自己實驗室條件選擇。其中常規(guī)PCR方法是最簡單、最常用的方法，相對來說檢測費用低，但后續(xù)需要電泳檢測產(chǎn)物，存在實驗室核酸氣溶膠污染風(fēng)險，檢測耗時長，敏感性不夠高。熒光PCR方法檢測敏感性高，可實現(xiàn)定量檢測，全封閉操作，污染實驗室風(fēng)險降低，但費用相對較高，需要昂貴的檢測設(shè)備。微滴數(shù)字PCR無需標(biāo)準(zhǔn)曲線，最低可檢測單拷貝核酸分子，對待檢靶樣品核酸可實現(xiàn)絕對定量，但對操作人員要求高，儀器昂貴，不適合基層檢測。恒溫擴(kuò)增檢測技術(shù)，操作簡單，不需要復(fù)雜儀器設(shè)備，適合基層豬場實驗室應(yīng)用，但當(dāng)前試劑價格昂貴，檢測成本高，引物設(shè)計復(fù)雜。

科學(xué)防控豬場圓環(huán)病毒病，可提高豬場養(yǎng)殖效益，目前僅有針對PCV2的商品化疫苗，種類包括豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗（SH株），豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗（1010株），豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗（LG株），豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗（YZ株），豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗（WH株），豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗（DBN-SX07株），豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗（ZJ/C株），豬圓環(huán)病毒2型桿狀病毒載體滅活疫苗（CP08株），豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗，豬圓環(huán)病毒2型、豬肺炎支原體二聯(lián)滅活疫苗（Cap蛋白+SY株），豬圓環(huán)病毒2型、豬肺炎支原體二聯(lián)滅活疫苗（重組桿狀病毒CP08株+JM株），豬圓環(huán)病毒2型、豬肺炎支原體二聯(lián)滅活疫苗（SH株+HN0613株），豬圓環(huán)病毒2型、副豬嗜血桿菌二聯(lián)滅活疫苗（SH株+4型JS株+5型ZJ株），豬圓環(huán)病毒1-2型嵌合體滅活疫苗，豬圓環(huán)病毒1-2型嵌合體、支原體肺炎二聯(lián)滅活疫苗，豬圓環(huán)病毒2型、豬肺炎支原體二聯(lián)滅活疫苗（重組桿狀病毒P株+P株）。目前公認(rèn)豬場免疫PCV2疫苗后會產(chǎn)生良好的效果，但疫苗品種多達(dá)10多種，價格差別大，很難選擇，豬場選擇疫苗時一定要慎重，可選擇性價比高、口碑好的疫苗。有條件的豬場可選擇幾種疫苗進(jìn)行小群試驗，全面評估豬群生長情況及用疫苗后豬場生產(chǎn)成績的改變。目前尚無針對PCV3和PCV4的疫苗，豬場只能采取綜合防控措施，加強飼養(yǎng)管理，提供優(yōu)質(zhì)飼料和清潔飲水，定期補充維生素和微量元素，提高豬群自身免疫力。強化生物安全管理，加強消毒，避免病毒傳入場內(nèi)及在場內(nèi)擴(kuò)散傳播。降低豬群飼養(yǎng)密度，減少豬群應(yīng)激，提供適宜溫度，加強通風(fēng)。嚴(yán)禁從疫區(qū)引種及購買帶毒精液，新引進(jìn)豬只隔離飼養(yǎng)1個月，檢測合格后再并入大群飼養(yǎng)。