基于microcarrier 6正常免疫鼠人源宮頸癌移植瘤模型的構(gòu)建及其臨床應(yīng)用意義

劉昆燕，張秋實(shí)，張 凱，洪 豐，王全義，彭一晴，趙 影，段亞楠，周潤生，彭存旭*

(1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)寧272000;2.廣東省第二人民醫(yī)院 婦科(婦幼健康研究所)；3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院； 4.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 a.中美肝病與免疫研究所； b.病理科；c.生殖醫(yī)學(xué)科;d.婦科)

宮頸癌(CC)是女性最常見的惡性腫瘤之一，在全球女性惡性腫瘤中其發(fā)病率及死亡率均位居第四[1]。隨著社會(huì)發(fā)展以及環(huán)境改變等因素，宮頸癌患者的發(fā)病更趨向于年輕化，且呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，在我國其發(fā)病率僅次于乳腺癌而位居第二[2]。因此構(gòu)建能夠模擬腫瘤患者特征的宮頸癌動(dòng)物模型在宮頸癌發(fā)病機(jī)制研究和臨床治療方面意義重大。

患者來源的腫瘤組織動(dòng)物移植模型(PDX)能最大程度保留原發(fā)腫瘤組織的腫瘤異質(zhì)性及原發(fā)腫瘤的腫瘤微環(huán)境[3]，被認(rèn)為是最接近臨床患者的腫瘤動(dòng)物模型。但目前國內(nèi)外移植瘤模型多選用免疫缺陷鼠，如裸鼠、SCID鼠等，導(dǎo)致傳統(tǒng)的PDX模型在腫瘤免疫治療、腫瘤發(fā)生的免疫相關(guān)機(jī)制研究中具有明顯局限性，嚴(yán)重影響疾病的精準(zhǔn)治療與預(yù)后判斷，并且移植瘤的成瘤周期一般需要4-6個(gè)月。因此，如果本研究能克服傳統(tǒng)PDX模型這一缺陷，在正常免疫小鼠體內(nèi)成功構(gòu)建人宮頸癌PDX模型，對(duì)宮頸癌的免疫相關(guān)機(jī)制研究及精準(zhǔn)治療意義重大。

microcarrier 6是一種新型3D微載體，呈多層孔樣條索狀，并相互交聯(lián)蜷曲，鏡下呈“迷宮”樣且有足夠空間的不規(guī)則結(jié)構(gòu)。該新型微載體由帶正電的有機(jī)復(fù)合多聚物構(gòu)成，孔徑大小不一，其顆粒大小和表面正電荷密度均可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)節(jié)，該微載體是不含雜質(zhì)、不易污染的有機(jī)化合物。更為重要的是該新型微載體同時(shí)還具有低免疫原性、生物兼融性和可代謝性的特征，非常有利于細(xì)胞生長。與此同時(shí)，其不規(guī)則結(jié)構(gòu)在建模早期可以起到屏障作用，在一定程度上緩解了體內(nèi)免疫細(xì)胞直接殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。另外，用CXCL-12α和VEGF對(duì)微載體進(jìn)行修飾后，可誘導(dǎo)血管長入，促進(jìn)血管形成，為腫瘤的生長提供豐富的營養(yǎng)。

本研究將從手術(shù)切除的宮頸癌標(biāo)本組織中分離提取的癌細(xì)胞，與mocrocarrier 6共同孵育24 h，將(宮頸癌細(xì)胞-微載體)復(fù)合體經(jīng)皮下接種到小鼠體內(nèi)，成功建立了新型患者來源的正常免疫小鼠宮頸癌移植瘤模型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1腫瘤標(biāo)本 5例新鮮宮頸癌腫瘤組織均取自濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦科，所有標(biāo)本的獲取均經(jīng)患者本人及家屬同意，簽署知情同意書。詳細(xì)信息見表1，人體標(biāo)本實(shí)驗(yàn)通過了濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

表1 宮頸癌相關(guān)PDX模型的病例信息

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6雌性90只小鼠，6-8周齡， 22-25 g/只，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供[許可證號(hào) SCXK(魯) 20140007]，飼養(yǎng)在濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程均嚴(yán)格按照濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.1.3主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胰酶、膠原酶II、胎牛血清、紅細(xì)胞裂解液、青鏈霉素購于Gibco公司，主要抗體 P16、CK5/6單克隆抗體購于Abcam公司。microcarrier 6為美國ELYON BIOTECHNOLOGIES LLC公司提供。

1.2 方法

1.2.1原代宮頸癌細(xì)胞的獲取 將手術(shù)切除下的新鮮腫瘤組織標(biāo)本立即放入含10%濃度青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置 冰盒內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室，在超凈工作臺(tái)內(nèi)，取出標(biāo)本，去除壞死組織，用含10%濃度青鏈霉素的生理鹽水反復(fù)沖洗3次直至清潔，再加入50%濃度青鏈霉素完全浸泡10 min直至潔凈無菌，將標(biāo)本置于培養(yǎng)皿中用眼科剪剪至1 mm3大小，加入以DMEM培養(yǎng)基為溶劑配制的0.05%膠原酶Ⅱ溶液， 37℃消化1 h，加入適量DMEM反復(fù)吹打，70 μm濾網(wǎng)過濾后以1200轉(zhuǎn)/分，離心8 min，棄上清，以紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，置于37℃ 10 min，即可得到人原代宮頸癌細(xì)胞。

1.2.2人原代宮頸癌細(xì)胞與microcarrier 6共培養(yǎng) 將微載體microcarrier 6 置于75%酒精浸泡24 h，用1×磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3遍，于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中孵育24 h；用趨化因子-12α(CXCL-12α)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)對(duì)微載體microcarrier 6 進(jìn)行修飾，濃度均為100 ng/mL，孵育時(shí)間為3 h。取指數(shù)生長期原代宮頸癌細(xì)胞，用臺(tái)盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)>95%，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整宮頸癌細(xì)胞濃度為2×107/mL，與修飾好的微載體microcarrier 6懸液按照體積比為1∶1混合后，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培育24 h。鏡下觀察，腫瘤細(xì)胞在微載體microcarrier 6 內(nèi)達(dá)到飽和狀態(tài)。

1.2.3正常免疫小鼠宮頸癌PDX模型的建立 5例標(biāo)本共用90只C57BL/6雌鼠，每例15只。每次實(shí)驗(yàn)分為3組，細(xì)胞對(duì)照組、微載體對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組5只小鼠。細(xì)胞對(duì)照組小鼠單純接種含2×107個(gè)/mL宮頸癌細(xì)胞懸液150 μl/只；空載體對(duì)照組小鼠單純接種含30 μg 空微載體懸液150 μl/只；實(shí)驗(yàn)組小鼠接種含2×107個(gè)/mL宮頸癌細(xì)胞、30 μg微載體的細(xì)胞-微載體混合物懸液150 μl/只。異氟烷麻醉小鼠，按分組要求依次對(duì)每組小鼠右腋下皮下進(jìn)行接種移植。

1.2.4小鼠模型的觀察指標(biāo)及移植瘤生長評(píng)估 將皮下接種后的小鼠按分組隔離飼養(yǎng)，每日對(duì)各組小鼠分別稱量、記錄體質(zhì)量，觀察每組小鼠食欲及每組小鼠的活動(dòng)度。記錄小鼠皮下移植瘤的成瘤時(shí)間、移植瘤的體積。自移植瘤長出后，每天測(cè)量腫瘤的最長瘤徑(a)和最短瘤徑(b)，依照腫瘤體積公式V=1/2×a×b2，計(jì)算腫瘤的體積并繪制出腫瘤生長曲線。

1.2.5小鼠模型病理學(xué)檢查 建模第16天時(shí)，統(tǒng)一異氟烷麻醉后處死宮頸癌移植瘤小鼠，并完整分離移植瘤，將其稱重、測(cè)量移植瘤長徑，觀察其質(zhì)地、形態(tài)、局部浸潤程度及壞死程度。固定移植瘤組織(10%中性甲醛)，包埋切片(石蠟)，常規(guī)病理染色(HE)；按試劑盒說明，進(jìn)行免疫組化染色(EnVision二步法)，檢測(cè)P16、CK5/6在各組移植瘤中的表達(dá)情況。判定染色結(jié)果：P16陽性的顆粒定位于腫瘤細(xì)胞核和(或)細(xì)胞漿中，均出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒；CK5/6陽性的顆粒定位于細(xì)胞漿中，顯棕黃色。于高倍鏡下隨機(jī)選取95個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)陽性百分率=陽性細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)。陽性細(xì)胞百分率<10%為陰性(-)，陽性細(xì)胞百分率≥10%為陽性(+)。

2 結(jié)果

2.1 基于微載體microcarrier 6構(gòu)建人原代宮頸癌細(xì)胞體外三維培養(yǎng)體系

光鏡下觀察剛分離出的原代宮頸癌細(xì)胞幾乎全為單個(gè)細(xì)胞，呈球形，其折光性較強(qiáng)(圖1A)；微載體microcarrier 6在光鏡下觀察為不規(guī)則長梭狀或團(tuán)狀，質(zhì)地疏松，其內(nèi)部含有大量孔隙(圖1B)；被修飾過的microcarrier 6與患者來源的原代宮頸癌細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，光鏡下可見宮頸癌細(xì)胞很好的貼附在微載體microcarrier 6上，直至達(dá)到飽和狀態(tài)，微載體外周可見不規(guī)則細(xì)胞團(tuán)(圖1C)。

圖1 人原代宮頸癌細(xì)胞三維培養(yǎng)體系形態(tài)學(xué)特征

2.2 基于microcarrier 6在正常免疫小鼠體內(nèi)建立宮頸癌PDX模型

整個(gè)實(shí)驗(yàn)全過程中，各組小鼠體質(zhì)量及毛發(fā)均沒有明顯變化，只有實(shí)驗(yàn)組小鼠在1周后表現(xiàn)出活動(dòng)度減少與食欲稍減退，各組小鼠均無死亡。細(xì)胞對(duì)照組：自實(shí)驗(yàn)開始至實(shí)驗(yàn)結(jié)束全過程無小鼠長出腫瘤。空載體對(duì)照組：共有4只小鼠在右側(cè)腋下發(fā)現(xiàn)0.2 cm左右的結(jié)節(jié)，質(zhì)地柔軟，剖開后可見豆渣樣載體物質(zhì)流出，未成瘤，其余的空載體對(duì)照組小鼠均未長出腫瘤。而在接種移植后8-10天實(shí)驗(yàn)組小鼠即有皮下包塊可觸及，25只實(shí)驗(yàn)組小鼠共有22只有皮下包塊可觸及，得出總的成瘤率為88%(表2)。移植瘤生長迅速，移植瘤的生長高峰期則在移植后11-15天，高峰期移植瘤體積迅速增大，在移植后12天左右，肉眼即可觀察到皮下的隆起包塊，16天腫瘤直徑可達(dá)到0.8-1.2 cm(圖2)。腫瘤部分剖開后，發(fā)現(xiàn)移植瘤組織較易與周圍正常組織分離開，移植瘤形態(tài)不規(guī)則，多數(shù)為橢圓形，可見移植瘤周圍血供較豐富，切開移植瘤組織后可見實(shí)質(zhì)部分顏色以灰白色為主。

表2 成瘤時(shí)間和成瘤率

圖2 microcarrier 6 宮頸癌建模組

2.3 病理學(xué)檢查

2.3.1HE染色 實(shí)驗(yàn)組小鼠形成的移植瘤組織與患者來源的人原代宮頸癌組織非常相似，在光鏡下，見大量大小不一的異型性明顯的雜亂排列的核大且深染的細(xì)胞，向毗鄰的肌肉及脂肪組織呈現(xiàn)出浸潤生長；且移植瘤也伴有中央?yún)^(qū)壞死；接種16 天時(shí)有少量殘余microcarrier 6被新生細(xì)胞包繞并形成肉芽腫；實(shí)驗(yàn)組宮頸癌移植瘤組織其邊緣有新生毛細(xì)血管且血管異常豐富(圖3)。

圖3 小鼠人源性宮頸癌細(xì)胞移植瘤接種成功腫瘤組織石蠟切片

2.3.2免疫組織化學(xué)方法 結(jié)果顯示，P16、CK5/6均為陽性表達(dá)(圖4)，因此也證實(shí)上述異型細(xì)胞為人源性宮頸癌細(xì)胞。

圖4 免疫組化示細(xì)胞-微載體復(fù)合物小鼠宮頸癌移植瘤為人源性宮頸癌細(xì)胞 (×200)

3 討論

宮頸癌是嚴(yán)重威脅人類健康的常見惡性腫瘤之一，占全球女性惡性腫瘤中發(fā)病率及死亡率的第四位，且宮頸癌的發(fā)病趨向于年輕化，呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，在我國其發(fā)病率僅次于乳腺癌而位居第二，對(duì)女性健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。目前其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，建立合適的宮頸癌動(dòng)物模型為研究宮頸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、為抗腫瘤藥物的篩選同時(shí)為藥物的開發(fā)[4]提供了全新的平臺(tái)。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)單純以人原代宮頸癌細(xì)胞接種于正常免疫鼠體內(nèi)，即便增加3倍細(xì)胞數(shù)量，也無法成瘤，考慮為異種移植排異反應(yīng)所致。3D微載體是一種支持細(xì)胞生長的支撐結(jié)構(gòu)，彌補(bǔ)了上述缺陷，由帶正電的多聚有機(jī)復(fù)合物構(gòu)成，質(zhì)地疏松，具有多層孔隙樣結(jié)構(gòu)，有助于腫瘤細(xì)胞的快速附著及擴(kuò)增。并且可在較短時(shí)間內(nèi)起到屏障與保護(hù)作用，阻擋機(jī)體的免疫細(xì)胞對(duì)微載體內(nèi)的癌細(xì)胞直接殺傷作用，并且經(jīng)過VEGF和CXCL-12α修飾后，3D微載體能夠誘導(dǎo)移植瘤血管生長，為腫瘤的快速形成及快速增殖提供足夠的營養(yǎng)。以上條件為腫瘤細(xì)胞的穩(wěn)定生長提供良好的環(huán)境基礎(chǔ)。3D微載體腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)能夠高度模擬腫瘤生長的微環(huán)境，目前已成為研究的熱點(diǎn)[5-8]。

轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)所需的宮頸癌模型需滿足能夠準(zhǔn)確地反映宮頸癌生物特性，充分地模擬人類的腫瘤微環(huán)境，且易于操作，重復(fù)性高。移植瘤PDX模型為目前最接近于臨床并且應(yīng)用最廣泛的動(dòng)物模型，但是，目前腫瘤模型主要利用免疫缺陷鼠例如裸鼠、SCID鼠等。雖然特殊的免疫缺陷鼠成瘤率較正常免疫鼠高，但難以真實(shí)反應(yīng)腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸與機(jī)體的免疫系統(tǒng)之間內(nèi)在的相互作用關(guān)系，為更準(zhǔn)確地還原患者腫瘤組織學(xué)、分子生物學(xué)特點(diǎn)及腫瘤微環(huán)境，彌補(bǔ)因免疫缺陷小鼠缺乏免疫細(xì)胞，而不能準(zhǔn)確模擬機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的免疫攻擊等重要缺點(diǎn)，本研究基于microcarrier 6微載體技術(shù)已成功創(chuàng)建了10到15天快速成瘤的正常免疫小鼠宮頸癌PDXs模型[9]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基于microcarrier 6微載體復(fù)合患者來源的原代宮頸癌細(xì)胞建立正常免疫鼠宮頸癌移植瘤模型的成瘤率達(dá)88%。該模型的特點(diǎn)是腫瘤成瘤較快，重復(fù)性好，操作相對(duì)簡(jiǎn)便。實(shí)驗(yàn)顯示，移植瘤在8-10天就可長出，11-15天為其生長高峰期。病理學(xué)HE染色提示大量異型核細(xì)胞的浸潤生長，可侵及脂肪、肌肉、神經(jīng)等組織，腫瘤中央因瘤細(xì)胞生長過速，血供不足可見壞死灶。在腫瘤周邊還可見到毛細(xì)血管分布。這些均符合人腫瘤生長特點(diǎn)。免疫組化檢測(cè)顯示，P16、CK5/6陽性表達(dá)[10]，進(jìn)一步證實(shí)異型細(xì)胞來源于人宮頸癌細(xì)胞。

綜上，本實(shí)驗(yàn)基于microcarrier 6-3D微載體將免疫功能正常的小鼠成功構(gòu)建出人原代移植瘤動(dòng)物模型，該動(dòng)物模型保留了小鼠正常的免疫功能及人源性腫瘤的特征，為臨床轉(zhuǎn)化提供了新途徑，為進(jìn)一步研究宮頸癌形成過程中免疫逃逸及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制提供了新思路。