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    基于生物信息學(xué)技術(shù)分析老年自發(fā)性腦出血的相關(guān)通路及關(guān)鍵基因

    2022-04-23 10:49:08劉玲玲王國佐李子瀅李晟陳彥霖林霞黃娟秦莉花
    實(shí)用心腦肺血管病雜志 2022年4期
    關(guān)鍵詞:核糖體差異基因自發(fā)性

    劉玲玲,王國佐,李子瀅,李晟,陳彥霖,林霞,黃娟,秦莉花

    《美國心臟協(xié)會心臟病和卒中統(tǒng)計(jì)報(bào)告——2020年更新版》[1]顯示,腦卒中是世界人口死亡的第二大原因。研究顯示,腦卒中是我國居民死亡的第一大病因[2]。數(shù)據(jù)調(diào)查顯示,2017年全球腦卒中患者總數(shù)為1.042億例,其中自發(fā)性腦出血1 790萬例(占17.2%),占因腦卒中死亡患者總數(shù)的50%[1,3-4]。自發(fā)性腦出血好發(fā)于中老年期,且隨著我國老齡化社會進(jìn)程的加快,老年自發(fā)性腦出血的發(fā)生率呈大幅上升趨勢[5]。近年來,自發(fā)性腦出血的診斷、治療、預(yù)防等方面已取得重大進(jìn)展,常用的診斷方法有腦成像和血管成像如CT或MRI等;治療包括急性醫(yī)療管理、外科手術(shù)管理、二級預(yù)防和抗血栓藥物管理等[6]。然而,自發(fā)性腦出血患者的臨床預(yù)后仍很差,具有高死亡率和高致殘率的特點(diǎn)[7],給患者、家庭和社會帶來巨大的負(fù)擔(dān)。因此,需要進(jìn)一步明確自發(fā)性腦出血發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制,尋找用于早期篩查的潛在分子靶標(biāo)和診斷標(biāo)志物。本研究從基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus,GEO)下載GSE24265數(shù)據(jù)集,利用生物信息學(xué)技術(shù)分析在老年自發(fā)性腦出血發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用的相關(guān)通路及關(guān)鍵基因,從而為老年自發(fā)性腦出血的早期診斷和防治提供借鑒。

    1 資料與方法

    1.1 數(shù)據(jù)集的獲取 2021年9—10月,從GEO下載GSE24265數(shù)據(jù)集,平臺號為GPL570[HG-U133_Plus_2]Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array。GSE24265數(shù)據(jù)集包括4例老年自發(fā)性腦出血死亡患者(中位年齡為79歲)的11個(gè)腦樣本,本研究從其中選取4個(gè)血腫周圍區(qū)域樣本(包括GSM596842、GSM596845、GSM596848、GSM596850)作為實(shí)驗(yàn)組,相應(yīng)的4個(gè)對側(cè)灰質(zhì)樣本(包括GSM596843、GSM596846、GSM596849、GSM596851)作為對照組。

    1.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理 去掉GSE24265數(shù)據(jù)集中一個(gè)探針對應(yīng)多個(gè)分子的探針,當(dāng)遇到對應(yīng)同一個(gè)分子的探針時(shí),僅保留信號值最大的探針;采用R軟件(3.6.3版本)對過濾后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與可視化,其中統(tǒng)一流形逼近與投影(uniform manifold approximation and projection,UMAP)包(0.2.7.0版本)用于UMAP分析,ggplot2包(3.3.3版本)用于繪制樣本數(shù)據(jù)歸一化的箱式圖、主成分分析(principal components analysis,PCA)散點(diǎn)圖和UMAP圖。

    1.3 差異基因的篩選 差異基因的篩選參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)為logFC>1,校正P值<0.05。采用R軟件(3.6.3版本)進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析與可視化:采用ggplot2包(3.3.3版本)繪制火山圖,以直觀地展示每個(gè)差異基因在每個(gè)樣本中的分布情況;采用ComplexHeatmap包(2.2.0版本)繪制熱圖,以直觀地展示每個(gè)差異基因在每個(gè)樣本中的表達(dá)情況[8]。

    1.4 GO功能、KEGG通路富集分析及基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA) 利用R軟件(3.6.3版本)進(jìn)行GO功能、KEGG通路富集分析及GSEA,其中org.Hs.eg.db包(3.10.0版本)用于ID轉(zhuǎn)換,clusterProfiler包(3.14.3版本)用于富集分析,ggplot2(3.3.3版本)包用于可視化圖的制作[9]。GSEA參考的基因集為c2.cp.v7.2.symbols.gmt[Curated],基因集數(shù)據(jù)庫為MSigDB Collections。GO功能、KEGG通路富集分析以校正P值<0.05為閾值來篩選差異基因的主要富集功能和通路;GSEA以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,F(xiàn)DR)<0.25且校正P值<0.05為顯著富集[10]。

    1.5 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction networks,PPI)的制作及關(guān)鍵基因的選取 采用STRING數(shù)據(jù)庫[11](http://string-db.org)對差異基因制作PPI,其互作分?jǐn)?shù)閾值為0.40,再將所得結(jié)果導(dǎo)入cytoscape軟件(3.8.2版本)以分析PPI圖,采用MCOD、cytoHubba插件的MCC計(jì)算法進(jìn)行關(guān)鍵基因的篩選;利用韋恩圖在線工具將MCOD、cytoHubba插件篩選出來的關(guān)鍵基因進(jìn)行交叉比對,最終獲得老年自發(fā)性腦出血的關(guān)鍵基因。

    2 結(jié)果

    2.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理結(jié)果 箱式圖分析結(jié)果顯示,各個(gè)樣本中位數(shù)基本在一個(gè)水平線上,提示樣本間歸一化程度好,見圖1;PCA散點(diǎn)圖和UMAP圖分析結(jié)果顯示,各組的樣本基本分開,提示后續(xù)差異分析有意義的結(jié)果可能會較多,見圖2~3。

    圖1 兩組樣本數(shù)據(jù)的箱式圖Figure 1 Boxplots of two sets of sample data

    圖2 兩組樣本數(shù)據(jù)的PCA散點(diǎn)圖Figure 2 PCA scatter plot of two sets of sample data

    圖3 兩組樣本數(shù)據(jù)的UMAP圖Figure 3 UMAP plot of two sets of sample data

    2.2 差異基因篩選結(jié)果 兩組樣本數(shù)據(jù)比較共有415個(gè)差異基因,其中高表達(dá)53個(gè)、低表達(dá)362個(gè),見圖4~5。

    圖4 差異基因的火山圖Figure 4 Volcano map of differential genes

    圖5 差異基因的熱圖Figure 5 Heatmap of differential genes

    2.3 GO功能、KEGG通路富集分析及GSEA結(jié)果 GO功能富集分析共得到226條有明顯差異的GO條目,包括145條生物過程(biological process,BP)條目、44條細(xì)胞組成(cellular component,CC)條目、37條分子功能(molecular function,MF)條目,差異基因介導(dǎo)的BP主要富集于化學(xué)突觸傳遞的調(diào)節(jié)、突觸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控、神經(jīng)元投射發(fā)育的調(diào)節(jié)、樹突發(fā)育、軸突發(fā)生,CC主要富集于突觸膜、突觸后密度蛋白、谷氨酸能突觸、神經(jīng)元到神經(jīng)元突觸、非對稱性突觸,MF主要富集于陽離子通道活性調(diào)控、門控通道活性調(diào)控、鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性調(diào)控、離子門控通道活性調(diào)控、跨膜腎上腺素受體活性調(diào)控,見圖6A~6C。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,差異基因主要富集于軸突導(dǎo)向信號通路、催產(chǎn)素信號通路、肥厚型心肌病、擴(kuò)張型心肌病、致心律失常性右心室心肌病等17條通路,見圖6D。GSEA結(jié)果顯示,共有734個(gè)基因集,其中顯著富集的基因集共有364個(gè),包括人體補(bǔ)體系統(tǒng)、無意義介導(dǎo)的衰變、流感病毒感染、含硒氨基酸的代謝、信號識別粒子(sigllal recogllition panicle,SRP)依賴性共翻譯蛋白靶向膜、真核翻譯起始、Slits和Robos的表達(dá)調(diào)節(jié)、細(xì)胞核和胞質(zhì)中的rRNA修飾等,見圖7。

    圖6 GO功能、KEGG通路富集分析排名前5位的差異基因的可視化圖Figure 6 Visualization of the top 5 differential genes in GO function and KEGG pathway enrichment analysis

    2.4 PPI及關(guān)鍵基因選取結(jié)果 MCOD插件分析結(jié)果顯示,一共有11個(gè)聚類,選擇分?jǐn)?shù)最高的聚類1,得分為10.364分、節(jié)點(diǎn)為12個(gè)、邊數(shù)為57條,篩選出的關(guān)鍵基因?yàn)镽PS6、RPL8、KCNV1、FAU、RPL35、KCNS1、SMKR1、RPS5、DOCK4、KCNQ5、RPS19、RPLP1,見圖8;cytoHubba插件分析結(jié)果顯示,按照得分由高到低的關(guān)鍵基因依次為RPS6、RPS5、RPS19、RPL8、RPL35、RPLP1、FAU、EPHB1、EFNB3、EFNB2,見圖9。最終篩選出老年自發(fā)性腦出血的關(guān)鍵基因?yàn)镽PS6、RPL8、FAU、RPL35、RPS5、RPS19、RPLP1。

    圖8 MCODE插件分析結(jié)果Figure 8 MCODE plug-in analysis results

    圖9 cytoHubba插件分析結(jié)果Figure 9 cytoHubba plug-in analysis results

    3 討論

    自發(fā)性腦出血是一種致命的腦血管疾病,具有高死亡率和高發(fā)病率的特點(diǎn),占所有腦卒中患者的10%~20%[12-13],會導(dǎo)致不良預(yù)后和嚴(yán)重的精神運(yùn)動(dòng)性障礙。隨著全球人口老齡化的加劇,老年自發(fā)性腦出血患者越來越多,尤其在人口老齡化問題尤為突出的中國[13]。迄今為止,尚未發(fā)現(xiàn)有效的手術(shù)或藥物療法可以改善自發(fā)性腦出血患者的功能預(yù)后。因此,探索并尋找老年自發(fā)性腦出血新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)非常重要。本研究旨在利用生物信息學(xué)技術(shù)分析老年自發(fā)性腦出血的相關(guān)通路及關(guān)鍵基因。

    本研究結(jié)果顯示,兩組樣本數(shù)據(jù)比較共有415個(gè)差異基因,其中高表達(dá)53個(gè)、低表達(dá)362個(gè)。進(jìn)一步進(jìn)行GO功能富集分析,結(jié)果顯示,差異基因介導(dǎo)的BP主要富集于化學(xué)突觸傳遞的調(diào)節(jié)、突觸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控、神經(jīng)元投射發(fā)育的調(diào)節(jié)、樹突發(fā)育、軸突發(fā)生,CC主要富集于突觸膜、突觸后密度蛋白、谷氨酸能突觸、神經(jīng)元到神經(jīng)元突觸、非對稱性突觸,MF主要富集于陽離子通道活性調(diào)控、門控通道活性調(diào)控、鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性調(diào)控、離子門控通道活性調(diào)控、跨膜腎上腺素受體活性調(diào)控。既往研究表明,突觸后密度蛋白有望成為改善腦出血患者預(yù)后的靶標(biāo),并可提高腦出血大鼠的認(rèn)知功能和學(xué)習(xí)能力,減輕腦出血后繼發(fā)性腦損傷和行為認(rèn)知障礙[14-15]。谷氨酸能突觸在大鼠腦出血發(fā)病12 h和24 h后過渡到細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[15]。本研究KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,差異基因主要富集于軸突導(dǎo)向信號通路、催產(chǎn)素信號通路、肥厚型心肌病、擴(kuò)張型心肌病、致心律失常性右心室心肌病等17條通路。既往研究表明,軸突導(dǎo)向蛋白濃度與腦出血的炎癥反應(yīng)、出血嚴(yán)重程度和臨床預(yù)后密切相關(guān)[16];腦卒中后抑郁患者差異表達(dá)基因主要作用于軸突導(dǎo)向信號通路[17]。

    由于傳統(tǒng)篩選差異基因的方法會掩蓋一些表達(dá)上調(diào)倍數(shù)較低但具有重要生物學(xué)意義的基因,本研究采用GSEA來篩選與老年自發(fā)性腦出血有關(guān)的基因集,結(jié)果顯示,共有734個(gè)基因集,其中顯著富集的基因集共有364個(gè),包括人體補(bǔ)體系統(tǒng)、無意義介導(dǎo)的衰變、流感病毒感染、含硒氨基酸的代謝、SRP依賴性共翻譯蛋白靶向膜、真核翻譯起始、Slits和Robos的表達(dá)調(diào)節(jié)、細(xì)胞核和胞質(zhì)中的rRNA修飾等。既往研究表明,補(bǔ)體系統(tǒng)在腦出血發(fā)生后被激活,主要表現(xiàn)為癥狀出現(xiàn)后的最初24 h內(nèi)腦出血患者補(bǔ)體系統(tǒng)的凝集素通路介導(dǎo)的蛋白濃度與健康個(gè)體存在明顯差異[18],激活的補(bǔ)體系統(tǒng)可對神經(jīng)元產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用,對腦組織產(chǎn)生繼發(fā)性損傷[19]。突變體COL4A1的無意義介導(dǎo)的衰變明顯減少,使COL4A1的單倍體不足,這是腦出血的原因[20]。流感病毒感染觸發(fā)細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng),可加重缺血性腦損傷并增加組織纖溶酶原激活劑治療后腦出血的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[21],也可使腦卒中后溶栓患者的血漿MMP-9水平升高,而血漿MMP-9水平升高與溶栓后腦出血相關(guān)[22]。Slits是一種分泌型糖蛋白,可與跨膜受體家族成員Robos結(jié)合,在大腦海馬區(qū)中廣泛表達(dá),具有區(qū)域偏好[23]。

    本研究最終篩選出老年自發(fā)性腦出血的關(guān)鍵基因?yàn)镽PS6、RPL8、FAU、RPL35、RPS5、RPS19、RPLP1。其中RPS6是一種核糖體蛋白,是40S核糖體亞基的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)成分[24],在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞的發(fā)育和維持中起著至關(guān)重要的作用,且與放化療和多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)相關(guān)[25];限制RPS6可抑制上皮性卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力,故RPS6可能成為上皮性卵巢癌的新型生物標(biāo)志物和分子靶標(biāo)[26]。RPS6是第一個(gè)顯示出磷酸化作用的核糖體蛋白[27],RPS6磷酸化是被廣泛使用的跟蹤腦神經(jīng)元活性變化的標(biāo)志物[28],且RPS6磷酸化對于神經(jīng)元的整個(gè)蛋白質(zhì)合成是不可或缺的,可能控制特定大腦區(qū)域[29]。RPL8是一種核糖體蛋白,研究表明,RPL8在腦出血患者腦組織中的表達(dá)水平增加[30]。FAU是一種核糖體蛋白,可能是缺血性腦卒中的新預(yù)后生物標(biāo)志物和潛在治療靶標(biāo)[31]。RPL35是一種核糖體蛋白,研究表明,人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中RPL35水平升高提示預(yù)后不良[32]。RPS5是一種核糖體蛋白,與酒精相關(guān)性肝癌的發(fā)展有關(guān),對患者預(yù)后具有重要的預(yù)測價(jià)值[33],且被確定為結(jié)腸癌患者復(fù)發(fā)和進(jìn)展的危險(xiǎn)因素[34]。RPS19是一種核糖體蛋白,是40S核糖體亞基的構(gòu)成成分,其精氨酸67缺失,先天性純紅細(xì)胞再生障礙性貧血患者可表現(xiàn)出顱面、骨骼和腦部異常,并伴有各種神經(jīng)行為異常[35]。RPLP1是一種關(guān)鍵的核糖體蛋白,對神經(jīng)系統(tǒng)胚胎和大腦發(fā)育至關(guān)重要[36],其與腫瘤發(fā)生和原代細(xì)胞永生化有關(guān),是三陰性乳腺癌患者預(yù)后不良的潛在生物標(biāo)志物和阻止癌癥轉(zhuǎn)移的治療靶標(biāo)[37]。

    綜上所述,與老年自發(fā)性腦出血發(fā)病機(jī)制有關(guān)的信號通路包括軸突導(dǎo)向信號通路、催產(chǎn)素信號通路、肥厚型心肌病、擴(kuò)張型心肌病、致心律失常性右心室心肌病等;其關(guān)鍵基因?yàn)镽PS6、RPL8、FAU、RPL35、RPS5、RPS19、RPLP1。這為進(jìn)一步研究老年自發(fā)性腦出血的機(jī)制提供了理論基礎(chǔ),為腦出血的臨床診治和預(yù)防提供了理論依據(jù)。但本研究是基于生物信息學(xué)方法對GEO中的4例老年自發(fā)性腦出血死亡患者的4個(gè)血腫周圍區(qū)域樣本和相應(yīng)的4個(gè)對側(cè)灰質(zhì)樣本進(jìn)行比較分析,研究結(jié)果具有一定局限性,只能對相關(guān)信號通路和關(guān)鍵基因參與老年自發(fā)性腦出血的發(fā)生發(fā)展過程提出合理猜想,其相互作用的具體機(jī)制還需要更多的探究與實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

    作者貢獻(xiàn):秦莉花進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì),負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校,對文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理;劉玲玲撰寫、修訂論文;王國佐、李子瀅、黃娟負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)收集、整理;李晟、陳彥霖、林霞負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)分析。

    本文無利益沖突。

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