Akt、mTOR和PD-L1表達(dá)與肺癌臨床病理特征的相關(guān)性

胡祥坤 潘春香 孫如坤 王艷杰 鹿 敏

肺癌是全球常見的惡性腫瘤之一，其中約85%以上為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，目前臨床治療方式有手術(shù)、化療、放療等，而對晚期NSCLC患者來說這些方式的效果均有限[1]。而近年來免疫療法取得了長足的進(jìn)展，程序性死亡配體-1(programmed death 1，PD-1)/程序性死亡受體配體-1(programmed death ligand 1，PD-L1)通路能夠抑制T細(xì)胞活化，從而使腫瘤細(xì)胞逃離免疫系統(tǒng)監(jiān)視[2]。而PD-1、PD-L1靶點(diǎn)抑制劑能夠消滅腫瘤，這為臨床開辟了一種新的治療選擇，在黑色素瘤、肺癌等疾病治療過程中取得顯著效果[3]。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphati-dylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB，又稱AKT)/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路對腫瘤細(xì)胞血管生成、細(xì)胞增殖等具有一定的調(diào)控作用[4]。近來發(fā)現(xiàn)AKT、mTOR可能是治療肺癌的有效靶分子，但具體作用機(jī)制尚未完全清楚[5]。因此，本研究旨在探討Akt、mTOR和PD-L1表達(dá)與肺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性，為進(jìn)一步應(yīng)用應(yīng)用針對Akt、mTOR和PD-L1的免疫治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2014年5月至2016年5月來我院就診的肺癌患者96例，納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)影像學(xué)及病理學(xué)結(jié)果確診為NSCLC；②手術(shù)方式為R0切除；③患者臨床資料完整；④預(yù)計(jì)生存時(shí)間>3個(gè)月以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有其他惡性腫瘤患者；②伴有心臟、腎臟等重要器官功能障礙患者；③入組前4個(gè)月行抗腫瘤治療；④妊娠或哺乳期婦女。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會同意。

1.2 方法

樣本收集：取患者癌組織及癌旁組織，標(biāo)本固定及包埋等處理按照我院病理科常規(guī)，經(jīng)HE染色后再顯微鏡下觀察，并根據(jù)2004版世界衛(wèi)生組織肺癌組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)評估腫瘤標(biāo)本組織學(xué)分級。免疫組化：采用SP法，石蠟切片用常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度無水乙醇進(jìn)行水化，將其置于3%的H2O2溶液中浸泡，PBS緩沖液清洗切片，共3次，加入正常山羊血清進(jìn)行封閉20 min，加入兔抗人Akt、mTOR(按照1∶200稀釋，購自美國CST公司)和PD-L1抗體(按照1∶200稀釋，購自英國Abcam公司)多克隆抗體，37℃下孵育1 h，TBST沖洗2次。加入鼠兔通用二抗，37℃下孵育1 h，PBS沖洗2次，再加入DAB顯色、蘇木精復(fù)染、梯度酒精分化，并進(jìn)行風(fēng)干及封片，于顯微鏡下觀察。染色用PBS液代替一抗作陰性對照，已知陽性染片做陽性對照。結(jié)果判定：參考文獻(xiàn)[6]，PD-L1在腫瘤細(xì)胞以及癌間質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)，主要定位于細(xì)胞膜，切片染色為淡黃色至棕褐色，染色強(qiáng)度得分：無染色：0分，淡黃色：1分，棕黃色：2分，棕褐色：3分；陽性細(xì)胞百分比得分：無陽性細(xì)胞記0分，陽性細(xì)胞<25%記為1分，陽性細(xì)胞數(shù)在25%～50%記為2分，陽性細(xì)胞數(shù)>50%記為3分；總分為染色強(qiáng)度得分×陽性細(xì)胞百分比得分；分?jǐn)?shù)≤2分記為陰性；分?jǐn)?shù)>2分記為陽性。Akt在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，mTOR主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，染色強(qiáng)度評分如下：無染色：0分，淡黃色：1分，棕黃色：2分，棕褐色：3分；染色面積評分如下：0分為無細(xì)胞染色，染色面積<10%記為1分，染色面積10%～50%記為2分，染色面積50%～75%為3分，染色面積>75%為4分。以染色強(qiáng)度及面積的評分相加為最后得分，0～2分為陰性，3分及以上為陽性。

1.3 觀察指標(biāo)

所有患者入院后收集其一般資料，性別、年齡、病理類型、腫瘤部位、TNM分期、腫瘤大小、分化程度、淋巴是否轉(zhuǎn)移。以電話及門診形式對所有患者進(jìn)行隨訪，隨訪內(nèi)容包括：患者病情進(jìn)展、影像學(xué)檢查，記錄患者生存情況，在第1年每3個(gè)月隨訪1次，第2～5年，每6個(gè)月隨訪1次，隨訪截止時(shí)間2021年5月。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-Rank檢驗(yàn)進(jìn)行，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-L1表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系

PD-L1主要在肺癌細(xì)胞及癌間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，96例患者癌細(xì)胞中PD-L1陽性率為58.33%，癌間質(zhì)細(xì)胞中陽性表達(dá)率為63.54%。PD-L1表達(dá)與腫瘤部位、TNM分期、分化程度相關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡、病理類型、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)，見表1。

表1 PD-L1表達(dá)與 NSCLC臨床病理特征的關(guān)系/例

2.2 Akt、mTOR表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系

Akt在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，mTOR主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，Akt及mTOR陽性表達(dá)率分別為60.42%、62.50%。Akt表達(dá)與TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度相關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡、病理類型、腫瘤部位無關(guān)(P>0.05)。mTOR表達(dá)與腫瘤部位、TNM分期、分化程度相關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡、病理類型、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)，見表2。

表2 Akt、mTOR表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系/例

2.3 PD-L1與Akt、mTOR的關(guān)系

PD-L1在Akt陽性組中的表達(dá)率高于Akt陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，PD-L1在mTOR陽性組中的表達(dá)率高于mTOR陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 PD-L1和Akt、mTOR的關(guān)系/例

2.4 Akt、mTOR和PD-L1的表達(dá)對患者總生存期的影響

隨訪5年，存活45例，總生存率為46.88%，PD-L1陰性組5年生存率為60.00%(24/40)，高于PD-L1陽性組的37.50%(21/56)(P<0.05)，Akt陰性組5年生存率為65.79%(25/38)，高于Akt陽性組的34.48%(20/58)(P<0.05)，mTOR陰性組5年生存率為72.22%(26/36)，高于mTOR陽性組的31.67%(19/60)(P<0.05)，見圖1。

圖1 PD-L1、Akt和mTOR的表達(dá)對患者總生存期的影響

3 討論

肺癌是世界發(fā)病率及死亡率最高的癌癥，NSCLC其常見類型，包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌及大細(xì)胞癌，大部分NSCLC患者確診時(shí)已為晚期，不能進(jìn)行手術(shù)治療，患者預(yù)后較差，因而探索NSCLC的發(fā)生機(jī)制和新的治療方式顯得尤為重要[7]。NSCLC的發(fā)展過程是多基因、多因素共同參與的結(jié)果，隨著人們對腫瘤細(xì)胞免疫逃逸機(jī)制的深入了解，免疫治療已成為目前的研究熱點(diǎn)。

PD-1是CD28家族的成員之一，在人體內(nèi)PD-1蛋白主要表達(dá)于腫瘤組織的T淋巴細(xì)胞及相關(guān)淋巴細(xì)胞[8]。PD-L1是一種協(xié)同信號分子，又稱B7-H1，作為PD-1的主要配體，其已被證實(shí)廣泛表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞表面[9]。正常情況下PD-1與PD-L1結(jié)合，通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞與抗原提呈細(xì)胞或T細(xì)胞與靶細(xì)胞接觸時(shí)間，介導(dǎo)免疫逃逸，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生及發(fā)展[10]。研究表明[11]PD-1/PD-L1通路是腫瘤微環(huán)境中重要的“哨卡點(diǎn)”，其表達(dá)可能與腎癌、肺癌的臨床病理特征及不良預(yù)后相關(guān)。還有研究表明[12]PD-1/PD-L1通路可作為肺癌個(gè)體化治療的有效治療靶點(diǎn)。本研究中，PD-L1主要在肺癌細(xì)胞及癌間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，96例患者癌細(xì)胞中PD-L1的陽性率為58.33%，癌間質(zhì)細(xì)胞中陽性表達(dá)率為63.54%。而進(jìn)一步研究PD-L1的表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征發(fā)現(xiàn)，PD-L1的表達(dá)與腫瘤部位、TNM分期、分化程度相關(guān)。腫瘤部位存在差異，這可能與左、右肺部微環(huán)境存在一定差異相關(guān)[13]。而對于TNM晚期及分化程度較低患者，其PD-L1陽性表達(dá)率較高，這可能是PD-L1的陽性表達(dá)使得免疫細(xì)胞無法有效清除腫瘤細(xì)胞相關(guān)，使疾病進(jìn)一步發(fā)展[14]。隨訪5年，PD-L1陰性組的5年生存率為60.00%，高于PD-L1陽性組的37.50%(P<0.05)，提示PD-L1陰性是預(yù)后較好的指標(biāo)。

研究發(fā)現(xiàn)，約90%的NSCLC細(xì)胞株存在PI3K/AKT/MTOR通路的激活[15]。PI3K屬于磷脂激酶家族，Akt是一種原癌基因，通過磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，控制細(xì)胞的凋亡、侵襲及血管生成等過程。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶，是Akt的下游分子，從酵母到哺乳動物均廣泛存在，能調(diào)節(jié)細(xì)胞的各過程，包括蛋白質(zhì)合成、生長、代謝等，在子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、胰腺癌中均發(fā)現(xiàn)mTOR表達(dá)水平異常升高。研究[16]表明PI3K/AKT/mTOR通路將有絲分裂信號傳遞給p70s6k，使細(xì)胞周期蛋白和CDK4表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致蛋白p21Cip1/WAF1和p27Kip1表達(dá)下調(diào)，促使細(xì)胞從G1期向S期進(jìn)展。本研究中，Akt在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，mTOR主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，Akt及mTOR陽性表達(dá)率分別為60.42%、62.50%，與既往結(jié)果相一致。本研究發(fā)現(xiàn)，Akt的表達(dá)與TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度相關(guān)，mTOR的表達(dá)與腫瘤部位、TNM分期、分化程度相關(guān)。隨訪5年，發(fā)現(xiàn)Akt陰性組的5年生存率為65.79%，高于Akt陽性組的34.48%，mTOR陰性組的5年生存率為72.22%，高于mTOR陽性組的31.67%。由此可見Akt及mTOR與患者的臨床病理特征及預(yù)后存在一定關(guān)系。

同時(shí)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1在Akt陽性組中的表達(dá)率高于Akt陰性組，同時(shí)PD-L1在mTOR陽性組中的表達(dá)率高于mTOR陰性組，這提示PD-L1的表達(dá)與Akt、mTOR的表達(dá)均在一定聯(lián)系。有研究發(fā)現(xiàn)[17]，PI3K/AKT/mTOR通路可影響腫瘤微環(huán)境內(nèi)免疫細(xì)胞的活性及PD-1與PD-L1表達(dá)，參與免疫抑制微環(huán)境的形成，阻斷PI3K/AKT/mTOR通路，恢復(fù)患者機(jī)體的免疫應(yīng)答，增強(qiáng)抗腫瘤固有的免疫效應(yīng)。當(dāng)然本研究還存在一定不足，關(guān)于PD-L1、Akt、mTOR與患者預(yù)后關(guān)系仍需擴(kuò)大大樣本，并進(jìn)行前瞻性、隨機(jī)對照試驗(yàn)加以證實(shí)。

綜上，Akt、mTOR和PD-L1過表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征存在一定關(guān)系，對患者的預(yù)后判斷起著重要的指導(dǎo)作用，為臨床治療提供新的思路。