細(xì)胞色素CYP17a1 基因在錦鯉性腺不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析

史東杰，譚 政，，張 強(qiáng)，伍仕弘，魏 東，李文通，王賽賽，孫硯勝，姜巨峰

（1. 北京市農(nóng)林科學(xué)院 水產(chǎn)科學(xué)研究所，北京 100068；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097；3. 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津 300380；4. 北京市通州區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 101101；5. 北京雅仕錦鯉養(yǎng)殖技術(shù)有限公司，北京 102615；6. 天津市水產(chǎn)研究所暨天津市觀賞魚(yú)技術(shù)工程中心，天津 300221）

魚(yú)類(lèi)早期性別決定與分化是一個(gè)可調(diào)控的發(fā)育過(guò)程，水溫、光照、酸堿度、養(yǎng)殖密度和外源激素等因素均能產(chǎn)生重要的影響[1]。細(xì)胞色素CYP17 或P450c17 作為性腺類(lèi)固醇激素、孕激素及糖皮質(zhì)激素生物合成的關(guān)鍵限速酶，其活性和表達(dá)在調(diào)控性腺發(fā)育、生殖細(xì)胞分化及第二性征維持等方面起到重要的作用[2?4]。在硬骨魚(yú)類(lèi)中，細(xì)胞色素CYP17 至少 有2 種 復(fù) 制 基 因，即CYP17a1和CYP17a2[5?6]。CYP17a1多在性腺表達(dá)，同時(shí)具有羥化酶和裂解酶的活性，而CYP17a2多在性腺和頭腎中表達(dá)，且僅有羥化酶活性[5?8]。目前，CYP17a1已在人類(lèi)、哺乳動(dòng)物和魚(yú)類(lèi)等多個(gè)物種被成功克隆[9?15]。有研究發(fā)現(xiàn)，CYP17a1在金錢(qián)魚(yú)（Scatophagus argus）的卵巢和精巢中表達(dá)量較高，且在Ⅳ期卵巢的表達(dá)量最高，說(shuō)明CYP17a1在金錢(qián)魚(yú)性腺發(fā)育過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用[14]。ZHOU 等[5]研究表明，CYP17a1對(duì)青鳉（Oryzias latipes）卵巢的卵母細(xì)胞分化過(guò)程中雌二醇的形成具有重要的作用。ZHAI 等[16]敲除斑馬魚(yú)（Danio rerio）CYP17a1基因后，雌性突變魚(yú)出現(xiàn)轉(zhuǎn)雄的現(xiàn)象，雄性突變魚(yú)的交配行為和第二性征缺失。此外，CYP17a1基因也與黃鱔（Monopterus albus）[17]、虹 鱒（Oncorhynchus mykiss）[18]、半 滑 舌 鰨（Cynoglossus semilaevis）[19]的性腺發(fā)育密切相關(guān)。以上研究表明，CYP17a1在魚(yú)類(lèi)精巢、卵巢發(fā)育，配子發(fā)生和性別決定等方面具有非常重要的調(diào)節(jié)作用。

錦 鯉 隸 屬 鯉 形 目（Cypriniformes）、鯉 科（Cyprinidae）、鯉屬（Cyprinus），其體型健美，色彩艷麗，斑紋變幻莫測(cè)，極具觀賞價(jià)值[19]。該魚(yú)不僅是我國(guó)名貴淡水觀賞魚(yú)類(lèi)的代表品種，也是研究魚(yú)類(lèi)體色遺傳機(jī)制的模式動(dòng)物。目前，有關(guān)錦鯉的研究多集中于人工選育、自然繁殖及營(yíng)養(yǎng)飼料等方面，而關(guān)于錦鯉生殖調(diào)控的研究鮮有報(bào)道。鑒于此，研究細(xì)胞色素CYP17a1基因在錦鯉雌雄性腺不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)規(guī)律，旨在為解析觀賞魚(yú)類(lèi)生殖調(diào)控機(jī)制提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試魚(yú) 1 齡、2 齡和3 齡錦鯉取自北京市觀賞魚(yú)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)大興綜合試驗(yàn)站，雌魚(yú)、雄魚(yú)各齡分別為36 尾，水溫通過(guò)溫控管控制在20～22 ℃，日常投喂正規(guī)廠(chǎng)家商品飼料，上下午定時(shí)各1次，日投喂量為魚(yú)體質(zhì)量的3%～5%，曝氣管充氧，自然光照。

1.1.2 主 要 試 劑 SYBR Premix ExTaqTMⅡKit、Passive Reference Dye Ⅱ、pMD19-T 和PrimeScript RT 試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；MMLV 購(gòu)自Promega 公司；瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、MS-222 購(gòu) 自Sigma 公 司；Trizol 試 劑 購(gòu) 自Invitrogen 公司；DNA Marker 購(gòu)自天根生物公司；考馬斯亮藍(lán)CBBG-250、牛血清白蛋白（BSA）、Cocktail蛋白酶、Western blot 聚丙烯酰胺凝膠和CYP17a1、β-actin抗體等均購(gòu)自北京兆儀世紀(jì)科技有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)SYBR Premix ExTaqTMⅡKit的引物設(shè)計(jì)原則，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)細(xì)胞色素CYP17a1基因和β-actin基因的特異引物。β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因。引物委托寶生物工程（大連）有限公司合成。引物序列信息見(jiàn)表1。

表1 引物信息Tab.1 Primers information

1.2.2 試驗(yàn)樣品 待供試魚(yú)養(yǎng)殖20 d 后，分別取1齡、2 齡和3 齡錦鯉卵巢、精巢、腦、肌肉、腎臟共5種組織，卵巢和精巢按照硬骨魚(yú)類(lèi)性腺發(fā)育Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期、Ⅵ期共6 個(gè)時(shí)期[20]取樣，每組3次重復(fù)。測(cè)量各齡錦鯉體質(zhì)量（Body weight，BW）、性腺質(zhì)量（Gonad weight，GW）、內(nèi)臟質(zhì)量（Visceral weight，GW），計(jì)算性腺成熟系數(shù)（GSI），GSI=GW/（BW-VW）×100%。卵巢、精巢組織用液氮速凍后保存在-80 ℃冰箱。

1.2.3 總RNA 的提取與cDNA 第一條鏈合成 采用Trizol 法提取1 齡、2 齡和3 齡錦鯉卵巢和精巢總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳確定RNA 完整性，要求OD260/OD280值為1.8～2.0[21]。將符合上述要求的樣本RNA 參照PrimeScript RT 試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)，分別將用于CYP17a1基因在錦鯉3 個(gè)年齡、6 個(gè)不同性腺發(fā)育時(shí)期表達(dá)研究的54 個(gè)樣本各1 μg RNA 進(jìn)行cDNA 第一條鏈的合成，并進(jìn)行適量稀釋。保存在-80 ℃冰箱。

1.2.4 引物特異性驗(yàn)證 溶解曲線(xiàn)由實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀（ABI 7500HT platform， Applied Biosystems）自動(dòng)生成。溶解曲線(xiàn)僅有1 個(gè)峰值說(shuō)明其是特異性產(chǎn)物擴(kuò)增獲得，以此來(lái)鑒定RT-PCR 試驗(yàn)中所用引物的特異性。1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè) 將錦鯉β-actin基因和CYP17a1基因cDNA 原液按照51、52、53、54倍進(jìn)行稀釋?zhuān)拷M設(shè)3個(gè)平行，陰性對(duì)照為蒸餾水。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系：共20 μL，其中2×SYBR Premix ExTaqⅡ10 μL，上下游引物（10 μmol/L）分別 為 0.6 μL，cDNA 模 板 1.0 μL，50×Passive Reference Dye Ⅱ0.4 μL，蒸餾水7.4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃變性5 s；58 ℃退火40 s，95 ℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品均重復(fù)3 次。繪制β-actin基因和CYP17a1基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.6 Western blot 分析 取出封存于-80 ℃冰箱的不同發(fā)育時(shí)期性腺樣品，解凍研磨成粉狀，加入含有Cocktail 蛋白酶制劑的蛋白質(zhì)抽提液，冰上裂解20 min，然后在4 ℃條件下15 000 r/min 離心20 min，取上清液，采用Bradford 考馬斯亮藍(lán)法[22]測(cè)定總蛋白質(zhì)濃度。參照鄒立軍等[23]對(duì)斑馬魚(yú)JNKs蛋白Western blot 方法步驟操作。將硝酸纖維素膜的顯影結(jié)果采用Sigmaplot 和Glpro32 軟件計(jì)算CYP17a1/β-actin灰度比值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

基因相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算[24]。數(shù)據(jù)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行單因子方差和多重比較分析，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 錦鯉性腺不同發(fā)育時(shí)期GSI的變化

從表2 可以看出，1～3 齡錦鯉雌魚(yú)、雄魚(yú)性腺發(fā)育不同時(shí)期GSI 變化規(guī)律基本相同，但卵巢GSI 均明顯高于精巢。GSI 在3 齡錦鯉卵巢發(fā)育至Ⅴ期時(shí)最高，達(dá)到28.64%；隨后卵巢進(jìn)入Ⅵ期，即剛產(chǎn)完卵的卵巢，GSI 顯著降低（P<0.05），但卵巢成熟前的Ⅰ—Ⅳ期的GSI 值顯著增加（P<0.05）。1～3 齡錦鯉精巢GSI 明顯低于卵巢，雖然在精巢Ⅴ期時(shí)出現(xiàn)峰值，但僅為9.57%；隨著繁殖結(jié)束，精巢進(jìn)入退化吸收階段，此時(shí)精巢處于Ⅵ期，為退化期，GSI 顯著降低（P<0.05），直至翌年精巢發(fā)育期Ⅰ—Ⅳ期有所升高，但與Ⅵ期相比，無(wú)顯著性差異（P>0.05）。

表2 1齡、2齡和3齡錦鯉GSI的變化Tab.2 Profiles of GSI in one-year-old，two-year-old，and three-year-old Cyprinus carpio %

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物特異性驗(yàn)證及擴(kuò)增效率鑒定

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)顯示，β-actin基因和CYP17a1基因分別在88.35 ℃和85.47 ℃時(shí)具有特異性單一峰，且整條曲線(xiàn)無(wú)雜峰，說(shuō)明β-actin基因和CYP17a1基因特異產(chǎn)物單一，未產(chǎn)生引物二聚體，可滿(mǎn)足后續(xù)試驗(yàn)要求。從圖1可以看出，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)結(jié)果顯示，β-actin基因和CYP17a1基因引物擴(kuò)增效率分別為94.873%和102.798%，Ct值標(biāo)準(zhǔn)偏差區(qū)間為0.02～0.15，線(xiàn)性程度在98%以上，表明試驗(yàn)所用引物可用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)，也可用2-△△Ct方法進(jìn)行基因表達(dá)量分析。

圖1 錦鯉β-actin 基因（A）和CYP17a1基因（B）的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Standard curves for the β-actin gene（A）and CYP17a1 gene（B）of Cyprinus carpio

2.3 CYP17a1基因在錦鯉不同組織的表達(dá)

由表3 可知，CYP17a1基因在1～3 齡錦鯉卵巢、精巢、腦、肌肉、腎臟等5種組織中都有表達(dá)，表現(xiàn)為精巢>卵巢>肌肉>腎臟>腦。各組織中CYP17a1基因的表達(dá)量差異顯著，在精巢中表達(dá)量最高，在腦組織表達(dá)量最低。CYP17a1基因在3齡錦鯉的精巢和卵巢中的表達(dá)量分別是腦組織的40.30 倍和42.87 倍，且其在精巢中的表達(dá)量是卵巢的1.80 倍。CYP17a1基因在錦鯉卵巢、精巢的表達(dá)量隨著年齡的增加有升高趨勢(shì)，但是在腦、肌肉和腎臟中無(wú)明顯差別。

表3 CYP17a1基因在1齡、2齡和3齡錦鯉5種組織的相對(duì)表達(dá)量Tab.3 Relative expression of CYP17a1 gene in five tissues of one-year-old，two-year-old，and three-year-old Cyprinus carpio

2.4 CYP17a1基因在錦鯉不同性腺發(fā)育時(shí)期的表達(dá)

如圖2所示，CYP17a1在1齡、2齡和3齡錦鯉卵巢組織Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期、Ⅵ期6個(gè)不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)量均呈先降低后升高趨勢(shì)，性成熟前期（Ⅰ期、Ⅱ期）顯著高于性成熟后期（Ⅵ期），性成熟后期（Ⅵ期）顯著高于性成熟期（Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期），CYP17a1基因在精巢的表達(dá)量與卵巢呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)。

圖2 CYP17a1基因在1齡（A）、2齡（B）和3齡（C）錦鯉6個(gè)性腺發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative expression level of CYP17a1 gene in six different developmental periods of gonads in Cyprinus carpio of the one-year-old（A），two-year-old（B），and three-year-old（C）instar

CYP17a1基因在不同年齡錦鯉卵巢組織的表達(dá)結(jié)果顯示，3齡錦鯉卵巢Ⅰ期表達(dá)量最高，是同齡錦鯉卵巢Ⅲ期和Ⅳ期表達(dá)量的2.31 倍和2.57 倍。CYP17a1基因在不同年齡錦鯉精巢組織的表達(dá)結(jié)果顯示，3齡錦鯉精巢Ⅰ期表達(dá)量最高，是同齡錦鯉精巢Ⅲ期和Ⅳ期表達(dá)量的2.75倍和3.13倍。

整體上，隨著年齡增長(zhǎng)，錦鯉CYP17a1基因各發(fā)育時(shí)期表達(dá)量均呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。3 齡時(shí)，各發(fā)育時(shí)期CYP17a1基因表達(dá)量較高；在3 齡錦鯉精巢Ⅰ期表達(dá)量最高，為同期卵巢的1.82倍。

2.5 CYP17a1蛋白在錦鯉不同性腺發(fā)育時(shí)期的表達(dá)

如圖3 所示，CYP17a1 蛋白在1～3 齡錦鯉精巢發(fā)育不同時(shí)期呈現(xiàn)出明顯波動(dòng)，其表達(dá)趨勢(shì)與基因mRNA 表達(dá)模式一致，即精巢性成熟Ⅰ期、Ⅱ期表達(dá)量最高，到達(dá)精巢成熟期Ⅲ～Ⅴ期顯著降低，隨著精巢進(jìn)入性成熟Ⅵ期，CYP17a1 蛋白的表達(dá)量逐漸升高。

圖3 CYP17a1 蛋白在1齡（A）、2齡（B）和3齡（C）錦鯉6個(gè)性腺發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)豐度Fig.3 The relative expression of CYP17a1 protein in six different developmental periods of gonads in Cyprinus carpio of the one-year-old（A），two-year-old（B），and three-year-old（C）instar

CYP17a1 蛋白在1 齡、2 齡和3 齡錦鯉卵巢發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)量均較同齡同期精巢低，其中1 齡卵巢Ⅲ期表達(dá)水平最低。

3 結(jié)論與討論

細(xì)胞色素CYP 是一類(lèi)輔基為亞鐵血硫素蛋白酶基因家族，CYP17a 屬于CYP 的超級(jí)家族。CYP17a 在魚(yú)類(lèi)性腺發(fā)育中起到重要作用[2?4]。前人研究認(rèn)為，硬骨魚(yú)類(lèi)有2 個(gè)細(xì)胞色素CYP17a 基因，即CYP17a1和CYP17a2，且魚(yú)類(lèi)CYP17a1基因活性與哺乳動(dòng)物相一致[5?8]。CYP17a 是性腺合成與代謝中的關(guān)鍵酶，其遺傳的多態(tài)性能改變裂解酶和催化酶的活性。CYP活性部位含有400～500個(gè)血紅素基團(tuán)和氨基酸殘基，血紅素的第5 個(gè)配位鍵可將帶正電的鐵離子和帶負(fù)電的硫原子連接，從而完成CYP復(fù)雜的修飾調(diào)節(jié)功能[7?8]。

隨著人類(lèi)和哺乳動(dòng)物CYP17a 基因的廣泛研究[9?13]，關(guān)于其在魚(yú)類(lèi)中的表達(dá)試驗(yàn)也在同步開(kāi)展。陳孝紅等[21]采用RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)到CYP17a1基因在斑馬魚(yú)性成熟個(gè)體的卵巢、精巢、肌肉和腦等組織中均有表達(dá)，且精巢的表達(dá)量遠(yuǎn)高于卵巢。翟毅等[14]利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和RT-PCR 技術(shù)在金錢(qián)魚(yú)的精巢、卵巢、肝、腦和頭腎中，均檢測(cè)到CYP17a1基因的表達(dá)，而在心臟、肌肉、脾臟、腸和鰓中均未檢測(cè)到。本研究結(jié)果表明，CYP17a1基因在錦鯉卵巢、精巢、腦、肌肉和腎臟都有表達(dá)，且在精巢和卵巢中具有較高的表達(dá)水平。此外，與黃鱔[17]、綠鰭?cǎi)R面鲀[15]和斑馬魚(yú)[25]腦組織中的表達(dá)相似，在錦鯉的腦組織中同樣檢測(cè)到CYP17a1基因的表達(dá)。推測(cè)CYP17a1基因可能參與魚(yú)類(lèi)腦組織中類(lèi)固醇激素的合成與分泌。

對(duì)黃鱔[17]、斑馬魚(yú)[16]、虹鱒[18]、金錢(qián)魚(yú)[14]和青鳉[6]等硬骨魚(yú)類(lèi)研究發(fā)現(xiàn)，CYP17a 在性腺發(fā)育中扮演著重要的角色。楊蘭英等[26]研究發(fā)現(xiàn)，利用CRISPRI Cas9 技術(shù)敲除尼羅羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）細(xì)胞色素CYP17a 基因后，與對(duì)照組相比，敲除組雌魚(yú)無(wú)法正常產(chǎn)卵，且血清孕激素17a，20β雙羥孕酮和皮質(zhì)醇合成水平均顯著降低，敲除組雄魚(yú)精子發(fā)生延遲，且向前運(yùn)動(dòng)的精子比例降低，不運(yùn)動(dòng)的精子比例明顯升高。斑馬魚(yú)CYP17a1基因缺失后會(huì)出現(xiàn)性逆轉(zhuǎn)，雄魚(yú)精子量增加、雄性交配障礙和第2 性征缺失等現(xiàn)象[16]。將青鳉CYP17a1基因敲除后，雌、雄魚(yú)第二性征均出現(xiàn)丟失現(xiàn)象，雌魚(yú)卵巢呈現(xiàn)精巢形態(tài)，有大量精子存在，但無(wú)法正常配對(duì)[27]。

本研究中，CYP17a1基因在錦鯉6 個(gè)性腺發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量變化較大，呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì)，且在性成熟前期（Ⅰ期、Ⅱ期）的表達(dá)量顯著高于其他各期。SU 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在日本鰻魚(yú)（Anguilla japonica）的卵黃囊形成過(guò)程中，CYP17a1基因的高表達(dá)抑制了17α-羥基孕酮向MIH 17α，20β-二羥基-4-孕烯-3-酮的轉(zhuǎn)化，這也進(jìn)一步解析了人工養(yǎng)殖的日本鰻魚(yú)雌性性成熟率不高的原因。本研究中，CYP17a1基因在錦鯉精巢的表達(dá)量高于卵巢，進(jìn)一步說(shuō)明，在錦鯉和其他硬骨魚(yú)類(lèi)中，CYP17a1對(duì)精巢發(fā)育的調(diào)控作用要大于卵巢。此外，錦鯉性腺中CYP17a1基因的表達(dá)規(guī)律與金錢(qián)魚(yú)[14]CYP17a1基因和半滑舌鰨[29]P450c17-Ⅱ的表達(dá)規(guī)律相同，而與虹鱒[19]和綠鰭?cǎi)R面鲀[15]的研究結(jié)果不同，虹鱒的卵巢發(fā)育前期未檢測(cè)到CYP17a1基因，而綠鰭?cǎi)R面鲀的卵巢CYP17a1基因的表達(dá)量峰值出現(xiàn)在成熟期，推測(cè)原因可能與魚(yú)類(lèi)種質(zhì)差異及其在不同物種的調(diào)控作用不同有關(guān)?？梢?jiàn)，CYP17a1對(duì)魚(yú)類(lèi)性腺的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

綜上，CYP17a1在mRNA 水平的表達(dá)結(jié)果顯示，其在精巢的表達(dá)量遠(yuǎn)高于卵巢。Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，CYP17a1 蛋白的表達(dá)水平與mRNA 一致，暗示CYP17a1基因在錦鯉精巢發(fā)育及精子細(xì)胞分化成熟中發(fā)揮一定的調(diào)控作用。