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    細(xì)胞色素CYP17a1 基因在錦鯉性腺不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析

    2022-04-23 02:42:14史東杰伍仕弘李文通王賽賽孫硯勝姜巨峰
    河南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年2期
    關(guān)鍵詞:精巢性腺錦鯉

    史東杰,譚 政,,張 強(qiáng),伍仕弘,魏 東,李文通,王賽賽,孫硯勝,姜巨峰

    (1. 北京市農(nóng)林科學(xué)院 水產(chǎn)科學(xué)研究所,北京 100068;2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100097;3. 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院,天津 300380;4. 北京市通州區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,北京 101101;5. 北京雅仕錦鯉養(yǎng)殖技術(shù)有限公司,北京 102615;6. 天津市水產(chǎn)研究所暨天津市觀賞魚(yú)技術(shù)工程中心,天津 300221)

    魚(yú)類(lèi)早期性別決定與分化是一個(gè)可調(diào)控的發(fā)育過(guò)程,水溫、光照、酸堿度、養(yǎng)殖密度和外源激素等因素均能產(chǎn)生重要的影響[1]。細(xì)胞色素CYP17 或P450c17 作為性腺類(lèi)固醇激素、孕激素及糖皮質(zhì)激素生物合成的關(guān)鍵限速酶,其活性和表達(dá)在調(diào)控性腺發(fā)育、生殖細(xì)胞分化及第二性征維持等方面起到重要的作用[2?4]。在硬骨魚(yú)類(lèi)中,細(xì)胞色素CYP17 至少 有2 種 復(fù) 制 基 因,即CYP17a1和CYP17a2[5?6]。CYP17a1多在性腺表達(dá),同時(shí)具有羥化酶和裂解酶的活性,而CYP17a2多在性腺和頭腎中表達(dá),且僅有羥化酶活性[5?8]。目前,CYP17a1已在人類(lèi)、哺乳動(dòng)物和魚(yú)類(lèi)等多個(gè)物種被成功克隆[9?15]。有研究發(fā)現(xiàn),CYP17a1在金錢(qián)魚(yú)(Scatophagus argus)的卵巢和精巢中表達(dá)量較高,且在Ⅳ期卵巢的表達(dá)量最高,說(shuō)明CYP17a1在金錢(qián)魚(yú)性腺發(fā)育過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用[14]。ZHOU 等[5]研究表明,CYP17a1對(duì)青鳉(Oryzias latipes)卵巢的卵母細(xì)胞分化過(guò)程中雌二醇的形成具有重要的作用。ZHAI 等[16]敲除斑馬魚(yú)(Danio rerio)CYP17a1基因后,雌性突變魚(yú)出現(xiàn)轉(zhuǎn)雄的現(xiàn)象,雄性突變魚(yú)的交配行為和第二性征缺失。此外,CYP17a1基因也與黃鱔(Monopterus albus)[17]、虹 鱒(Oncorhynchus mykiss)[18]、半 滑 舌 鰨(Cynoglossus semilaevis)[19]的性腺發(fā)育密切相關(guān)。以上研究表明,CYP17a1在魚(yú)類(lèi)精巢、卵巢發(fā)育,配子發(fā)生和性別決定等方面具有非常重要的調(diào)節(jié)作用。

    錦 鯉 隸 屬 鯉 形 目(Cypriniformes)、鯉 科(Cyprinidae)、鯉屬(Cyprinus),其體型健美,色彩艷麗,斑紋變幻莫測(cè),極具觀賞價(jià)值[19]。該魚(yú)不僅是我國(guó)名貴淡水觀賞魚(yú)類(lèi)的代表品種,也是研究魚(yú)類(lèi)體色遺傳機(jī)制的模式動(dòng)物。目前,有關(guān)錦鯉的研究多集中于人工選育、自然繁殖及營(yíng)養(yǎng)飼料等方面,而關(guān)于錦鯉生殖調(diào)控的研究鮮有報(bào)道。鑒于此,研究細(xì)胞色素CYP17a1基因在錦鯉雌雄性腺不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)規(guī)律,旨在為解析觀賞魚(yú)類(lèi)生殖調(diào)控機(jī)制提供參考。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 供試魚(yú) 1 齡、2 齡和3 齡錦鯉取自北京市觀賞魚(yú)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)大興綜合試驗(yàn)站,雌魚(yú)、雄魚(yú)各齡分別為36 尾,水溫通過(guò)溫控管控制在20~22 ℃,日常投喂正規(guī)廠(chǎng)家商品飼料,上下午定時(shí)各1次,日投喂量為魚(yú)體質(zhì)量的3%~5%,曝氣管充氧,自然光照。

    1.1.2 主 要 試 劑 SYBR Premix ExTaqTMⅡKit、Passive Reference Dye Ⅱ、pMD19-T 和PrimeScript RT 試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;MMLV 購(gòu)自Promega 公司;瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、MS-222 購(gòu) 自Sigma 公 司;Trizol 試 劑 購(gòu) 自Invitrogen 公司;DNA Marker 購(gòu)自天根生物公司;考馬斯亮藍(lán)CBBG-250、牛血清白蛋白(BSA)、Cocktail蛋白酶、Western blot 聚丙烯酰胺凝膠和CYP17a1、β-actin抗體等均購(gòu)自北京兆儀世紀(jì)科技有限公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

    1.2 方法

    1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)SYBR Premix ExTaqTMⅡKit的引物設(shè)計(jì)原則,用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)細(xì)胞色素CYP17a1基因和β-actin基因的特異引物。β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因。引物委托寶生物工程(大連)有限公司合成。引物序列信息見(jiàn)表1。

    表1 引物信息Tab.1 Primers information

    1.2.2 試驗(yàn)樣品 待供試魚(yú)養(yǎng)殖20 d 后,分別取1齡、2 齡和3 齡錦鯉卵巢、精巢、腦、肌肉、腎臟共5種組織,卵巢和精巢按照硬骨魚(yú)類(lèi)性腺發(fā)育Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期、Ⅵ期共6 個(gè)時(shí)期[20]取樣,每組3次重復(fù)。測(cè)量各齡錦鯉體質(zhì)量(Body weight,BW)、性腺質(zhì)量(Gonad weight,GW)、內(nèi)臟質(zhì)量(Visceral weight,GW),計(jì)算性腺成熟系數(shù)(GSI),GSI=GW/(BW-VW)×100%。卵巢、精巢組織用液氮速凍后保存在-80 ℃冰箱。

    1.2.3 總RNA 的提取與cDNA 第一條鏈合成 采用Trizol 法提取1 齡、2 齡和3 齡錦鯉卵巢和精巢總RNA,用瓊脂糖凝膠電泳確定RNA 完整性,要求OD260/OD280值為1.8~2.0[21]。將符合上述要求的樣本RNA 參照PrimeScript RT 試劑盒的使用說(shuō)明書(shū),分別將用于CYP17a1基因在錦鯉3 個(gè)年齡、6 個(gè)不同性腺發(fā)育時(shí)期表達(dá)研究的54 個(gè)樣本各1 μg RNA 進(jìn)行cDNA 第一條鏈的合成,并進(jìn)行適量稀釋。保存在-80 ℃冰箱。

    1.2.4 引物特異性驗(yàn)證 溶解曲線(xiàn)由實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀(ABI 7500HT platform, Applied Biosystems)自動(dòng)生成。溶解曲線(xiàn)僅有1 個(gè)峰值說(shuō)明其是特異性產(chǎn)物擴(kuò)增獲得,以此來(lái)鑒定RT-PCR 試驗(yàn)中所用引物的特異性。1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè) 將錦鯉β-actin基因和CYP17a1基因cDNA 原液按照51、52、53、54倍進(jìn)行稀釋?zhuān)拷M設(shè)3個(gè)平行,陰性對(duì)照為蒸餾水。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系:共20 μL,其中2×SYBR Premix ExTaqⅡ10 μL,上下游引物(10 μmol/L)分別 為 0.6 μL,cDNA 模 板 1.0 μL,50×Passive Reference Dye Ⅱ0.4 μL,蒸餾水7.4 μL。反應(yīng)條件:95 ℃變性5 s;58 ℃退火40 s,95 ℃延伸15 s,40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品均重復(fù)3 次。繪制β-actin基因和CYP17a1基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

    1.2.6 Western blot 分析 取出封存于-80 ℃冰箱的不同發(fā)育時(shí)期性腺樣品,解凍研磨成粉狀,加入含有Cocktail 蛋白酶制劑的蛋白質(zhì)抽提液,冰上裂解20 min,然后在4 ℃條件下15 000 r/min 離心20 min,取上清液,采用Bradford 考馬斯亮藍(lán)法[22]測(cè)定總蛋白質(zhì)濃度。參照鄒立軍等[23]對(duì)斑馬魚(yú)JNKs蛋白Western blot 方法步驟操作。將硝酸纖維素膜的顯影結(jié)果采用Sigmaplot 和Glpro32 軟件計(jì)算CYP17a1/β-actin灰度比值。

    1.3 數(shù)據(jù)分析

    基因相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算[24]。數(shù)據(jù)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行單因子方差和多重比較分析,顯著性水平設(shè)為0.05。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 錦鯉性腺不同發(fā)育時(shí)期GSI的變化

    從表2 可以看出,1~3 齡錦鯉雌魚(yú)、雄魚(yú)性腺發(fā)育不同時(shí)期GSI 變化規(guī)律基本相同,但卵巢GSI 均明顯高于精巢。GSI 在3 齡錦鯉卵巢發(fā)育至Ⅴ期時(shí)最高,達(dá)到28.64%;隨后卵巢進(jìn)入Ⅵ期,即剛產(chǎn)完卵的卵巢,GSI 顯著降低(P<0.05),但卵巢成熟前的Ⅰ—Ⅳ期的GSI 值顯著增加(P<0.05)。1~3 齡錦鯉精巢GSI 明顯低于卵巢,雖然在精巢Ⅴ期時(shí)出現(xiàn)峰值,但僅為9.57%;隨著繁殖結(jié)束,精巢進(jìn)入退化吸收階段,此時(shí)精巢處于Ⅵ期,為退化期,GSI 顯著降低(P<0.05),直至翌年精巢發(fā)育期Ⅰ—Ⅳ期有所升高,但與Ⅵ期相比,無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

    表2 1齡、2齡和3齡錦鯉GSI的變化Tab.2 Profiles of GSI in one-year-old,two-year-old,and three-year-old Cyprinus carpio %

    2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物特異性驗(yàn)證及擴(kuò)增效率鑒定

    通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)顯示,β-actin基因和CYP17a1基因分別在88.35 ℃和85.47 ℃時(shí)具有特異性單一峰,且整條曲線(xiàn)無(wú)雜峰,說(shuō)明β-actin基因和CYP17a1基因特異產(chǎn)物單一,未產(chǎn)生引物二聚體,可滿(mǎn)足后續(xù)試驗(yàn)要求。從圖1可以看出,標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)結(jié)果顯示,β-actin基因和CYP17a1基因引物擴(kuò)增效率分別為94.873%和102.798%,Ct值標(biāo)準(zhǔn)偏差區(qū)間為0.02~0.15,線(xiàn)性程度在98%以上,表明試驗(yàn)所用引物可用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng),也可用2-△△Ct方法進(jìn)行基因表達(dá)量分析。

    圖1 錦鯉β-actin 基因(A)和CYP17a1基因(B)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Standard curves for the β-actin gene(A)and CYP17a1 gene(B)of Cyprinus carpio

    2.3 CYP17a1基因在錦鯉不同組織的表達(dá)

    由表3 可知,CYP17a1基因在1~3 齡錦鯉卵巢、精巢、腦、肌肉、腎臟等5種組織中都有表達(dá),表現(xiàn)為精巢>卵巢>肌肉>腎臟>腦。各組織中CYP17a1基因的表達(dá)量差異顯著,在精巢中表達(dá)量最高,在腦組織表達(dá)量最低。CYP17a1基因在3齡錦鯉的精巢和卵巢中的表達(dá)量分別是腦組織的40.30 倍和42.87 倍,且其在精巢中的表達(dá)量是卵巢的1.80 倍。CYP17a1基因在錦鯉卵巢、精巢的表達(dá)量隨著年齡的增加有升高趨勢(shì),但是在腦、肌肉和腎臟中無(wú)明顯差別。

    表3 CYP17a1基因在1齡、2齡和3齡錦鯉5種組織的相對(duì)表達(dá)量Tab.3 Relative expression of CYP17a1 gene in five tissues of one-year-old,two-year-old,and three-year-old Cyprinus carpio

    2.4 CYP17a1基因在錦鯉不同性腺發(fā)育時(shí)期的表達(dá)

    如圖2所示,CYP17a1在1齡、2齡和3齡錦鯉卵巢組織Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期、Ⅵ期6個(gè)不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)量均呈先降低后升高趨勢(shì),性成熟前期(Ⅰ期、Ⅱ期)顯著高于性成熟后期(Ⅵ期),性成熟后期(Ⅵ期)顯著高于性成熟期(Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期),CYP17a1基因在精巢的表達(dá)量與卵巢呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)。

    圖2 CYP17a1基因在1齡(A)、2齡(B)和3齡(C)錦鯉6個(gè)性腺發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative expression level of CYP17a1 gene in six different developmental periods of gonads in Cyprinus carpio of the one-year-old(A),two-year-old(B),and three-year-old(C)instar

    CYP17a1基因在不同年齡錦鯉卵巢組織的表達(dá)結(jié)果顯示,3齡錦鯉卵巢Ⅰ期表達(dá)量最高,是同齡錦鯉卵巢Ⅲ期和Ⅳ期表達(dá)量的2.31 倍和2.57 倍。CYP17a1基因在不同年齡錦鯉精巢組織的表達(dá)結(jié)果顯示,3齡錦鯉精巢Ⅰ期表達(dá)量最高,是同齡錦鯉精巢Ⅲ期和Ⅳ期表達(dá)量的2.75倍和3.13倍。

    整體上,隨著年齡增長(zhǎng),錦鯉CYP17a1基因各發(fā)育時(shí)期表達(dá)量均呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。3 齡時(shí),各發(fā)育時(shí)期CYP17a1基因表達(dá)量較高;在3 齡錦鯉精巢Ⅰ期表達(dá)量最高,為同期卵巢的1.82倍。

    2.5 CYP17a1蛋白在錦鯉不同性腺發(fā)育時(shí)期的表達(dá)

    如圖3 所示,CYP17a1 蛋白在1~3 齡錦鯉精巢發(fā)育不同時(shí)期呈現(xiàn)出明顯波動(dòng),其表達(dá)趨勢(shì)與基因mRNA 表達(dá)模式一致,即精巢性成熟Ⅰ期、Ⅱ期表達(dá)量最高,到達(dá)精巢成熟期Ⅲ~Ⅴ期顯著降低,隨著精巢進(jìn)入性成熟Ⅵ期,CYP17a1 蛋白的表達(dá)量逐漸升高。

    圖3 CYP17a1 蛋白在1齡(A)、2齡(B)和3齡(C)錦鯉6個(gè)性腺發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)豐度Fig.3 The relative expression of CYP17a1 protein in six different developmental periods of gonads in Cyprinus carpio of the one-year-old(A),two-year-old(B),and three-year-old(C)instar

    CYP17a1 蛋白在1 齡、2 齡和3 齡錦鯉卵巢發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)量均較同齡同期精巢低,其中1 齡卵巢Ⅲ期表達(dá)水平最低。

    3 結(jié)論與討論

    細(xì)胞色素CYP 是一類(lèi)輔基為亞鐵血硫素蛋白酶基因家族,CYP17a 屬于CYP 的超級(jí)家族。CYP17a 在魚(yú)類(lèi)性腺發(fā)育中起到重要作用[2?4]。前人研究認(rèn)為,硬骨魚(yú)類(lèi)有2 個(gè)細(xì)胞色素CYP17a 基因,即CYP17a1和CYP17a2,且魚(yú)類(lèi)CYP17a1基因活性與哺乳動(dòng)物相一致[5?8]。CYP17a 是性腺合成與代謝中的關(guān)鍵酶,其遺傳的多態(tài)性能改變裂解酶和催化酶的活性。CYP活性部位含有400~500個(gè)血紅素基團(tuán)和氨基酸殘基,血紅素的第5 個(gè)配位鍵可將帶正電的鐵離子和帶負(fù)電的硫原子連接,從而完成CYP復(fù)雜的修飾調(diào)節(jié)功能[7?8]。

    隨著人類(lèi)和哺乳動(dòng)物CYP17a 基因的廣泛研究[9?13],關(guān)于其在魚(yú)類(lèi)中的表達(dá)試驗(yàn)也在同步開(kāi)展。陳孝紅等[21]采用RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)到CYP17a1基因在斑馬魚(yú)性成熟個(gè)體的卵巢、精巢、肌肉和腦等組織中均有表達(dá),且精巢的表達(dá)量遠(yuǎn)高于卵巢。翟毅等[14]利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和RT-PCR 技術(shù)在金錢(qián)魚(yú)的精巢、卵巢、肝、腦和頭腎中,均檢測(cè)到CYP17a1基因的表達(dá),而在心臟、肌肉、脾臟、腸和鰓中均未檢測(cè)到。本研究結(jié)果表明,CYP17a1基因在錦鯉卵巢、精巢、腦、肌肉和腎臟都有表達(dá),且在精巢和卵巢中具有較高的表達(dá)水平。此外,與黃鱔[17]、綠鰭?cǎi)R面鲀[15]和斑馬魚(yú)[25]腦組織中的表達(dá)相似,在錦鯉的腦組織中同樣檢測(cè)到CYP17a1基因的表達(dá)。推測(cè)CYP17a1基因可能參與魚(yú)類(lèi)腦組織中類(lèi)固醇激素的合成與分泌。

    對(duì)黃鱔[17]、斑馬魚(yú)[16]、虹鱒[18]、金錢(qián)魚(yú)[14]和青鳉[6]等硬骨魚(yú)類(lèi)研究發(fā)現(xiàn),CYP17a 在性腺發(fā)育中扮演著重要的角色。楊蘭英等[26]研究發(fā)現(xiàn),利用CRISPRI Cas9 技術(shù)敲除尼羅羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus)細(xì)胞色素CYP17a 基因后,與對(duì)照組相比,敲除組雌魚(yú)無(wú)法正常產(chǎn)卵,且血清孕激素17a,20β雙羥孕酮和皮質(zhì)醇合成水平均顯著降低,敲除組雄魚(yú)精子發(fā)生延遲,且向前運(yùn)動(dòng)的精子比例降低,不運(yùn)動(dòng)的精子比例明顯升高。斑馬魚(yú)CYP17a1基因缺失后會(huì)出現(xiàn)性逆轉(zhuǎn),雄魚(yú)精子量增加、雄性交配障礙和第2 性征缺失等現(xiàn)象[16]。將青鳉CYP17a1基因敲除后,雌、雄魚(yú)第二性征均出現(xiàn)丟失現(xiàn)象,雌魚(yú)卵巢呈現(xiàn)精巢形態(tài),有大量精子存在,但無(wú)法正常配對(duì)[27]。

    本研究中,CYP17a1基因在錦鯉6 個(gè)性腺發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量變化較大,呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì),且在性成熟前期(Ⅰ期、Ⅱ期)的表達(dá)量顯著高于其他各期。SU 等[28]研究發(fā)現(xiàn),在日本鰻魚(yú)(Anguilla japonica)的卵黃囊形成過(guò)程中,CYP17a1基因的高表達(dá)抑制了17α-羥基孕酮向MIH 17α,20β-二羥基-4-孕烯-3-酮的轉(zhuǎn)化,這也進(jìn)一步解析了人工養(yǎng)殖的日本鰻魚(yú)雌性性成熟率不高的原因。本研究中,CYP17a1基因在錦鯉精巢的表達(dá)量高于卵巢,進(jìn)一步說(shuō)明,在錦鯉和其他硬骨魚(yú)類(lèi)中,CYP17a1對(duì)精巢發(fā)育的調(diào)控作用要大于卵巢。此外,錦鯉性腺中CYP17a1基因的表達(dá)規(guī)律與金錢(qián)魚(yú)[14]CYP17a1基因和半滑舌鰨[29]P450c17-Ⅱ的表達(dá)規(guī)律相同,而與虹鱒[19]和綠鰭?cǎi)R面鲀[15]的研究結(jié)果不同,虹鱒的卵巢發(fā)育前期未檢測(cè)到CYP17a1基因,而綠鰭?cǎi)R面鲀的卵巢CYP17a1基因的表達(dá)量峰值出現(xiàn)在成熟期,推測(cè)原因可能與魚(yú)類(lèi)種質(zhì)差異及其在不同物種的調(diào)控作用不同有關(guān)??梢?jiàn),CYP17a1對(duì)魚(yú)類(lèi)性腺的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

    綜上,CYP17a1在mRNA 水平的表達(dá)結(jié)果顯示,其在精巢的表達(dá)量遠(yuǎn)高于卵巢。Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示,CYP17a1 蛋白的表達(dá)水平與mRNA 一致,暗示CYP17a1基因在錦鯉精巢發(fā)育及精子細(xì)胞分化成熟中發(fā)揮一定的調(diào)控作用。

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