連作煙田健株與根腐病感病煙株根際土壤微生物多樣性研究

敖金成，周桂夙，李永梅

（1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，云南 昆明 650201）

煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，為茄科忌連作作物。隨著人口不斷增長(zhǎng)和其他非煙經(jīng)濟(jì)作物種植面積的進(jìn)一步擠壓，優(yōu)質(zhì)耕地資源的供需矛盾日益凸顯，致使云南烤煙連作現(xiàn)象日趨嚴(yán)重。連作引起土壤化感物質(zhì)積累[1]、病原菌增加[2]、微生物結(jié)構(gòu)多樣性[3]和功能多樣性[4]降低，造成作物土傳病害發(fā)生[5]。土傳病害因?qū)煵莘N植效益及煙葉品質(zhì)構(gòu)成嚴(yán)重威脅而受到廣泛關(guān)注。深入認(rèn)識(shí)連作土壤微生物群落演化規(guī)律是探尋有效防控作物土傳病害途徑的關(guān)鍵。

在諸多的土傳病害中，煙草鐮刀菌根腐病是由半知菌亞門（Deuteromycotina）鐮刀菌屬（Fusarium）病原菌引起的一種典型土傳病害，該病危害面廣，防治難度大，近年來(lái)全國(guó)核心煙區(qū)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。有報(bào)道表明，引起煙草鐮刀菌根腐病的病原菌主要為茄腐鐮刀菌（F. solani）[6]和尖孢鐮刀菌（F.oxysporium）[7]，可單一發(fā)生危害，也可復(fù)合發(fā)生危害。隨著研究的深入，越來(lái)越多的煙草鐮刀菌根腐病病原菌被發(fā)現(xiàn)。2018年吳忠安等[8]首次報(bào)道了共享鐮刀菌（F. commune）引起煙草根腐病；2021 年QIU 等[9?10]首次報(bào)道了由Fusarium brachygibbosum和Fusarium sinensis引起的河南煙區(qū)根腐病。連作和煙株感病均會(huì)引起土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的改變。許自成等[11]研究表明，長(zhǎng)期連作導(dǎo)致土壤真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化和致病菌增多，但鐮刀菌屬真菌并未呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)。在連作土壤中，鐮刀菌屬隨著連作年限的增加逐漸成為優(yōu)勢(shì)真菌生理群[12?13]。研究感染黑脛病煙株[14]和感染青枯病煙株[15]根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，感病煙株微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，多樣性降低。而在連作條件下，根腐病感病煙株土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性，尤其是一些病原微生物群落豐度的變化鮮見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，基于不同連作年限煙田，探討了健康和煙草根腐病感病煙株根際土壤細(xì)菌、真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性特征，以期為連作土壤微生態(tài)環(huán)境的定向調(diào)控及土傳病害的生態(tài)防控提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 連作土壤采集區(qū)概況及取樣

1.1.1 區(qū)域概況 供試區(qū)域位于云南省曲靖市馬龍區(qū)舊縣鎮(zhèn)（103°23′10″E，25°20′20″N）核心煙區(qū)，烤煙連作現(xiàn)象較為普遍。該煙區(qū)地處云貴高原的滇東北丘陵區(qū)，氣候?qū)儆诘途暩咴撅L(fēng)型氣候，年均溫13.3～15.1 ℃，烤煙大田生育期降水量740.0～810.0 mm，海拔1 957.1 m。土壤類型為黃壤，供試烤煙品種為云煙87。

1.1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品采集 于2020 年7 月烤煙成熟期，在云南省曲靖市核心煙區(qū)選擇不同連作年限煙田進(jìn)行樣品采集。分別在連作2、4、8 a 的地塊隨機(jī)選取4 株健康煙株和4 株根腐病發(fā)病較重的煙株，連作年限編號(hào)分別為T2、T4、T8。取樣時(shí)去除地表雜物，然后將煙株整株挖起，去除主體根圍土，采用抖根法[16?17]收集須根2 mm 范圍內(nèi)的土壤。3 種連作年限（2、4、8 a）煙田中，病株根際土壤組（S）樣本編號(hào)分別為ST2、ST4、ST8，健株根際土壤組（H）樣本編號(hào)分別為HT2、HT4、HT8。同時(shí)，在相同區(qū)域取撂荒2 a 以上地塊（未種植任何作物）0～20 cm 土層土壤，樣品編號(hào)為CK。用于化學(xué)性質(zhì)檢測(cè)的土壤樣品用自封袋裝好，帶回實(shí)驗(yàn)室，自然陰干，研磨過(guò)篩后備用；用于細(xì)菌、真菌高通量測(cè)序的土壤樣品用取樣管裝好置于低溫保藏箱，快速帶回實(shí)驗(yàn)室于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 檢測(cè)項(xiàng)目及方法

1.2.1 土壤化學(xué)性質(zhì)的測(cè)定 土壤樣本的有機(jī)質(zhì)、堿解氮、速效磷、速效鉀含量和pH 值測(cè)定參照文獻(xiàn)[18]的方法進(jìn)行。

1.2.2 土壤細(xì)菌、真菌高通量測(cè)序

1.2.2.1 DNA 提取 采用HiPure Soil DNA Mini Kit試劑盒（Magen，廣州，中國(guó)，cat#3412）進(jìn)行土壤微生物DNA 提取。首先在2 mL beads Tube 中加入0.25～0.50 g 土壤樣品和0.6 mL Buffer SOL，利用渦旋儀（米歐mix-28+，廣州圍谷潤(rùn)儀器有限公司）充分勻漿裂解，然后70 ℃水浴10 min，并離心收集管壁上液 滴，加 入200 μL Buffer PS 和150 μL Absorber Solution，渦旋混勻20 s，靜置5 min 后離心5 min，取上清液至2 mL 離心管，加入等體積Buffer GDP，混勻，獲得DNA 后，用1%瓊脂糖（Biowest Agarose，西班牙）凝膠電泳（DYY-6C，北京六一儀器廠）檢測(cè)基因組DNA 的完整性和是否發(fā)生蛋白質(zhì)等污染，DNA樣品于-80 ℃保存待用。

1.2.2.2 目的基因擴(kuò)增及I llumina 測(cè)序 采用帶有Barcode 標(biāo) 記 的 特 異 引 物 341F （5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）、806R（5′-GGACTA?CHVGGGTATCAAT-3′）對(duì)細(xì)菌16S rDNA V3—V4區(qū)進(jìn)行MiSeq 擴(kuò)增子測(cè)序;采用帶有Barcode 標(biāo)記的特異引物ITS3-F（5′-GATGAAGAACGYAGYRAA-3′）、ITS4-R（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對(duì)真菌ITS 的ITS2 測(cè)序區(qū)域進(jìn)行MiSeq 擴(kuò)增子測(cè)序。PCR 采 用TransStart Fastpfu DNA Polymerase 聚 合酶，每個(gè)樣本3 次PCR 重復(fù)，擴(kuò)增后將PCR 產(chǎn)物利用AMPure XP 磁珠進(jìn)行純化，混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純化效果。第2 輪擴(kuò)增后使用AMPure XP 磁珠對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化，之后用ABI StepOnePlus RealTime PCR System（Life technologies，美國(guó)）進(jìn)行定量，最后根據(jù)Novaseq 6000的PE250模式Pooling上機(jī)測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用IBM Statistics SPSS 20.0 進(jìn)行方差分析。利用軟件平臺(tái)Usearch（version 7.0）對(duì)相似度在97%條件下的操作分類單元（Operational taxonomic unit，OTU）進(jìn)行質(zhì)控拼接和Tag 聚類去嵌合體，獲得OTU 的豐度和OTU 代表序列。利用軟件Mothur（v.1.30.1）計(jì)算反映群落豐富度（Community richness）的Sobs 指數(shù)、Chao1 指數(shù)以及反映群落多樣性的Shannon-Wiener指數(shù)（香農(nóng)-維納指數(shù)），分析其α 多樣性。利用主坐標(biāo)分析（Principal co?ordinate analysis，PCoA）法進(jìn)行β 多樣性分析，并結(jié)合Anosim 檢驗(yàn)分析不同樣本細(xì)菌、真菌群落差異。采用冗余分析（Redundancy analysis，RDA）進(jìn)行環(huán)境因子與微生物群落分布的關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 連作煙田健株和根腐病感病煙株根際土壤細(xì)菌、真菌群落組成分析

細(xì)菌屬水平上，排前10位的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬相對(duì)豐度累積總和達(dá)到19.9%～29.8%。相較于CK，HT2、HT4、HT8 樣本排前10 位的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬相對(duì)豐度增幅分別為9.2%、29.5%、24.2%，ST2、ST4、ST8 樣本相對(duì)豐度增幅分別為26.4%、27.2%、29.8%（圖1a）。從圖1a 豐度熱圖可以看出，相較于CK，HT2、HT4、HT8 樣本優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬中鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）相對(duì)豐度增幅分別為-19.6%、16.2%、47.6%，芽單胞菌屬（Gemmatimonas）相對(duì)豐度增幅分別為82.9%、188.1%、225.9%，弗拉托氏菌屬（Frateuria）相對(duì)豐度增幅分別為865.4%、934.6%、330.8%，出芽菌屬（Gemmata）相對(duì)豐度增幅分別為92.6%、113.0%、250.0%；ST2、ST4、ST8 樣本優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬中鞘氨醇單胞菌屬相對(duì)豐度增幅分別為-23.1%、50.3%、63.4%，芽單胞菌屬相對(duì)豐度增幅分別為52.8%、160.1%、200.0%，弗拉托氏菌屬相對(duì)豐度增幅分別為1 123.1%、350.0%、150.0%，出芽菌屬相對(duì)豐度增幅分別為7.4%、203.7%、418.5%。另外，ST4 和HT8 樣本的戴氏菌屬（Dyella），ST4、HT8、ST8 樣 本 的 小 梨 形 菌 屬（Pirellula）和Candidatus_Udaeobbacter菌屬相對(duì)豐度較高。

真菌屬水平上，排前17位的優(yōu)勢(shì)菌屬相對(duì)豐度累積總和達(dá)到19.0%～67.8%（圖1b）。相較于CK，HT2、HT4、HT8 樣本優(yōu)勢(shì)真菌屬相對(duì)豐度累積總和降幅分別為53.4%、53.7%、65.7%；ST2、ST4、ST8 樣本優(yōu)勢(shì)真菌屬相對(duì)豐度累積總和降幅分別為19.0%、51.9%、67.8%。相較于CK，HT2、HT4、HT8樣本的青霉菌屬（Penicillium）相對(duì)豐度降幅分別為72.2%、 86.0%、 95.0%， 淡 紫 紫 孢 菌 屬（Purpureocillium）相對(duì)豐度降幅分別為90.9%、83.9%、39.5%，毛殼菌屬（Chaetomium）相對(duì)豐度降幅分別為47.5%、26.1%、76.3%；HT4 和HT8 樣本鐮刀菌屬（Fusarium）相對(duì)豐度增幅分別為430.3%、576.8%，HT2 樣本降幅為59.5%。相較于CK，ST2、ST4、ST8 樣本的青霉菌屬相對(duì)豐度降幅分別為66.4%、92.8%、97.4%，而鐮刀菌屬相對(duì)豐度增幅分別為255.8%、123.4%、389.3%；ST2 樣本木霉菌屬相對(duì)豐度增幅為530.3%，而ST4、ST8 樣本木霉菌屬相對(duì)豐度降幅分別為30.3%、51.5%；ST2和ST8樣本淡紫紫孢菌屬降幅分別為96.5%和79.7%，ST4樣本增幅為23.1%；毛殼菌屬等其他幾種優(yōu)勢(shì)菌屬相對(duì)豐度變化規(guī)律不明顯。相較于其他處理，連作8 a 煙田健株和病株根際土壤以鏈格孢屬（Alternaria）、頭束霉屬（Cephalotrichum）相對(duì)豐度較高，且ST8 樣本尾柄孢殼屬（Cercophora，相對(duì)豐度2.77%）和Setophoma屬（2.30%）相對(duì)豐度也較高。

圖1 連作煙田健株和根腐病感病煙株根際土壤細(xì)菌（a）、真菌（b）屬水平上物種豐度熱圖Fig.1 Heat map of bacterial（a）and fungal（b）relative abundance in rhizosphere soil of healthy and root rot-infected tobacco plants in continuous cropping field at genus level

2.2 連作煙田健株和根腐病感病煙株根際土壤細(xì)菌、真菌群落的α多樣性分析

Sobs 指數(shù)表示實(shí)際檢測(cè)到的OTU 個(gè)數(shù)，反映樣本物種豐富程度，Shannon-Wiener 指數(shù)綜合反映物種的多樣性和均勻度，Shannon-Wiener 指數(shù)越大，樣本物種分布越均勻，多樣性越高。從不同連作年限煙田健株和病株根際土壤細(xì)菌、真菌群落的α 多樣性（表1）可以看出，隨連作年限的延長(zhǎng)，細(xì)菌群落Sobs 指數(shù)和Chao1 指數(shù)整體呈增大趨勢(shì)，除連作4 a煙田病株根際土壤細(xì)菌群落Sobs指數(shù)和Chao1指數(shù)大于健株外，連作2 a 和8 a 煙田均表現(xiàn)為病株根際土壤細(xì)菌群落Sobs 指數(shù)略低于健株，表明連作年限增加，土壤細(xì)菌群落豐富度增加，感病煙株根際土壤細(xì)菌群落豐富度在一定程度上降低。細(xì)菌Shannon-Wiener 指數(shù)隨連作年限的延長(zhǎng)呈增大趨勢(shì)，以連作8 a 煙田的健株和病株樣本較高，其中連作4 a 和8 a 煙田均表現(xiàn)為病株樣本略高于健株樣本，連作2 a 煙田則表現(xiàn)為病株樣本小于健株樣本，表明長(zhǎng)期連作（4～8 a）提高煙株根際土壤細(xì)菌群落多樣性，感病對(duì)煙株根際土壤細(xì)菌群落多樣性的增加有一定的促進(jìn)作用。相較于CK，隨連作年限的延長(zhǎng)，煙田健株和病株根際土壤真菌群落Sobs 指數(shù)、Chao1 指數(shù)和Shannon-Wiener 指數(shù)整體呈先降后升的趨勢(shì)，除連作2 a 煙田外，連作4 a 和8 a 煙田病株樣本真菌群落Sobs 指數(shù)均大于健株；連作2 a 和4 a煙田健株樣本Shannon-Wiener 指數(shù)低于病株，連作8 a煙田病株樣本Shannon-Wiener指數(shù)略低于健株；Chao1指數(shù)均表現(xiàn)為病株樣本大于健株樣本。

表1 連作煙田健株與根腐病感病煙株根際土壤細(xì)菌和真菌群落α多樣性Tab.1 α-diversity of bacterial and fungal communities in rhizosphere soil of healthy and root rot-infected tobacco plants in continuous cropping field

2.3 連作煙田健株和根腐病感病煙株根際土壤細(xì)菌、真菌群落的β多樣性分析

PCoA 基于距離矩陣進(jìn)行降維分析，以百分比評(píng)估各坐標(biāo)軸對(duì)菌群結(jié)構(gòu)總體差異的解釋度，一般PCoA1和PCoA2總和達(dá)到50%以上較好。從圖2可以看出，細(xì)菌的PCoA1 與PCoA2 總和為56.32%，真菌的PCoA1 與PCoA2 總和為50.31%，均大于50%，說(shuō)明坐標(biāo)軸對(duì)細(xì)菌、真菌群落結(jié)構(gòu)總體差異解釋度較好。不同連作年限煙田的健株及病株根際土壤樣本生物細(xì)菌、真菌群落組成差異較大，相同連作年限煙田的健株和病株根際土壤樣本的細(xì)菌、真菌群落組成差異較小。連作年限越長(zhǎng)，距離CK 土壤樣本越遠(yuǎn)。Anosim檢驗(yàn)結(jié)果表明，除HT2和ST2樣本的真菌群落組成有顯著差異（P<0.05）外，其余相同連作年限煙田的健株和病株根際土壤細(xì)菌、真菌群落組成無(wú)顯著差異（P>0.05），說(shuō)明群落結(jié)構(gòu)相似性較高，但與CK 樣本差異均達(dá)到顯著水平（P<0.05）。隨連作年限的延長(zhǎng)，CK、HT2、HT4 及HT8樣本間，以及CK、ST2、ST4 及ST8 樣本間細(xì)菌、真菌群落組成差異均達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。

圖2 連作煙田健株和根腐病感病煙株根際土壤細(xì)菌（a）、真菌（b）OTU的β多樣性Fig.2 β-diversity analysis of bacterial（a）and fungal（b）OTUs in rhizosphere soil of healthy and root rot-infected tobacco plants in continuous cropping field

2.4 連作煙田健株和根腐病感病煙株根際土壤化學(xué)性質(zhì)與微生物群落關(guān)聯(lián)分析

2.4.1 連作煙田健株和病株根際土壤的化學(xué)性質(zhì)

從表2 可以看出，撂荒土壤（CK）養(yǎng)分含量均顯著（P<0.05）低于其他處理，尤其是速效磷、速效鉀和有機(jī)質(zhì)含量較低，其中HT2、HT4、HT8 處理根際土壤有機(jī)質(zhì)、堿解氮、速效磷、速效鉀含量分別較CK增加102.8%～336.4%、71.0%～108.3%、96.8%～703.2%、124.5%～233.3%，ST2、ST4、ST8 處理根際土壤有機(jī)質(zhì)、堿解氮、速效磷、速效鉀含量分別較CK 增加101.9%～233.6%、66.7%～158.3%、306.3%～793.7%、125.1%～234.4%，說(shuō)明健株和病株根際土壤主要養(yǎng)分變化特征相似，但病株根際土壤養(yǎng)分水平整體優(yōu)于健株根際土壤，這可能與煙株感病后養(yǎng)分吸收水平降低有關(guān)。

表2 連作煙田健株和根腐病感病煙株根際土壤的化學(xué)性質(zhì)Tab.2 Chemical properties of rhizosphere soil of healthy and root rot-infected tobacco plants in different continuous cropping fields

2.4.2 土壤化學(xué)性質(zhì)與細(xì)菌、真菌性狀關(guān)聯(lián)特征

RDA 主要通過(guò)降維思想，使用二維平面反映菌群、樣本、環(huán)境因子三者之間的關(guān)系。從圖3可以看出，屬水平上，不同連作年限煙田健株和病株根際土壤細(xì)菌（圖3a）、真菌（圖3b）RDA分析的第Ⅰ和第Ⅱ排序軸5 個(gè)環(huán)境因子累積解釋變異量分別達(dá)到82.01%、89.84%，說(shuō)明前2 個(gè)排序軸能夠很好地反映土壤細(xì)菌、真菌群落結(jié)構(gòu)與土壤化學(xué)性質(zhì)之間的關(guān)系，且主要由第Ⅰ軸決定。

圖3 細(xì)菌（a）、真菌（b）群落與土壤化學(xué)性質(zhì)的冗余分析Fig.3 Redundancy analysis between bacterial（a），fungal（b）communities and soil chemical properties

在細(xì)菌屬水平上（圖4a），皮爾森（Pearson）相關(guān)系數(shù)表明，土壤pH 值與鞘氨醇單胞菌屬、Candidatus_Udaeobacter、出芽菌屬相對(duì)豐度呈極顯著（P<0.01）或顯著（P<0.05）正相關(guān)，與鏈霉菌屬、Bryobacter、Granulicella、JG30a-KF-32、酸 桿 菌 屬（Acidibacter）和Singulisphaera相對(duì)豐度呈顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）負(fù)相關(guān)；土壤有機(jī)質(zhì)含量?jī)H與Occallatibacter相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）；土壤堿解氮含量與出芽菌屬、Candidatus_Udaeobacter和小梨形菌屬相對(duì)豐度呈極顯著（P<0.01）或 顯 著（P<0.05）正 相 關(guān)，與Granulicella、JG30a-KF-32、Occallatibacter、酸桿菌屬相對(duì)豐度呈極顯著（P<0.01）或顯著（P<0.05）負(fù)相關(guān)；土壤速效磷含量與小梨形菌屬、Singulisphaera、Candidatus_Udaeobacter和出芽菌屬相對(duì)豐度呈極顯著（P<0.01）或顯著（P<0.05）正相關(guān)；土壤速效鉀含量與芽單胞菌屬、出芽菌屬、Candidatus_Udaeobacter和小梨形菌屬相對(duì)豐度呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），與Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、Granulicella、細(xì) 鏈 孢 菌 屬（Catenulispora）、JG30a-KF-32、Occallatibacter、酸桿菌屬相對(duì)豐度呈極顯著（P<0.01）或顯著（P<0.05）負(fù)相關(guān)。在真菌屬水平上（圖4b），皮爾森（Pearson）相關(guān)系數(shù)表明，土壤pH 值與青霉菌屬、Oidiodendron相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）；土壤有機(jī)質(zhì)含量與Setophoma相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），與Oidiodendron呈顯著正相關(guān)（P<0.05）；土壤堿解氮含量與青霉菌屬相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），與鏈格孢屬（Alternaria）呈顯著正相關(guān)（P<0.05）；土壤速效磷含量與青霉菌屬、毛殼菌屬相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）；土壤速效鉀含量與青霉菌屬相對(duì)豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01）。

圖4 土壤化學(xué)性質(zhì)與細(xì)菌（a）、真菌（b）群落的皮爾森分析Fig.4 Pearson analysis between soil chemical properties and bacterial（a），fungal（b）communities

幾種主要化學(xué)指標(biāo)中以土壤速效鉀含量和pH值對(duì)細(xì)菌群落分布影響較大，貢獻(xiàn)值分別為8.80%和8.62%（圖5a），以速效磷含量對(duì)真菌群落分布影響最大，貢獻(xiàn)值為11.64%（圖5b）。說(shuō)明pH 值和速效鉀含量是影響細(xì)菌群落分布的核心化學(xué)因子，速效磷含量是影響真菌群落分布的核心化學(xué)因子。

圖5 土壤化學(xué)性質(zhì)對(duì)細(xì)菌（a）、真菌（b）分布的貢獻(xiàn)度分析Fig.5 Contribution of soil chemical properties to the distribution of bacteria（a）and fungi（b）

3 結(jié)論與討論

3.1 連作與根腐病感染對(duì)煙株土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，烤煙連作與感病條件下，煙田土壤微生物種群結(jié)構(gòu)發(fā)生趨向性變化，優(yōu)勢(shì)種群累積特征明顯。細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群相對(duì)豐度累積總和隨連作年限的延長(zhǎng)總體呈增加趨勢(shì)，與CK 相比，健株、病株排前10 位的優(yōu)勢(shì)菌屬相對(duì)豐度累積總和增幅分別為9.2%～29.5%、26.4%～29.8%，其中以芽單胞菌屬、弗拉托氏菌屬、出芽菌屬相對(duì)豐度增幅較大，連作4 a 煙田病株和連作8 a 煙田健株及病株根際土壤樣本中常見(jiàn)致病病原菌小梨形菌屬和Candidatus_Udaeobbacter相對(duì)豐度也較高。

真菌優(yōu)勢(shì)菌屬相對(duì)豐度累積總和隨連作年限的增加呈降低趨勢(shì)，與CK 相比，健株、病株根際土壤優(yōu)勢(shì)菌屬相對(duì)豐度累積總和降幅分別為53.4%～65.7%、19.0%～67.8%，其中健株根際土壤樣本以青霉菌屬、淡紫紫孢菌屬和毛殼菌屬降幅較大，連作4 a和連作8 a樣本鐮刀菌屬相對(duì)豐度增幅較大。病株根際土壤以青霉菌屬相對(duì)豐度降幅較大，以鐮刀菌屬相對(duì)豐度增幅較大，說(shuō)明青霉菌屬和鐮刀菌屬是造成連作煙田健株和根腐病感病煙株根際土壤群落差異的關(guān)鍵物種。與丁亞茹等[19]研究指出一些關(guān)鍵物種是造成健康和易感煙田根際土壤微生物群落差異的主要原因結(jié)論一致。DAGUENRE 等[20]研究也認(rèn)為，幾乎每一種土傳病原微生物都有與之相克的拮抗微生物。已有研究報(bào)道顯示，青霉屬真菌中已報(bào)道了1 300 多種不同的代謝產(chǎn)物，它們普遍具有抗菌、抗蟲等活性[21]。前人已分離出大量對(duì)病原菌具有較好抑制效應(yīng)的青霉屬真菌[22]。淡紫紫孢菌是一種重要的生防菌，在根結(jié)線蟲防治方面有廣泛應(yīng)用[23?25]；毛殼菌對(duì)許多植物病原菌有潛在的生 防 作 用[26?27]，其 中 內(nèi) 生 球 毛 殼 菌（Chaetomium globosum）對(duì)油菜菌核病病原菌和立枯絲核菌具有不同程度的抑制作用[28]。鐮刀菌屬為重要的土傳病原菌[29?30]，常引起作物根腐病[31?33]，本研究結(jié)果顯示，不同連作年限煙田健株和病株根際土壤鐮刀菌屬相對(duì)豐度整體增幅較大，推測(cè)其可能是引起試驗(yàn)煙株發(fā)生根腐病的主要病原。綜上所述，連作提高土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌種群豐富度，降低土壤真菌優(yōu)勢(shì)菌種群豐富度，表現(xiàn)為病原菌豐度增加，拮抗菌豐度降低，該試驗(yàn)連作煙田烤煙受根結(jié)線蟲病和鐮刀菌根腐病等土傳病害侵染危害風(fēng)險(xiǎn)較高。

3.2 連作與根腐病感染對(duì)土壤細(xì)菌、真菌群落多樣性的影響

土壤微生物的數(shù)量、種類和多樣性是維持土壤健康和質(zhì)量的重要因素[34]。土壤連作障礙的發(fā)生與土壤微生物的種類和數(shù)量變化有著密切關(guān)系[35]。本研究中，隨連作年限延長(zhǎng)，健株和病株根際土壤真菌群落的Sobs 指數(shù)、Chao1 指數(shù)和Shannon-Wiener指數(shù)均呈先降后升的變化趨勢(shì)，但總體上均小于CK樣本。

健株根際土壤細(xì)菌群落豐富度隨連作年限增加呈增加趨勢(shì)，病株除ST4 樣本的細(xì)菌群落豐富度大于HT4 外，ST2 和ST8 樣本的細(xì)菌群落豐富度均小于相應(yīng)連作年限的健株，其原因可能與連作4 a煙田病株的異質(zhì)性有關(guān)；健株和病株樣本的細(xì)菌群落多樣性隨連作年限的延長(zhǎng)而提高，其中連作4 a和8 a 煙田的病株樣本均大于健株；健株和病株根際土壤細(xì)菌群落Sobs、Chao1 和Shannon-Wiener 指數(shù)均大于CK，說(shuō)明連作煙田土壤細(xì)菌群落豐富度和多樣性提高，但長(zhǎng)期連作條件下煙株感染根腐病后細(xì)菌群落的豐富度降低但群落多樣性提高，與文獻(xiàn)[34?37]認(rèn)為烤煙連作減少土壤細(xì)菌多樣性、增加真菌數(shù)量的結(jié)論不完全一致。這可能與連作地塊在肥料[38]、調(diào)理劑[39]施用等方面存在差異有關(guān)。本研究中，主坐標(biāo)分析和Anosim 檢驗(yàn)結(jié)果表明，不同連作年限煙田健株樣本間及病株樣本間根際土壤樣本細(xì)菌和真菌群落組成差異較大，且連作年限越長(zhǎng)，與撂荒土壤細(xì)菌、真菌群落組成差異越大。

3.3 連作煙田理化性質(zhì)對(duì)健康和感病煙株根際微生物分布的影響

連作條件下，健康和病株根際土壤細(xì)菌、真菌群落分布與土壤化學(xué)性質(zhì)的關(guān)系存在差異，其中土壤pH 值和速效鉀含量對(duì)細(xì)菌群落的分布影響較大，這與文獻(xiàn)[3]的結(jié)論一致，土壤速效磷含量對(duì)真菌群落的分布影響較大。本研究中，土壤pH 值與鞘氨醇單胞菌屬、Candidatus_Udaeobacter、出芽菌屬相對(duì)豐度呈極顯著（P<0.01）或顯著（P<0.05）正相關(guān)，與鏈霉菌屬、Bryobacter、Granulicella、JG30a-KF-32、酸桿菌屬（Acidibacter）、Singulisphaera、青霉菌屬和Oidiodendron的相對(duì)豐度呈顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）負(fù)相關(guān)，其中鏈霉菌、酸桿菌、青霉菌為常見(jiàn)的有益菌，說(shuō)明調(diào)控pH 值對(duì)維持土壤有益菌和病原菌平衡至關(guān)重要。另外，土壤速效鉀含量與酸桿菌屬和青霉菌屬相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)，而與小梨形菌屬相對(duì)豐度呈正相關(guān)，說(shuō)明增施鉀肥降低有益菌群豐度，增加特殊病原菌群豐度，這可能與近年來(lái)烤煙種植時(shí)大量施用鉀肥有關(guān)。礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不僅對(duì)植物正常生長(zhǎng)發(fā)育起重要作用，而且以多種方式直接或間接影響病原物的侵染、繁殖及植株的感病與抗病性[40]?？梢?jiàn)，通過(guò)調(diào)控土壤理化性質(zhì)尤其是pH 值，可以調(diào)控土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及分布，這與劉株秀等[41]的研究結(jié)果一致。