基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討血府逐瘀湯中川芎-赤芍藥對調(diào)節(jié)血管新生的分子機(jī)制

左春蘭 劉娜婷 蔡曉婷 林凡

[摘要] 目的 分析血府逐瘀湯關(guān)鍵藥對川芎-赤芍調(diào)節(jié)血管新生的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。方法 從TCMSP數(shù)據(jù)庫及Drug Bank數(shù)據(jù)庫挖掘川芎-赤芍的成分及其對應(yīng)靶蛋白，從GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取“血管新生”相關(guān)基因;利用Omicshare數(shù)據(jù)庫中的Venn功能獲取川芎-赤芍干預(yù)血管新生的靶點(diǎn)后，借助Cytoscape（3.8.2）軟件構(gòu)建“活性成分—川芎-赤芍調(diào)節(jié)血管新生靶蛋白”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，在String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建“川芎-赤芍調(diào)節(jié)血管新生靶蛋白--人類蛋白”互作網(wǎng)絡(luò)，并篩選核心靶點(diǎn);所得靶點(diǎn)的基因本體論（GO）及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析在Omicshare網(wǎng)站進(jìn)行。借助AutoDock vina軟件對核心靶點(diǎn)和關(guān)鍵活性成分進(jìn)行分子對接。結(jié)果 獲得川芎-赤芍活性成分20種，相關(guān)靶蛋白117種，川芎-赤芍調(diào)節(jié)血管新生靶蛋白72個，其中，關(guān)鍵活性成分為黃芩素、鞣花酸、β-谷甾醇、豆甾醇、楊梅酮、（+）-兒茶素、阿魏酸、川芎嗪等，關(guān)鍵靶蛋白為蛋白激酶Bα（AKT1）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、P53腫瘤蛋白（TP53）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、環(huán)加氧酶2（PTGS2）、熱休克蛋白90αA1（HSP90AA1）、c-fos原癌基因蛋白（FOS）等。GO結(jié)果提示，該藥對在細(xì)胞增殖、生長、生物粘附、細(xì)胞聚集等方面影響血管新生;通路富集結(jié)果顯示，AGE-RAGE通路、IL-17通路、流體剪應(yīng)力與動脈粥樣硬化信號通路等是藥物作用的主要通路。分子對接提示核心靶點(diǎn)與關(guān)鍵化合物具有良好的結(jié)合能力。結(jié)論 血府逐瘀湯中的川芎-赤芍藥對通過多靶點(diǎn)、多途徑對血管新生起調(diào)節(jié)作用，為血府逐瘀湯干預(yù)血管新生的進(jìn)一步研究及臨床應(yīng)用提供一定理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 血府逐瘀湯;川芎-赤芍;血管新生;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);分子對接

[中圖分類號] R285? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）06-0033-05

[Abstract] Objective To analyze the material basis and mechanism of key components of Xuefu Zhuyu Decoction on Rhizoma Chuanxiong-Radix Paeoniae Rubra regulating angiogenesis. Methods The constituents of Rhizoma Chuanxiong-Radix Paeoniae Rubra and their corresponding target proteins were mined from the TCMSP database and the Drug Bank database， and the angiogenesis-related genes were obtained from the GeneCards database. The target of Rhizoma Chuanxiong-Radix Paeoniae Rubra intervention on angiogenesis was obtained using the Venn function in the Omicshare database. The network relationship map of "active component-Rhizoma Chuanxiong-Radix Paeoniae Rubra regulating angiogenesis target protein" was constructed with the help of Cytoscape（3.8.2） software. The interaction network of "Chuanxiong-Radix Paeoniae regulating Rubra angiogenesis target protein-human protein" was constructed in the String database， and the core target was screened. The gene ontology（GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） pathway enrichment analysis of the obtained targets were carried out on the Omicshare website. With the help of AutoDock vina software， the core target and key active ingredients were molecularly docked. Results 20 active components of Rhizoma Chuanxiong-Radix Paeoniae Rubra， 117 related target proteins， and 72 angiogenesis-regulating target proteins of Rhizoma Chuanxiong-Radix Paeoniae Rubra were obtained. Among them， the key active ingredients are baicalein， tannic acid， β-sitosterol， stigmasterol， myricetin， （+） -catechin， ferulic acid， and ligustrazine. The key target proteins were protein kinase Bα （AKT1）， vascular endothelial growth factor A （VEGFA）， interleukin-6 （IL-6）， P53 tumor protein （TP53）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， cyclooxygenase 2 （PTGS2）， heat shock protein 90αA1 （HSP90AA1）， and c-fos proto-oncogene protein （FOS）. GO results suggested that the drug affects angiogenesis in cell proliferation， growth， bioadhesion， and cell aggregation. Pathway enrichment results showed that the AGE-RAGE pathway， IL-17 pathway， fluid shear stress， and atherosclerosis signaling pathways are the main pathway of drug action. Molecular docking suggested that the core target has an excellent binding ability with key compounds. Conclusion The Rhizoma Chuanxiong-Radix Paeoniae Rubra of Xuefu Zhuyu Decoction can regulate angiogenesis through multiple targets and pathways. It provides a certain theoretical basis for the further research and clinical application of Xuefu Zhuyu Decoction on the intervention of angiogenesis.

[Key words] Xuefu Zhuyu Decoction; Rhizoma Chuanxiong-Radix Paeoniae Rubra; Angiogenesis; Network pharmacology; Molecular docking

血管新生是在已有血管基礎(chǔ)上形成新血管的過程，其異常可導(dǎo)致缺血性疾?。ㄈ缧募∪毖?、缺血性腦卒中）和血管增生性疾?。ㄈ缒[瘤、動脈粥樣硬化、糖尿病視網(wǎng)膜病變），對人類健康威脅巨大。治療血管新生已成為相關(guān)疾病研究的熱點(diǎn)之一[1]。

作為活血化瘀方劑的代表，血府逐瘀湯可活血化瘀、調(diào)節(jié)血管新生，但具體機(jī)制尚不明晰[2]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)和運(yùn)籌學(xué)的網(wǎng)絡(luò)理論，以整體、系統(tǒng)的觀點(diǎn)分析藥物與機(jī)體之間的相互作用，對揭示疾病機(jī)制和藥物的研發(fā)具有重要意義。

在血府逐瘀湯中，川芎為血中氣藥，既能活血化瘀，又擅行氣化滯，芍藥涼血活血、散瘀止痛，二者相互配合而發(fā)揮重要作用[3]。因此，本研究選取川芎、赤芍，以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析其調(diào)控血管新生的機(jī)制，以期為血府逐瘀湯相關(guān)臨床應(yīng)用提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 獲取川芎-赤芍的活性成分和靶蛋白、血管新生相關(guān)基因

在TCMSP數(shù)據(jù)庫（http：//ibtshk-bu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）挖掘，并依據(jù)口服利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18篩選川芎、赤芍的潛在有效成分，并檢索文獻(xiàn)補(bǔ)充。將所得成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)在PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中進(jìn)行驗證。

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫和Drug Bank（https：//www.drugbank.ca/）數(shù)據(jù)庫查找有效成分對應(yīng)靶點(diǎn)，并在UniProt數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/up-loadlists/）中轉(zhuǎn)換成人類基因名。在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）收集血管新生相關(guān)基因。

1.2“川芎-赤芍活性成分—藥物調(diào)節(jié)血管新生靶蛋白”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Venn功能（https：//www.omicshare.com）對川芎-赤芍活性成分靶蛋白和血管新生相關(guān)基因取交集，獲取川芎-赤芍干預(yù)血管新生的可能靶蛋白。隨后將上述數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape（3.8.2）軟件，構(gòu)建“活性成分—川芎-赤芍干預(yù)血管新生靶蛋白”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。其中，Degree值代表成分與靶標(biāo)之間所對應(yīng)的關(guān)系，BC值表示節(jié)點(diǎn)和網(wǎng)絡(luò)中心點(diǎn)間的距離，兩個參數(shù)越大說明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中作用越重要。

1.3“川芎-赤芍調(diào)節(jié)血管新生靶蛋白—人類蛋白”相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein protein interaction network，PPI）構(gòu)建

將川芎-赤芍調(diào)節(jié)血管新生靶蛋白導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/cgi/input.pl），并指定“Homo sapiens”為限定研究物種，獲取蛋白互作信息后，再導(dǎo)入cytoscape中繪制“川芎-赤芍干預(yù)血管新生靶蛋白—人類蛋白”PPI，分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，篩選核心靶點(diǎn)。

1.4 核心靶點(diǎn)的GO分析和KEGG通路富集分析

應(yīng)用BioMart數(shù)據(jù)庫（http：//www.biomart.org/）轉(zhuǎn)換核心靶點(diǎn)的基因格式，利用Omishare網(wǎng)站進(jìn)行GO（gene ontology）和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）富集分析，并依據(jù)P值大小展示KEGG結(jié)果的前20條（P<0.01）。

1.5 關(guān)鍵活性化合物與核心靶點(diǎn)的分子對接

將1.3篩選出的核心靶點(diǎn)在PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www1.rcsb.org/）和UniProit數(shù)據(jù)庫中轉(zhuǎn)換成PDB格式，再從TCMSP數(shù)據(jù)庫下載關(guān)鍵活性成分的3D結(jié)構(gòu)。將小分子化合物和大分子蛋白質(zhì)通過AutoDock軟件分別進(jìn)行加氫和脫水-加氫處理，設(shè)置對接參數(shù)及對接BOX，借助AutoDock vina進(jìn)行運(yùn)算，再通過PyMol軟件輸出結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 川芎-赤芍的活性成分和靶蛋白、血管新生相關(guān)基因的獲取

獲得310種川芎、赤芍的成分，其中符合方法1.1篩選標(biāo)準(zhǔn)的活性成分37種，經(jīng)Pubchem數(shù)據(jù)庫驗證后，最終得到有效活性成分20種（其中1種為二者重復(fù)成分），相應(yīng)靶基因共117個。GeneCards數(shù)據(jù)庫中獲得血管新生相關(guān)基因4609個，應(yīng)用相關(guān)性中位數(shù)篩選，得到2327個相關(guān)基因。

2.2“川芎-赤芍活性成分—藥物調(diào)節(jié)血管新生靶點(diǎn)”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將川芎-赤芍靶蛋白與血管新生相關(guān)基因取交集，得到藥物調(diào)節(jié)血管新生的潛在靶點(diǎn)72個。其對應(yīng)18個有效成分。構(gòu)建“川芎-赤芍活性成分—藥物調(diào)節(jié)血管新生靶點(diǎn)”PPI，分析結(jié)果顯示黃芩素（baicalein）、鞣花酸（ellagic acid）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、豆甾醇（stigmasterol）、楊梅酮（myricanone）、（+）-兒茶素[（+）-catechin]、阿魏酸（ferulic acid）、川芎嗪（tetramethylpyrazine）排名位于Degree值和BC值前10位，提示其可能是藥物調(diào)節(jié)血管新生的關(guān)鍵活性成分。上述關(guān)鍵活性成分主要來源于赤芍，提示赤芍作用更重要。見圖1、表1。

2.3 “川芎-赤芍調(diào)節(jié)血管新生靶蛋白—人類蛋白”PPI構(gòu)建與分析

“川芎-赤芍調(diào)節(jié)血管新生靶蛋白—人類蛋白”PPI分析表明，Degree值和BC值都位于前10的靶點(diǎn)有8個，分別為蛋白激酶B（protein kinase B，AKT1）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤蛋白p53（tumor protein P53，TP53）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、熱休克蛋白90αA1（heat shock protein 90 Alpha family class A member 1，HSP90AA1）、c-fos原癌基因蛋白（proto-oncogene c-Fos，F(xiàn)OS），提示它們可能為藥對干預(yù)血管新生的關(guān)鍵靶蛋白。見圖2。

2.4 GO和KEGG分析及核心靶點(diǎn)的確定

對川芎-赤芍調(diào)節(jié)血管新生靶蛋白進(jìn)行GO及KEGG分析，以P<0.01為篩選條件，分別得到5438個相關(guān)條目和216條富集通路，其中，富集前20條的通路見圖3。

GO分析表明，藥對作用涉及生物過程有27個條目，主要為細(xì)胞的增殖、生長、粘附和聚集等方面;相關(guān)的分子功能條目有8個，涉及活動分子傳感器、轉(zhuǎn)錄監(jiān)管機(jī)構(gòu)活動、抗氧化等方面;細(xì)胞組成有14個條目，涉及細(xì)胞膜、細(xì)胞外區(qū)域、突觸等感受外界信號的結(jié)構(gòu)。

KEGG分析結(jié)果顯示，相關(guān)通路為AGE-RAGE信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、IL-17信號通路（IL-17 signaling pathway）、流體剪應(yīng)力與動脈粥樣硬化（fluid shear stress and atherosclerosis signaling pathway）信號通路，并且存在多靶點(diǎn)的相互協(xié)調(diào)作用。

2.5 分子對接

除（+）-catechin因其結(jié)構(gòu)的特殊性，無法進(jìn)行對接之外，關(guān)鍵活性成分與靶蛋白的結(jié)合能信息見表2，部分化合物與靶點(diǎn)分子的具體對接過程見封三圖5。結(jié)果顯示，其中51個對接結(jié)果有較優(yōu)的對接活性（結(jié)合能≤-5.0），29個對接結(jié)果有強(qiáng)烈的匹配活性（結(jié)合能≤-7.0）。以上結(jié)果表明，川芎-赤芍關(guān)鍵活性成分與其調(diào)節(jié)血管新生靶蛋白可有效結(jié)合。

3 討論

本研究分析表明，黃芩素、鞣花酸、β-谷甾醇、豆甾醇、楊梅酮、（+）-兒茶素、川芎嗪和阿魏酸可能為血府逐瘀湯中川芎-赤芍調(diào)節(jié)血管新生的關(guān)鍵活性化合物。川芎嗪可促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子（VEGFA）的表達(dá)從而促進(jìn)血管新生[4]。阿魏酸是肉桂酸的衍生物之一，可通過抑制環(huán)氧合酶-2（COX-2）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGFA）表達(dá)，從而表現(xiàn)出抗血管生成活性[5]。黃芩素屬于黃酮類化合物，其藥理作用與抗炎、抗血管生成、抗轉(zhuǎn)移有關(guān)，可破壞腫瘤血管系統(tǒng)的發(fā)育來抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展[6]。鞣花酸是一種多酚二內(nèi)酯，可下調(diào)VEGF基因表達(dá)，抑制腫瘤血管生成[7]。β-谷甾醇和豆甾醇屬于植物甾醇，其中β-谷甾醇既能促進(jìn)創(chuàng)傷愈合過程的血管新生，又顯著抑制VEGFA的表達(dá)，抑制腎腫瘤血管新生[8]。而豆甾醇可通過下調(diào)TNF-α抑制小鼠的腫瘤血管生成并抑制膽管癌的生長[9]，還可以刺激血管生成從而有益于缺血性疾病的治療[10]。（+）-兒茶素屬于多元酚類的一種，具有明顯的抗血管生成作用，從而抑制腫瘤的生長和擴(kuò)散[11]。楊梅酮具有強(qiáng)大的抗肺癌活性，但其在血管新生方面的作用還有待進(jìn)一步研究[12]。

本研究分析提示，AKT1、VEGFA、IL-6、TP53、TNF、PTGS2、HSP90AA1、FOS是川芎-赤芍調(diào)節(jié)血管新生的關(guān)鍵靶點(diǎn)，AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化信號通路等為關(guān)鍵信號通路。

流體剪切應(yīng)力（fluid shear stress，F(xiàn)SS）是血流與血管壁內(nèi)皮表面產(chǎn)生的摩擦力，在血管生物學(xué)中起重要作用，參與調(diào)控血管新生[13]。作用在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的FSS會在短時間內(nèi)引發(fā)一系列的反應(yīng)，包括調(diào)節(jié)Krüppel樣因子2和4（Krüppel-like factor 2/4，KLF2/4）轉(zhuǎn)錄、激活血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGFR2）和酪氨酸激酶（TK），以及一氧化氮（NO）的釋放;進(jìn)而激活MAP激酶、整合素、NF-κB、p21活化激酶和c-Jun N端激酶（JNK）;從而這些通路下游表達(dá)不同的轉(zhuǎn)錄組[14]。

AGE-RAGE信號通路對血管系統(tǒng)的影響主要與炎癥及氧化應(yīng)激有關(guān)[16]。關(guān)鍵靶蛋白中的AKT1、IL-6、TNF、VEGFA在該通路中發(fā)揮重要作用。AGE-RAGE可降低血管VEGFR2的蛋白質(zhì)表達(dá)，造成血管生成障礙，從而引起一系列糖尿病并發(fā)癥[17]。白細(xì)胞介素-17（IL-17）信號通路同樣參與調(diào)控血管新生的過程。關(guān)鍵靶蛋白中的IL-6、TNF在該通路中占據(jù)重要地位。IL-17可誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移及成血管作用，并增強(qiáng)VEGFA表達(dá)，參與腫瘤間質(zhì)中炎癥反應(yīng)和微血管形成[18]。

綜上所述，本研究對血府逐瘀湯中的“川芎-赤芍”藥對進(jìn)行了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，定位其調(diào)節(jié)血管新生的關(guān)鍵成分、靶點(diǎn)與可能的作用通路。但本研究通過數(shù)據(jù)挖掘，對藥物調(diào)控血管新生的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行預(yù)測，仍具有一定的局限性，未來還需要在基礎(chǔ)實(shí)驗及臨床試驗中進(jìn)行進(jìn)一步驗證。

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（收稿日期：2021-07-13）