凍害脅迫下水處理對茶樹抗寒生理指標的影響

孫霞 宋大鵬 劉加英 袁安友 韓順英 丁仕波

摘要：為探究水處理對茶樹凍害脅迫的效應(yīng)，以中茶108為材料，在不同水處理條件下，采用人工氣候室模擬冬季凍害的發(fā)生，測定茶樹葉片中多項生理生化指標的變化規(guī)律。結(jié)果表明，茶樹葉片中過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）的活性，脯氨酸、丙二醛、可溶性糖和可溶性蛋白的含量均受低溫脅迫誘導(dǎo)，開始降溫時，除丙二醛含量下降外，其余均呈上升趨勢?！暗蜏亍獌龊Α蜏亍泵{迫過程中，澆水處理的茶樹葉片中POD和SOD活性，脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量均高于不澆水處理，丙二醛含量變化趨勢則與之相反，不同處理間差異極顯著;CAT活性無顯著差異。澆水處理有利于茶樹多個抗寒生理指標的改變。

關(guān)鍵詞：茶樹;水處理;凍害脅迫;生理指標

Effects of Water Treatmenton Cold-resistant

Physiological Indexes of Camellia

sinensis under Freezing Stress

SUN Xia1， SONG Dapeng1， LIU Jiaying1， YUAN Anyou1， HAN Shunying2， DING Shibo1*

1. Tea Research Institute， Rizhao Academy of Agricultural Sciences， Rizhao 276800， China;

2. Agricultural Comprehensive Service Center of Kouguan Town， Rizhao 276800， China

Abstract： To study the effects of water treatment on cold-resistant physiological indexes， Camellia sinensis cv. Zhongcha 108 was selected to detect some physiological indexes of leaves under freezing stress. The results showed that the activities of POD （peroxidase）， SOD （superoxide dismutase） and CAT （catalase） were induced by low temperature stress， also the contents of proline， MDA， soluble sugar and soluble protein were similar. At the beginning of cooling， MDA content decreased and the others increased. During the stress process of "low temperature-freezing-low temperature"， the activities of POD and SOD， the contents of proline， soluble sugar and soluble protein in tea leaves treated with watering were higher than those without watering treatment， while the change trend of MDA content was opposite. Furthermore， there was significant differences in six physiological indexes between watering treatment and the control， In contrast， there was no significant difference in CAT activity. During freezing stress， watering treatment would cause the changes of several cold-resistance physiological indexes of tea plants.

Keywords： Camellia sinensis， water treatment， freezing stress， physiological index

植物凍害（Plant frost）是造成高緯度地區(qū)越冬農(nóng)作物減產(chǎn)、絕產(chǎn)的氣象災(zāi)害之一，冬季土壤水分含量與作物存活率密切相關(guān)[1-2]，合理灌溉是保障作物安全越冬的一項重要措施[3-5]。越冬作物自身通過調(diào)節(jié)可溶性糖、氨基酸、丙二醛等含量或相關(guān)酶活性的變化，參與滲透調(diào)節(jié)、低溫保護以及細胞膜的合成、流動和穩(wěn)定性等多個方面，增強自身對一定程度凍害的耐受性[6-16]。

茶樹喜溫怕寒，冬季的極端低溫和初春的“倒春寒”是影響茶樹生長和繁殖的重要因素[17-18]。山東茶區(qū)是中國茶樹栽培的最北線，緯度較高，季風(fēng)性氣候明顯，冬季寒冷干燥，茶樹極易受到凍害，越冬需要進行防護，生產(chǎn)成本高。凍害一直是制約山東茶產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的主要瓶頸。山東茶區(qū)冬季缺水較嚴重，研究表明，茶樹代謝活動受到影響，抗逆性顯著降低，在立冬后茶園澆足澆透越冬水，有利于減輕凍害[19-23]。茶樹受到凍害脅迫時，眾多的基因、基因家族和代謝通路等也參與了這一復(fù)雜的生理生化過程[24-34]，但茶樹抗凍機理至今尚未完全明確。而模擬自然條件下，“低溫—凍害—低溫”脅迫發(fā)生時，伴隨著溫度和時間的改變，不同水處理條件下茶樹體內(nèi)一些與抗寒相關(guān)生理指標的變化鮮見報道，相關(guān)研究對冬季山東省茶樹安全越冬具有指導(dǎo)和借鑒的意義。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗材料

供試材料為山東日照市農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所茶園的2年生中茶108茶苗。

1.2 ?試驗設(shè)計

隨機選取100株生長良好且長勢一致的茶樹苗移栽至人工氣候室內(nèi)。光照12 h（3 500 lx，24 ℃），黑暗12 h（16 ℃），空氣濕度80%，正常田間管理，培養(yǎng)180 d。設(shè)置澆水（Tn，土壤深20 cm處含水量為30%）和不澆水（Cn，土壤深20 cm處含水量為15%）2個處理，澆水10 d后開始“低溫—凍害—低溫”的脅迫處理，空氣濕度降至60%。

從10 ℃24 h時開始，梯度降溫（1 ℃/h）至0 ℃時1 h，?7 ℃時0 h、6 h、12 h、18 h、24 h、30 h和36 h;隨后梯度升溫（1 ℃/h）至0 ℃時1 h，10 ℃時0 h、12 h和24 h時分別摘取茶樹頂端第2～4片成熟葉（至少5株，3次重復(fù)），低溫蒸餾水快速洗凈，濾紙吸干，液氮冷凍，?70 ℃超低溫冰箱保存，備用。

1.3 ?植物生理生化指標檢測

低溫稱取1.00 g樣品，加入1 000 μL PBS溶液（pH=7.2），充分研磨粉碎，移入1.5 mL離心管中，4 000 r/min離心30 min，收集上清，冷凍備用。

依據(jù)酶聯(lián)免疫試劑盒（ELISA，酶聯(lián)生物）使用說明，測定樣品中過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性;脯氨酸、丙二醛、可溶性糖和可溶性蛋白的含量。

1.4 ?數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用Excel 2019和GraphPad Prism5進行數(shù)據(jù)分析和圖表繪制。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?不同水處理茶樹葉片POD活性的變化

在“低溫—凍害—低溫”脅迫過程中，澆水處理的葉片中POD活性均高于不澆水處理（圖1）。POD活性明顯受低溫脅迫誘導(dǎo)，處理開始溫度10 ℃/24 h時，澆水和不澆水處理的POD酶活性分別為177.73 U/mL和126.78 U/mL;降至0 ℃/1 h時，不同水處理的POD活性均升高，不澆水處理的達到最大值170.82 U/mL。

隨著凍害脅迫（?7 ℃）持續(xù)時間的延長，POD活性均呈下降趨勢;凍害脅迫結(jié)束后，隨著溫度的升高，澆水處理的POD活性上升趨勢明顯，在10 ℃/12 h時達到最大值220.85 U/mL，隨后下降，10 ℃/24 h時POD的活性降至124.68 U/mL;不澆水處理的POD活性隨著氣溫升高，呈持續(xù)下降趨勢，氣溫升至10 ℃/0 h時POD活性降至最低49.33 U/mL，約為最高值的1/3，隨后活性維持低位水平，10 ℃/24 h時的POD活性達到73.72 U/mL。

2.2 ?不同水處理茶樹葉片SOD活性的變化

在“低溫—凍害—低溫”脅迫過程中，澆水處理的SOD活性均高于不澆水處理（圖2）。SOD的活性明顯受低溫脅迫誘導(dǎo)。處理開始溫度降至10 ℃/24 h時，澆水和不澆水處理的SOD活性分別為75.20 U/mL和50.81 U/mL;降至0 ℃/1 h時，不同水處理的SOD活性均升高，但升高幅度存在差異，不澆水處理的SOD活性達到最大值87.29 U/mL;隨著凍害脅迫（?7 ℃）持續(xù)時間的延長，SOD活性呈下降趨勢;凍害脅迫結(jié)束后，隨著溫度的升高，澆水處理的SOD活性呈上升趨勢，在10 ℃/12 h時達到最大值131.19 U/mL，10 ℃/24 h時SOD的活性降至79.81 U/mL;而不澆水處理SOD活性隨著溫度升高呈下降趨勢，10 ℃/24 h時的SOD活性降至最低值20.17 U/mL。

2.3 ?不同水處理茶樹葉片CAT活性的變化

在“低溫—凍害—低溫”脅迫過程中，不同水處理間的茶樹葉片CAT活性差異較?。▓D3）。CAT活性受低溫脅迫誘導(dǎo)，處理開始當(dāng)溫度降至10 ℃/24 h時，澆水和不澆水處理的CAT活性分別為31.25 U/mL和25.75 U/mL;當(dāng)溫度降至0 ℃/1 h時，CAT活性均升高，達到最大值，分別為39.89 U/mL和47.30 U/mL，不澆水處理的CAT活性增加約1倍;隨著凍害脅迫（?7 ℃）時間的延長，CAT活性均略有下降后維持在較高水平波動，不同水處理間差異較小;凍害脅迫結(jié)束，升溫過程中，不同水處理間CAT活性呈持續(xù)下降，在10 ℃/24 h時降至最低值，分別為12.40 U/mL和18.62 U/mL，均低于檢測初始時的CAT活性，且澆水處理的CAT活性下降幅度大于不澆水處理。

2.4 ?不同水處理茶樹葉片脯氨酸含量的變化

在“低溫—凍害—低溫”脅迫過程中，澆水處理的葉片中脯氨酸含量均高于不澆水處理（圖4）。處理開始降溫至10 ℃/24 h時，澆水處理的葉片中脯氨酸含量（23.75 ng/mL）高于不澆水處理（21.91 ng/mL）;伴隨著溫度的下降，不同水處理間脯氨酸含量的積累量和積累強度呈上升趨勢;澆水處理脯氨酸含量在溫度降至0 ℃/1 h時達到最大值37.66 ng/mL，凍害來臨時（?7 ℃）含量略有下降，但仍維持在較高含量水平波動，凍害后升溫過程中脯氨酸含量積累雖有波動，但均高于初始檢測值。

不澆水處理在降溫和凍害來臨時脯氨酸含量增加強度較低，積累響應(yīng)慢于澆水處理，在?7 ℃/0 h達到最大值（34.62 ng/mL），然后緩慢下降波動，在凍害結(jié)束后，溫度升至10 ℃/12 h時達到最低值16.42 ng/mL，約為最高值的1/2。

2.5 ?不同水處理茶樹葉片丙二醛含量的變化

在“低溫—凍害—低溫”脅迫過程中，澆水處理的葉片中丙二醛含量均低于不澆水處理（圖5）。處理開始溫度降至10 ℃/24 h時，不同水處理間的丙二醛含量差異極小，均約為4.6 nmol/mL，隨著溫度和時間改變，丙二醛的含量都呈“先降后升”的趨勢;丙二醛含量最低點均出現(xiàn)在凍害脅迫時，不澆水處理為3.525 nmol/mL（?7 ℃/18 h），澆水處理為2.676 nmol/mL（?7 ℃/30 h）;凍害結(jié)束升溫過程中，丙二醛含量的積累呈上升趨勢，水處理的丙二醛含量增幅小于不澆水處理，在溫度升至10 ℃時丙二醛含量超過初始含量達到最大值，澆水和不澆水處理分別為5.468 nmol/mL（10 ℃/12 h）和6.231 nmol/mL（10 ℃/24 h）。

2.6 ?不同水處理茶樹葉片可溶性蛋白含量的變化

在“低溫—凍害—低溫”脅迫過程中，澆水處理的可溶性蛋白含量均高于不澆水處理（圖6）?？扇苄缘鞍踪|(zhì)含量受低溫脅迫誘導(dǎo)增加，降溫過程中，在處理開始的10 ℃/24 h時澆水處理葉片中可溶性蛋白含量為918.70 μg/mL，不澆水處理的僅695.63 μg/mL，0 ℃/1 h時可溶性蛋白含量均達到最大值，分別為991.25 μg/mL和805.40 μg/mL;凍害脅迫過程中，隨著脅迫時間的延長，可溶性蛋白含量和積累強度呈波動下降趨勢，但整體波動較小，維持在高位水平;后期升溫過程中，可溶性蛋白含量呈先升后降的趨勢，10 ℃/24 h時達到最低值，澆水和不澆水處理分別為531.68 μg/mL和410.66 μg/mL。

2.7 ?不同水處理茶樹葉片可溶性糖含量的變化

在“低溫—凍害—低溫”脅迫過程中，澆水處理的可溶性糖含量和積累強度均高于不澆水處理（圖7）。可溶性糖含量和積累強度受低溫脅迫誘導(dǎo)增加，處理開始的10 ℃/24 h時，澆水處理葉片中可溶性糖含量（234.33 μg/mL）高于不澆水處理（153.29 μg/mL）。

隨著溫度降低，澆水處理的可溶性糖積累量在0 ℃/1 h時達到最大值291.72 μg/mL，不澆水處理的可溶性糖積累在凍害發(fā)生后-7 ℃/30 h時達到最大值171.53 μg/mL;在凍害結(jié)束后升溫至10 ℃/24 h時，澆水處理和不澆水處理可溶性糖含量均降至最低值，分別為185.59 μg/mL和134.165 μg/mL。

3 ?討論

植物凍害是指氣溫降至冰點以下，植物因細胞間隙結(jié)冰而受到的傷害。植物受凍后，會在其局部表現(xiàn)出干枯失水、開裂、萎蔫等現(xiàn)象，而凍害發(fā)生前后伴隨著低溫脅迫。

凍害脅迫過程中，植物體內(nèi)發(fā)生一系列適應(yīng)性生理變化，多種保護性物質(zhì)積累。目前普遍認為，植物低溫傷害時最先受沖擊的是其生物膜系統(tǒng)，從而導(dǎo)致電解質(zhì)外滲，細胞內(nèi)區(qū)域化削弱甚至喪失，并因其膜結(jié)合酶構(gòu)象改變，導(dǎo)致植物細胞代謝和功能紊亂。

植物可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，對生物膜具有穩(wěn)定和保護作用，其含量可以反映植物對非生物脅迫的耐受能力;而丙二醛作為細胞膜脂過氧化作用的最終產(chǎn)物，一定程度可以反映植物受逆境脅迫傷害的程度[11-12，14-16，35]。

本研究中，脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白的含量均受低溫脅迫誘導(dǎo)增加，隨著低溫脅迫溫度下降和時間的延長，澆水處理的3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量均在凍害來臨前（0 ℃/1 h）達到最大值，不澆水處理的3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)增幅、最大值出現(xiàn)的時間均低或晚于澆水處理。在“低溫—凍害—低溫”脅迫過程中，澆水處理的脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量均高于不澆水處理，而丙二醛含量的檢測結(jié)果與之相反。與前人的研究結(jié)果[7，36-46]基本一致，說明水處理可以提高茶樹對“低溫—凍害—低溫”的耐受性。

抗氧化酶系統(tǒng)被認為是植物遭受環(huán)境脅迫時重要的防御體系，研究逆境脅迫下抗氧化酶系統(tǒng)的響應(yīng)，是揭示植物抗逆機理的重要環(huán)節(jié)[47]。植物受到脅迫時，為維持正常的生長，啟動氧化物清除機制，抗氧化酶系統(tǒng)中的SOD、CAT和POD等相互協(xié)調(diào)，在共同抵御脅迫中發(fā)揮著重要的作用[6-10，13，35，48-49]。

本研究中，POD、SOD和CAT活性均受低溫脅迫誘導(dǎo)，隨著低溫脅迫溫度下降和時間的延長，3種酶活性均增加，接近或達到最大值;但在凍害脅迫過程中和隨后升溫時，3種酶活性變化并不完全一致，同一種酶在不同處理間的活性變化也不完全相同。在“低溫—凍害—低溫”脅迫過程中，澆水處理的POD和SOD活性均高于不澆水處理，澆水處理的POD和SOD活性變化呈雙峰M型，高峰值分別出現(xiàn)在降溫的0 ℃/1 h和升溫的10 ℃/12 h兩個時間點，“低溫—凍害—低溫”脅迫結(jié)束時的POD和SOD活性均低于初始檢測值;而不澆水處理的POD和SOD活性和不同水處理的CAT活性均呈偏單峰曲線，高峰值出現(xiàn)在降溫的0℃/1 h時，凍害脅迫時活性略有下降，但維持在較高水平波動，隨著后期溫度的升高，3個酶活性維持下降趨勢，但最低值出現(xiàn)的時間存在差異;在“低溫—凍害—低溫”脅迫過程中，不同澆水處理的CAT活性變化差異未達顯著水平，且升溫10 ℃/24 h時的CAT活性不澆水處理高于澆水處理。

本研究中，POD和SOD活性與植物的抗寒性密切相關(guān)，凍害發(fā)生前的澆水處理可以提高植物的凍害脅迫耐受性，與前人研究結(jié)果相同[3-5，43，46];而CAT活性在“低溫—凍害—低溫”脅迫過程中雖多個取樣點澆水處理高于不澆水處理，CAT活性與茶樹在凍害脅迫耐受性方面的關(guān)系不大，與林鄭和等[45]研究結(jié)果的差異可能與茶樹品種選擇和“低溫—凍害—低溫”的試驗設(shè)計等有關(guān)。

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