miR-328-5p通過調(diào)節(jié)自噬影響乳腺癌細(xì)胞對紫杉醇化療敏感性的機制

李建梅，孫靜宜，馬英橋，趙 月，李仕武

化療是乳腺癌臨床治療中不可缺少的重要治療手段之一，而紫杉醇(Taxol)是治療乳腺癌的常用一線化療藥物，在控制病情、延長患者生存時間方面具有較好效果[1-2]。但根據(jù)臨床對乳腺癌患者的隨訪追蹤調(diào)查，使用Taxol期間因發(fā)生耐藥性而限制了該藥物的應(yīng)用，這使得其有效率僅為30%～70%，且效果不長久，一般只能持續(xù)6～10個月，同時增加了患者復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，故在目前臨床抗腫瘤藥物有限的條件下，提高乳腺癌對Taxol的敏感性尤為重要[3-4]。隨著對微小RNAs(miRNAs)研究的不斷深入，miRNAs通過靶向其下游基因調(diào)節(jié)腫瘤多藥耐藥成為研究熱點。曾有研究顯示，miR-328在乳腺癌組織中低表達(dá)，且miR-328的過表達(dá)抑制了乳腺癌細(xì)胞增殖、耐藥性和細(xì)胞周期進展[5]。既往有文獻(xiàn)顯示，整合素家族中整合素α5(ITGA5)可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生[6]。還有研究證實，miR-33a-5p可通過抑制自噬，進而提高乳腺癌細(xì)胞對放療的敏感性[7]。本文旨在分析miR-328-5p與ITGA5的關(guān)系及對乳腺癌Taxol敏感性的影響，進一步探討miR-328-5p調(diào)節(jié)乳腺癌化療耐藥的具體機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 胎牛血清及RPMI-1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司，CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司，Matri-gel基質(zhì)膠及細(xì)胞培養(yǎng)基均購自美國BD公司，miR-328-5p和miR-NC(批號：121547)均購自上海美軒生物科技有限公司，兔抗人ITGA5多克隆抗體購自博奧派克生物有限公司、兔抗人ITGA5單克隆抗體購自美國Abcam公司，siRNA陰性對照、siRNA干擾試劑盒均購自上海生工生物工程有限公司。PCR儀(Applied Biosystems ABI7500)、化學(xué)發(fā)光儀(Promega 30IOC)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad ChemiDoc XRS)、流式細(xì)胞儀及透射電鏡(Thermo fisher Spectra S/TEM)均購自美國，熒光顯微鏡(Olympus BX53)、光學(xué)顯微鏡(Olympus CX33)及相差顯微鏡(Olympus CKX53)均購自日本。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：乳腺癌MCF-7細(xì)胞購自美國ATCC細(xì)胞庫。MCF-7細(xì)胞于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，過程中加入青霉素-鏈霉素，然后置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的培養(yǎng)箱中進行恒溫培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞的生長速度及狀態(tài)，每2～3天更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞長至對數(shù)生長期時，用0.25%的胰酶消化，然后進行傳代，或擴大培養(yǎng)，或進行試驗。最后用胰酶消化處于對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞，1000 r/min離心10 min，棄上清液，向沉淀中加入細(xì)胞凍存液(含10%甲基亞砜的培養(yǎng)基)，混懸細(xì)胞后將其轉(zhuǎn)移至細(xì)胞凍存管中，用封口膜封閉凍存管口，依次于4 ℃保存2 h，-20 ℃保存2 h，然后置于-80 ℃的低溫冰箱中過夜，次日將細(xì)胞凍存管轉(zhuǎn)移至液氮罐中長期保存。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染：選取生長狀態(tài)良好的乳腺癌MCF-7細(xì)胞，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)分別使用miR-328-5p mimics和si-ITGA5轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，用于后續(xù)實驗。

1.2.3實驗分組及處理：①miR-328-5p過表達(dá)時MCF-7細(xì)胞對Taxol敏感性：miR-NC組(轉(zhuǎn)染陰性對照)、miR-328-5p組(轉(zhuǎn)染miR-328-5p mimics)、miR-NC+Taxol組(轉(zhuǎn)染陰性對照后加入50 nmol/L的Taxol培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞24 h)及miR-328-5p+Taxol組(轉(zhuǎn)染miR-328-5p mimics后加入50 nmol/L的Taxol培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞24 h)。②干擾ITGA5后MCF-7細(xì)胞對Taxol敏感性：si-NC組(轉(zhuǎn)染陰性對照)、si-ITGA5組(轉(zhuǎn)染si-ITGA5)、si-NC+Taxol組(轉(zhuǎn)染陰性對照后分別加入5、50、100 nmol/L的Taxol培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞24 h)和si-ITGA5+Taxol組(轉(zhuǎn)染si-ITGA5后分別加入5、50、100 nmol/L的Taxol培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞24 h)。

1.2.4miR-328-5p、ITGA5 mRNA表達(dá)檢測：采用qRT-PCR檢測miR-328-5p、ITGA5 mRNA相對表達(dá)水平[8]，使用RNA提取試劑盒從各組細(xì)胞中提取RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script RT Reagent Kit和SYBR Prime Script miRNA RT-PCR Kit 試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR。通過計算機系統(tǒng)自動分析各個樣本Ct值，采用2-ΔΔCt計算miR-328-5p、ITGA5 mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.5細(xì)胞增殖：采用CCK-8實驗檢測細(xì)胞增殖情況[9]，取各組對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞胰酶消化后用牛鮑計數(shù)板計數(shù)。以每孔3000個細(xì)胞將不同濃度Taxol(5、50、100 nmol/L)處理的MCF-7細(xì)胞分別鋪于96孔板中，培養(yǎng)48 h，加入10 μl CCK-8試劑，室溫孵育4 h，使用酶標(biāo)儀測定450 nm處OD值并計算MCF-7細(xì)胞增殖抑制率，增殖抑制率(%)=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.6細(xì)胞凋亡：采用Annexin-FITC/PI雙染法檢測各組MCF-7細(xì)胞凋亡情況[10]，細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染處理后，胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗滌，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI試劑室溫避光孵育30 min后，190 μl結(jié)合緩沖液洗滌，1000 r/min離心5 min，使用PBS重懸細(xì)胞上機應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測。記錄汞激發(fā)波長488 nm處紅色熒光。計數(shù)1000個細(xì)胞，計算細(xì)胞凋亡率，凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.2.7ITGA5、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B(LC3B)及p62蛋白相對含量：采用Western Blot方法[11]測定ITGA5、LC3B及p62蛋白相對含量，使用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，通過BCA法測定蛋白濃度，根據(jù)目的蛋白和內(nèi)參灰度值之比分析轉(zhuǎn)染miR-328-5p及干擾ITGA5表達(dá)前后ITGA5、LC3B及p62蛋白的相對含量。

2 結(jié)果

2.1miR-328-5p轉(zhuǎn)染效率 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，經(jīng)轉(zhuǎn)染后，miR-NC組和miR-328-5p組中miR-328-5p的相對表達(dá)量分別為1.08±0.02、127.64±3.07。轉(zhuǎn)染miR-328-5p mimics后MCF-7細(xì)胞中miR-328-5p相對表達(dá)量顯著提高，約為miR-NC組的118倍，比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.2miR-328-5p對乳腺癌MCF-7細(xì)胞自噬水平的影響 miR-328-5p組、miR-NC+Taxol組LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ值顯著低于miR-NC組，p62蛋白含量顯著高于miR-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；miR-328-5p+Taxol組LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ值均低于miR-NC+Taxol組和miR-328-5p組，p62蛋白含量均高于miR-NC+Taxol組和miR-328-5p組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 miR-328-5p對乳腺癌MCF-7細(xì)胞自噬水平的影響

2.3miR-328-5p對乳腺癌MCF-7細(xì)胞ITGA5 mRNA及蛋白表達(dá)的影響 miR-328-5p組、miR-NC+Taxol組ITGA5 mRNA及蛋白表達(dá)均低于miR-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；miR-328-5p+Taxol組ITGA5 mRNA及蛋白表達(dá)顯著低于miR-NC+Taxol組和miR-328-5p組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 miR-328-5p對乳腺癌MCF-7細(xì)胞ITGA5 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

2.4干擾ITGA5后乳腺癌MCF-7細(xì)胞ITGA5 mRNA及蛋白表達(dá)情況 qRT-PCR分析顯示，si-ITGA5組ITGA5 mRNA及蛋白表達(dá)水平分別為0.38±0.11及0.24±0.06，si-NC組分別為1.19±0.33及0.64±0.11。si-ITGA5組ITGA5 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著低于si-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.5干擾ITGA5后Taxol對MCF-7細(xì)胞自噬的影響 si-ITGA5組、si-NC+Taxol組(50 nmol/L)LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ值顯著低于si-NC組，而p62蛋白含量顯著高于si-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。si-ITGA5+Taxol組(50 nmol/L)LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ值均低于si-ITGA5組和si-NC+Taxol組，p62蛋白含量均高于si-ITGA5組和si-NC+Taxol組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 干擾ITGA5后Taxol對乳腺癌MCF-7細(xì)胞自噬水平的影響

2.6干擾ITGA5后不同濃度Taxol對乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、凋亡的影響 不同Taxol濃度時，si-ITGA5+Taxol組乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率均顯著高于si-NC+Taxol組，差異統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Taxol濃度50 nmol/L、100 nmol/L時，si-NC+Taxol組、si-ITGA5+Taxol組乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率均顯著高于Taxol濃度5 nmol/L時，且Taxol濃度100 nmol/L時兩組上述指標(biāo)顯著高于50 nmol/L時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 干擾ITGA5后不同濃度Taxol對乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、凋亡的影響

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，在女性癌癥所致死亡中居首位[12-13]。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，2018年全世界有210萬左右新診斷乳腺癌病例，約占女性腫瘤病例的25%[14]。蒽環(huán)類藥物、紫杉烷類藥物和DNA損傷劑(環(huán)磷酰胺、氟尿嘧啶或鉑類化合物)是臨床上治療乳腺癌的主要化療藥物。大量臨床試驗證明，Taxol是一種能抑制微管聚合從而抑制有絲分裂的天然藥物，能顯著提高乳腺癌患者的存活率，已成為乳腺癌輔助化療的一線藥物，然而近年來臨床亦有不少文獻(xiàn)報道患者在接受紫杉醇治療后出現(xiàn)藥物耐受，最終導(dǎo)致治療失敗[15-18]。

細(xì)胞自噬屬于Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，屬于機體抵御不良環(huán)境的一種自我保護機制，是通過隔離膜包裹細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞器形成自噬體，然后與溶酶體融合形成自噬溶酶體并在其中發(fā)生降解的過程，對維持細(xì)胞穩(wěn)定有著較好的作用。隨著生物學(xué)研究的不斷深入，有研究提出，在腫瘤發(fā)生、進展過程中，細(xì)胞自噬起著關(guān)鍵作用，還可參與腫瘤化療藥物細(xì)胞毒性的發(fā)揮[19]。本組結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-328-5p后，miR-328-5p組LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ值顯著低于miR-NC組，而p62蛋白含量顯著高于miR-NC組，且miR-328-5p+Taxol組上述指標(biāo)較miR-NC+Taxol組更低或更高。由此提示，miR-328-5p的過度表達(dá)可抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞自噬作用。LC3B是與細(xì)胞自噬活性密切相關(guān)的基因，曾有文獻(xiàn)證實，LC3B-Ⅰ的低表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、進展密切相關(guān)[20]。本文進一步研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)干擾ITGA5后發(fā)現(xiàn)，MCF-7細(xì)胞內(nèi)ITGA5 mRNA及蛋白表達(dá)顯著降低，且si-ITGA5組LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ值顯著低于si-NC組，而p62蛋白含量顯著高于si-ITGA5組，因此ITGA5表達(dá)與細(xì)胞的自噬也有著一定聯(lián)系。ITGA5是整合素家族的重要成員，可與ITGβ1結(jié)合形成二聚體，是基質(zhì)重要成分纖維連接蛋白的受體。近年來，ITGA5可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬和凋亡增加癌細(xì)胞對化療藥物敏感性的觀點被不少學(xué)者提出[21]，但尚未明確，僅有報道證實，ITGA5可誘導(dǎo)自噬作用發(fā)生[22]。本文進一步分析miR-328-5p與ITGA5的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-328-5p后，乳腺癌MCF-7細(xì)胞內(nèi)ITGA5 mRNA及蛋白表達(dá)含量顯著降低。且在先前研究基礎(chǔ)上，本文將干擾ITGA5與Taxol聯(lián)合處理乳腺癌MCF-7細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，不同Taxol濃度時，si-ITGA5+Taxol組細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率均顯著高于si-NC+Taxol組，且隨著Taxol濃度升高細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率均呈上升趨勢。提示干擾ITGA5后乳腺癌MCF-7細(xì)胞對Taxol的敏感性增強。因此，干擾ITGA5的表達(dá)可通過抑制細(xì)胞的自噬作用和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而提高MCF-7細(xì)胞對Taxol的敏感性。

miR-328-5p可增強乳腺癌MCF-7細(xì)胞對化療藥物Taxol的敏感性，作用機制可能與miR-328-5p通過抑制ITGA5表達(dá)，從而抑制細(xì)胞自噬相關(guān)。