鳶尾草和體外沖擊波對去勢大鼠骨折愈合的影響△

謝河秋，李 力，楊紫芳

（駐馬店市中心醫(yī)院a.疼痛科；b.神經(jīng)外科，河南駐馬店463000）

骨質疏松癥是一種臨床常見的代謝性骨病，隨著年齡的增長而逐漸加劇，尤其是在絕經(jīng)后的女性中［1］。骨質疏松會導致骨礦物質密度下降、骨質量下降以及骨骼的微結構性骨折，而骨質疏松患者的骨折修復難度極大，有效促進骨折愈合具有重要的臨床意義［2］。研究發(fā)現(xiàn)，核因子E2相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2）/OH-1通路在絕經(jīng)后骨質疏松的發(fā)病過程中起重要作用，其激活可以增強對內(nèi)源性抗氧化劑對活性氧（ROS）的抑制作用，從而促進骨再生［3］。體外沖擊波（extracorporeal shock waves,ESW）主要被用于結石的治療，近年來研究顯示，ESW可以促進骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP），從而加速骨形成和骨愈合［4，5］。中藥也在骨質疏松的治療中起到了重要作用，鳶尾素（irisin）主要由骨骼肌合成和分泌，可促進成骨細胞的再生，增加皮質骨的質量和強度，并使破骨細胞減少，從而發(fā)揮增加骨量的作用，研究發(fā)現(xiàn)，其可通過調控Nrf2抑制絕經(jīng)后骨質疏松大鼠成骨細胞凋亡，緩解骨質疏松［6］，然而是否會促進骨折愈合仍不清楚。本文主要分析鳶尾素聯(lián)合ESW治療去勢骨質疏松性骨折模型大鼠的作用機制，為臨床更好地治療骨質疏松性骨折提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組

80只雌性SD大鼠隨機分為5組，分別為假手術組、模型組、模型+ESW組、模型+鳶尾素組、模型+ESW+鳶尾素組，每組16只。

1.2 動物模型建立與處理

1:1體積的鹽酸甲苯噻嗪（5 mg/kg）和鹽酸唑拉西泮（20 mg/kg）麻醉大鼠，切除大鼠的兩個卵巢（ovariectomy,OVX)［7］。其中，假手術組大鼠僅行開腹，沒有切除卵巢。

OVX術后12周后再次麻醉大鼠，切開并暴露右側股骨，通過擊打的方法建立股骨骨折模型，然后使用1 mm克氏針固定。影像檢查確認建模情況，并肌肉注射8萬單位青霉素預防感染。

ESW干預通過ESW治療儀進行［8］，能量密度為0.25 mJ/mm2，頻率為5 Hz，脈沖次數(shù)為1 600次，每周1次，共治療8周。鳶尾素的干預方法為骨折部位局部注射，濃度為500 ng/ml，劑量為0.1 ml，每周1次，連續(xù) 8 周［9］。

藥物干預8周后，對大鼠采用二氧化碳安樂死，分別進行以下檢測。

1.3 檢測指標

1.3.1 骨密度和破骨細胞指數(shù)

采用小動物骨密度儀檢測左側股骨密度。然后，取出中段骨痂組織，將組織在4%的多聚甲醛中浸泡過夜將其固定，固定后使用石蠟進行常規(guī)包埋。然后利用切片機將樣本切成5 μm厚的切片。制作成玻片標本后加入蘇木精（10%，室溫，10 min）和曙紅（0.5%，室溫，10 min）分別對細胞質和細胞核進行染色。在每個樣本中隨機選擇三個高倍視野進行觀察，破骨細胞指數(shù)即為單位面積中破骨細胞數(shù)目（個/μm2）。

1.3.2 MicroCT掃描

使用Micro-CT機在555 uA電流和42 kV電壓下掃描，層厚為1 mm，分辨率為8.73 μm，掃描角度為360°，以骨折部位為中點分別在上部和下部各選擇200張，然后統(tǒng)計骨體積分數(shù)（BV/TV）以及骨小梁的數(shù)量、厚度和分離度。

1.3.3 Western blot

將中段骨痂組織，假手術組取骨組織，裂解后收集總蛋白。通過8%的SDS-PAGE分離每個樣品中等量（50 μg）的蛋白質，并將其轉移到硝酸纖維素膜上。然后將5%脫脂牛奶完全浸沒硝酸纖維素膜來封閉非特異性抗原（室溫下2 h），將膜分別與一抗（1∶800稀釋）在4°C下孵育過夜，然后將山羊抗免IgG二抗按照1∶2 000的比例稀釋并在室溫下孵育1 h進行反應。使用化學發(fā)光試劑顯示，使用Quantum One軟件分析灰度計算BMP2、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、Nrf2、OH-1蛋白相對于GAPDH的表達量。

1.3.4 RT-qPCR

使用RNeasy Mini試劑盒取中段骨痂組織（假手術組取骨組織）中的總RNA，然后使用Bestar qPCR RT試劑盒將其逆轉轉錄為cDNA，條件如下：37°C/15 min；98°C/5 min。然后使用 Bestar?qPCR 預混液進行qPCR實驗，條件如下：95°C/2 min，94°C/20 s，58 °C 20 s，72 °C/20 s，40 個循環(huán)，最后在 72 °C下延伸4 min。使用Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測系統(tǒng)進行RT-qPCR分析。通過比較循環(huán)閾值并以GAPDH作為內(nèi)參計算Nrf2、OH-1 mRNA相對表達水平

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 骨密度和破骨細胞指數(shù)

骨密度和破骨細胞指數(shù)檢測結果見表1，骨密度檢測值由高至低依次為，假手術組＞模型+ESW+鳶尾素＞模型+ESW組＞模型+鳶尾素組＞模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。破骨細胞指數(shù)由低至高依次為，假手術組＜模型+ESW+鳶尾素組＜模型+鳶尾素組＜模型+ESW組 ＜模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 五組動物股骨骨折標本骨密度和破骨細胞指數(shù)檢測結果（±s）與比較

表1 五組動物股骨骨折標本骨密度和破骨細胞指數(shù)檢測結果（±s）與比較

注：aP＜0.05 vs.假手術組；bP＜0.05 vs.模型組；cP＜0.05 vs.模型+ESW組；dP＜0.05 vs.模型+鳶尾素組

指標P值骨密度（m g/c m 2）破骨細胞指數(shù)（n/μ m 2）假手術組（n=1 6）8 2.9 3±5.1 8 3 5.7 2±3.1 5模型組（n=1 6）4 9.4 7±4.8 5 a 7 4.1 8±7.2 9 a模型+E S W組（n=1 6）6 0.2 1±5.2 7 b 6 4.0 6±5.7 6 b模型+鳶尾素組（n=1 6）5 9.6 2±5.4 6 b 5 9.7 2±5.0 4 b模型+E S W+鳶尾素組（n=1 6）7 7.9 4±7.0 4 cd 4 2.5 8±4.2 2 cd＜0.0 0 1＜0.0 0 1

2.2 MicroCT檢測

MicroCT檢測結果見表2。骨表面積骨體積比值（bone surface/bone volume,BS/BV）由高至低依次為，模型+ESW+鳶尾素＞模型+鳶尾素組＞模型+ESW組＞模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。骨小梁數(shù)（trabecular number,Tb.N）由高至低依次為，模型+ESW+鳶尾素組＞模型+鳶尾素組＞模型+ESW組＞模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。骨小梁厚度（trabecular thickness,Tb.Th）由高至低依次為，模型+ESW+鳶尾素組＞模型+ESW組＞模型+鳶尾素組＞模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。骨小梁分離度（trabecular separation,Tb.Sp）由低至高依次為，模型+ESW+鳶尾素＜模型+鳶尾素組＜模型+ESW組＜模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）

表2 五組動物股骨骨折中心樣本microCT檢測結果（±s）與比較

表2 五組動物股骨骨折中心樣本microCT檢測結果（±s）與比較

注：aP＜0.05 vs.假手術組；bP＜0.05 vs.模型組；cP＜0.05 vs.模型+ESW組；dP＜0.05 vs.模型+鳶尾素組

指標假手術組（n=1 6）P值B S/B V（%）T b.N（1/m m）T b.T h（μ m）T b.S p（μ m）- - - -模型組（n=1 6）3 7.1 5±2.1 4 0.1 2±0.0 1 0.1 1±0.0 1 5.0 2±0.6 5模型+E S W組（n=1 6）4 4.3 5±3.2 5 b 0.2 0±0.0 2 b 0.2 1±0.0 2 b 4.4 7±0.4 9 b模型+鳶尾素組（n=1 6）4 7.5 2±3.8 7 b 0.2 1±0.0 2 b 0.2 0±0.0 2 b 4.3 0±.0 4 7 b模型+E S W+鳶尾素組（n=1 6）5 1.7 4±4.0 2 c、d 0.2 7±0.3 0 c、d 0.2 7±0.3 0 c、d 3.4 5±0.3 6 c、d＜0.0 0 1＜0.0 0 1＜0.0 0 1＜0.0 0 1

2.3 Western blot檢測結果

Western blot檢測結果見圖1、表3。BMP2表達量由高至低依次為，模型+ESW+鳶尾素＞假手術組＞模型+鳶尾素組＞模型+ESW組＞模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。VEGF表達量由高至低依次為，模型+ESW+鳶尾素組＞假手術組＞模型+ESW組＞模型+鳶尾素組＞模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Nrf2F表達量由高至低依次為，假手術組＞模型+ESW+鳶尾素＞模型+鳶尾素組＞模型+ESW組＞模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。OH-1表達量由高至低依次為，假手術組＞模型+ESW+鳶尾素組＞模型+鳶尾素組＞模型+ESW組＞模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖1 Westernblot凝膠電泳圖 1a:BMP2和VEGF檢測凝膠電泳 1b:Nrf2和OH-1蛋白檢測凝膠電泳

表3 五組動物股骨骨折中心樣本W(wǎng)ester blot檢測結果（蛋白相對表達量，±s）與比較

表3 五組動物股骨骨折中心樣本W(wǎng)ester blot檢測結果（蛋白相對表達量，±s）與比較

注：aP＜0.05 vs.假手術組；bP＜0.05 vs.模型組；cP＜0.05 vs.模型+ESW組；dP＜0.05 vs.模型+鳶尾素組

指標P值B M P 2 V E G F N r f 2 O H-1假手術組（n=1 6）2.2 1±0.1 9 1.9 7±0.1 7 3.1 2±0.2 7 2.8 9±0.2 6模型組（n=1 6）0.3 4±0.0 3 a 0.5 2±0.0 5 a 0.4 9±0.0 4 a 0.4 2±0.0 4 a模型+E S W組（n=1 6）1.2 9±0.1 1 b 1.9 1±0.1 6 b 1.4 5±0.1 2 b 1.7 0±0.1 4 b模型+鳶尾素組（n=1 6）1.4 5±0.1 2 b 1.8 5±0.1 5 b 1.6 7±0.1 4 b 1.7 6±0.1 5 b模型+E S W+鳶尾素組（n=1 6）2.2 8±0.2 0 c、d 2.3 0±0.2 0 c、d 2.9 5±0.2 7 c、d 2.7 7±0.2 5 c、d＜0.0 0 1＜0.0 0 1＜0.0 0 1＜0.0 0 1

2.4 RT-qPCR檢測結果

RT-qPCR檢測結果見4。Nrf2 mRNA相對表達量由高至低依次為，假手術組＞模型+ESW+鳶尾素組＞模型+鳶尾素組＞模型+ESW組＞模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。OH-1 mRNA相對表達量由高至低依次為，假手術組＞模型+ESW+鳶尾素組＞模型+鳶尾素組＞模型+ESW組＞模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表4 五組動物股骨骨折中心樣本RT-qPCR檢測結果（mRNA相對表達量，±s）與比較

表4 五組動物股骨骨折中心樣本RT-qPCR檢測結果（mRNA相對表達量，±s）與比較

注：aP＜0.05 vs.假手術組；bP＜0.05 vs.模型組；cP＜0.05 vs.模型+ESW組；dP＜0.05 vs.模型+鳶尾素組

指標P值N r f 2 m R N A O H-1 m R N A假手術組（n=1 6）4.5 2±0.3 5 4.4 9±0.3 9模型組（n=1 6）0.8 5±0.0 8 a 0.8 1±0.0 8 a模型+E S W組（n=1 6）2.9 7±0.2 4 b 3.0 4±0.2 5 b模型+鳶尾素組（n=1 6）3.2 4±0.2 9 b 3.2 2±0.2 8 b模型+E S W+鳶尾素組（n=1 6）4.2 0±0.3 8 c、d 4.3 8±0.3 9 c、d＜0.0 0 1＜0.0 0 1

3 討論

絕經(jīng)婦女是骨質疏松癥的高危人群，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多預防絕經(jīng)后骨質疏松的可能方法，例如藥物治療、中藥、體育鍛煉、機械刺激和電刺激［10］。而非藥物方法包括鍛煉計劃和生物物理干預，ESW治療、磁場和低強度脈沖超聲是常見生物物理干預措施，而ESW也有助于提高骨質疏松合并骨折患者的療效［11］。但是，其具體療效和機制仍需要進一步研究。

ESW是一種攜帶能量并可以通過軟組織傳播的短時聲波，是一種經(jīng)濟有效的非侵入性治療方式，已廣泛用于各種疾病的臨床治療，主要包括腎結石、勃起功能障礙和肌肉骨骼疾?。?2］。最新研究顯示，ESW具有促進骨折愈合的作用［13］。鳶尾素是一種肌動蛋白，由骨骼肌分泌，鳶尾素最初被認為是脂肪組織褐變的活化劑，具有緩解肥胖癥和糖尿病的作用［14］。最新研究結果顯示鳶尾素可誘導骨形成，增加皮質骨的質量和強度，使破骨細胞減少，從而發(fā)揮增加骨量的作用［15］。本研究通過OVX誘導大鼠骨質疏松，并構建股骨FF模型，分析ESW和鳶尾素聯(lián)合使用對骨折愈合的影響。結果顯示，ESW和鳶尾素單獨干預均能夠提高骨密度，減少破骨細胞數(shù)目，并誘導骨痂生成促進骨折部位的愈合，并且ESW和鳶尾素聯(lián)合對骨密度和骨折愈合的促進作用更顯著。這提示對于骨質疏松骨折大鼠，鳶尾素和ESW二者能夠協(xié)同，共同作用加速骨再生和骨愈合。

為進一步分析ESW和鳶尾素聯(lián)合促進骨質疏松大鼠骨折愈合的機制，本研究檢測了骨痂組織中BMP2和VEGF蛋白的表達量，以及Nrf2、OH-1蛋白水平。研究顯示ESW對傷口愈合、血管生成、組織再生和骨骼重塑具有積極作用［16］。而BMP2蛋白是一種分泌蛋白，是促進軟骨和骨形成的關鍵蛋白，其水平升高提示骨再生，是骨折愈合的積極因子［17］。VEGF是促進血管生成的關鍵因子，有研究顯示 ESW 可通過誘導 VEGF促進血管生成［18］。VEGF受到Nrf2/HO-1通路的調控，Nrf2/HO-1通路會抑制氧化應激反應，發(fā)揮抑制破骨細胞的作用，并Nrf2/HO-1通路也會通過促進VEGF的表達促進血管生成，起到組織修復的作用［19，20］。本研究結果顯示，ESW和鳶尾素均可顯著促進BMP2和VEGF蛋白的表達，并提高Nrf2和OH-1的轉錄水平和蛋白表達量，二者聯(lián)合可進一步促進它們的表達水平。Yu等［21］的研究結果顯示，ESW可通過上調Nrf2/OH-1通路促進VEGF的表達，從而促進血管再生緩解缺血/再灌注損傷。研究發(fā)現(xiàn)，鳶尾素可通過激活Nrf2通路緩解氧化型低密度脂蛋白誘導的血管生成受損［22］。Kubo等［23］的研究也顯示鳶尾素具有促進Nrf2/OH-1通路的功能。提示在ESW的基礎上聯(lián)合鳶尾素干預可刺激Nrf2/OH-1通路上調，會促進VEGF蛋白的表達誘導血管生成，從而促進血液循環(huán)，加速骨痂形成，并提高BMP2的表達，不但提高骨密度促進了骨形成，進而促進骨折愈合。

綜上所述，鳶尾素聯(lián)合ESW可激活Nrf2/OH-1通路并促進VEGF和BMP2蛋白的表達，促進骨質疏松大鼠的骨折愈合。關于鳶尾素聯(lián)合ESW對骨質疏松骨折患者的治療效果值得進一步的臨床實驗證明，為治療骨質疏松骨折患者提供新思路。