一株結(jié)晶紫降解菌株的分離鑒定及生長(zhǎng)特性研究*

邵廣晴，肖旭倩，2

(1萬(wàn)博科技職業(yè)學(xué)院生物制藥與環(huán)境工程系 安徽合肥 230001；2中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物生物技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海南?？?571101)

結(jié)晶紫(crystal violet，CV)是一種人工合成的三苯甲烷類染料，作為一種生物著色劑具有色澤鮮艷，著色力高的特點(diǎn)而被廣泛用于紡織工業(yè)中[1]?，F(xiàn)研究表明其化學(xué)官能團(tuán)三苯甲烷化學(xué)穩(wěn)定性高、對(duì)動(dòng)物有致畸、致癌性的毒副作用，因此含有結(jié)晶紫的印染廢水排放到環(huán)境中，會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境污染[2-3]，同時(shí)危害人類的身體健康[4]。而常用的物理法、化學(xué)法如過(guò)濾、化學(xué)絮凝等來(lái)處理此類廢水的運(yùn)營(yíng)成本高、易產(chǎn)生二次污染等的問(wèn)題限制了其在工業(yè)中的應(yīng)用[5-6]。因此該染料在實(shí)際應(yīng)用中迫切需要廉價(jià)、環(huán)保、操作方便的染料去除技術(shù)。而微生物具有環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、遺傳變異較快、易進(jìn)化出對(duì)某類染料分解代謝的脫色能力且操作方便又環(huán)保的特點(diǎn)，所以微生物成為治理環(huán)境中三苯甲烷類染料污染最理想的“武器”[7]。同時(shí)微生物降解法還具有運(yùn)營(yíng)成本低、無(wú)污染、耗能少的優(yōu)勢(shì)而成為最具潛力的治理結(jié)晶紫染料廢水污染的方法[8]。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1分離來(lái)源 結(jié)晶紫染料降解菌的分離來(lái)源于某印染廠排水口附近土壤，所取土壤均長(zhǎng)期接觸印染廢水。

1.1.2培養(yǎng)基 ①富集培養(yǎng)基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，水1000mL，pH自然。固體培養(yǎng)基加入2.0%的瓊脂。②LB培養(yǎng)基：蛋白陳10.0g，酵母浸粉5g，NaCI 10g，水1000mL，pH=7.0～7.2。③無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(mineral salt medium)MSM：K2HPO4·H2O 1.5g，KH2PO40.5g，NaCI 0.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，NH4NO31.0g，水1000mL，pH=7.0～7.2。

1.1.3試劑 結(jié)晶紫染料(CV)溶液：配制成1 g/L的母液以備用。結(jié)晶紫試劑購(gòu)自上海滬試，Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、細(xì)菌通用16S rDNA引物、SanPrep柱式DNAJ膠回收試劑盒均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，pMD18-T Vector 連接試劑盒購(gòu)自Takara公司。

1.2方法

1.2.1降解菌的富集與分離 取適量土壤樣品，分別接種于預(yù)先經(jīng)121℃下，濕法滅菌20min的富集培養(yǎng)基中，并加入結(jié)晶紫染料，使其初始濃度達(dá)到10mg/L。在30℃，150rpm條件下振蕩培養(yǎng)，顏色消退時(shí)，轉(zhuǎn)接15%(15mL)到下一批次的新鮮培養(yǎng)液中，并逐次提高結(jié)晶紫染料的濃度，如此重復(fù)直至結(jié)晶紫染料濃度達(dá)到40mg/L。將培養(yǎng)物作梯度稀釋，涂布到結(jié)晶紫濃度為200mg/L的富集培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)24h，挑取周圍出現(xiàn)無(wú)色圈的單菌落反復(fù)畫線分離純化。

1.2.2降解菌株的形態(tài)和理化鑒定 降解菌株的形態(tài)觀察、生理生化特性試驗(yàn)參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[9]。

1.2.3降解菌株的分子生物學(xué)鑒定 采用Ezup 柱式細(xì)菌基因組 DNA 抽提試劑盒提取降解菌株總DN 為模板，細(xì)菌通用16S rDNA引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%凝膠電泳檢驗(yàn)。用回收試劑盒回收目標(biāo)條帶，將回收產(chǎn)物純化后與pMD18-T Vector連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5a，將轉(zhuǎn)化液涂布在含有相應(yīng)抗生素的LB平板上，37℃培養(yǎng)16～24h，挑取陽(yáng)性單菌落送上海生工生物工程有限公司測(cè)16S rDNA序列，根據(jù)測(cè)序結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4菌體生長(zhǎng)量的測(cè)定 取適量菌液于12 000g，離心10min，棄去上清液，以等量的生理鹽水重懸，適當(dāng)稀釋后采用721型分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)600 nm處的吸光值，用OD600nm來(lái)表示。

1.2.5降解菌脫色效率測(cè)定 取適量菌液于12 000 g，離心10min，小心吸取上清液，以結(jié)晶紫λmax=590nm處測(cè)其吸光度，用(A0-At)/A0×100%計(jì)算降解菌的脫色率。其中A0為初始時(shí)(t=0)菌液中CV吸光度值，At為降解時(shí)間t小時(shí)后菌液中CV吸光度值。

1.2.6降解菌生長(zhǎng)特性研究 在MSM無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別添加以下碳源：葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、淀粉、結(jié)晶紫(終濃度為100mg/L)，除結(jié)晶紫外其余碳源終濃度為0.5%(w/v或v/v)；在MSM無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別添加以下氮源：硝酸鈉、氯化銨、尿素、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉，使其終濃度為0.5%(w/v)；調(diào)節(jié)LB 培養(yǎng)基起始pH值使其分別為pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0；分別設(shè)置LB培養(yǎng)基裝液量25、50、75、100、125、150、175、200、225和250 mL幾個(gè)梯度；以上接種量均為1%，設(shè)三組重復(fù)，30℃、150rpm/min振蕩培養(yǎng)36 h后，測(cè)定菌液OD600值。分別設(shè)置溫度梯度10、20、30、37和42℃，其余培養(yǎng)條件和測(cè)定條件同上，設(shè)三組重復(fù)。

1.2.7生長(zhǎng)曲線繪制 將低溫保存的菌種接種至LB液體培養(yǎng)基中，30℃、150rpm/min振蕩培養(yǎng)16 h后作為種子液。在LB培養(yǎng)基中以1%體積接種菌株種子液后首先取一次樣保存于4℃冰箱作為對(duì)照，以30℃、150rpm/min培養(yǎng)至菌體生長(zhǎng)達(dá)到衰亡期為止，培養(yǎng)期間每隔2h取樣，每次取樣2mL，每組實(shí)驗(yàn)各設(shè)3個(gè)重復(fù)，所取樣品迅速放入4℃冰箱中保存，待取樣結(jié)束后，統(tǒng)一測(cè)定菌液OD600值。

1.2.8降解菌對(duì)不同濃度結(jié)晶紫的降解情況 在LB液體培養(yǎng)基中分別設(shè)置不同濃度的結(jié)晶紫染料：100、200、300、400、600mg/L，接種量為1 %，以1.2.6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為最佳培養(yǎng)條件，振蕩培養(yǎng)38h，期間每間隔一定時(shí)間取樣，所取樣品迅速放入4℃冰箱中保存，待取樣結(jié)束后，根據(jù)1.2.5的方法測(cè)定降解菌對(duì)不同濃度結(jié)晶紫的降解情況。

2結(jié)果與分析

2.1結(jié)晶紫降解菌株的分離篩選

從某印染廠排水口取土壤經(jīng)富集與馴化后，在含有200mg/L結(jié)晶紫的LB平板上反復(fù)劃線分離純化到一株結(jié)晶紫降解菌，命名C-2。

2.2 降解菌株C-2的生理生化特征

結(jié)晶紫降解菌株C-2在含結(jié)晶紫的LB平板上劃線培養(yǎng)16h后，菌落周圍的培養(yǎng)基的結(jié)晶紫顏色明顯變淺甚至褪色，單菌落呈乳白色、圓形、不透明、表面光滑、濕潤(rùn)、粘稠、中間突出、邊緣整齊，見(jiàn)圖1。運(yùn)動(dòng)型實(shí)驗(yàn)表明菌株有一定運(yùn)動(dòng)性，在厭氧環(huán)境生長(zhǎng)良好；革蘭氏染色結(jié)果為紅色(圖1)，屬于革蘭氏陰性細(xì)菌；經(jīng)電鏡掃描，菌體大小為1～2μm×0.5～0.8μm，呈短桿狀，兩端稍圓，近端著生鞭毛，見(jiàn)圖2。

圖1 菌落形態(tài)和革蘭氏染色圖

圖2 電鏡掃描圖

結(jié)晶紫降解菌株C-2的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明：菌株的接觸酶和O-硝基苯-β-D吡喃半乳糖苷酶反應(yīng)為陽(yáng)性，在有氧和缺氧情況下也能正常生長(zhǎng)，屬于兼性厭氧菌；脲酶、氧化酶、精氨酸雙水解酶及吲哚反應(yīng)為陰性，不能水解淀粉和明膠，不能發(fā)酵纖維素二糖。

表1 生理生化系列試驗(yàn)結(jié)果

2.3降解菌株C-2的分子生物學(xué)鑒定

以細(xì)菌總DNA為模板，采用細(xì)菌通用16SrDNA引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物用1%凝膠電泳檢驗(yàn)，出現(xiàn)約1400bp的目標(biāo)片段，經(jīng)回收連接轉(zhuǎn)化篩選后，將陽(yáng)性克隆送測(cè)獲得1414bp的16SrDNA序列，詳見(jiàn)圖3。將測(cè)序結(jié)果提交GenBank獲得登錄號(hào)MN117675，將該序列與GenBank中的其他16SrDNA基因序列進(jìn)行BLAST相似性比較后發(fā)現(xiàn)與Serratia liquefaciens(液化沙雷氏菌屬)的相似性為99.6%，構(gòu)建降解菌株C-2的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖4，結(jié)晶紫降解菌C-2與沙雷氏菌屬歸到一起。結(jié)合其形態(tài)特征和生理生化系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將結(jié)晶紫降解菌C-2歸屬到液化沙雷氏菌屬Serratia liquefaciens。

1.菌株C-2； M.DL10000 DNA marker圖3 PCR產(chǎn)物電泳圖

圖4 降解菌株C-2的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4降解菌生長(zhǎng)特性

2.4.1不同碳源、氮源對(duì)降解菌C-2的影響 MSM培養(yǎng)基中分別添加不同碳源和氮源，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：降解菌在無(wú)碳源或無(wú)氮源時(shí)均不能正常生長(zhǎng)；能夠較好利用葡萄糖、蔗糖和果糖而不能利用結(jié)晶紫、乳糖、淀粉作為唯一碳源生長(zhǎng)；能利用牛肉膏、尿素、氯化銨、蛋白胨及酵母粉作為氮源進(jìn)行生長(zhǎng)，其中以牛肉膏作為氮源的生長(zhǎng)情況明顯優(yōu)于其余氮源，這可能與牛肉膏含有維生素等復(fù)雜成分從而利于微生物的生長(zhǎng)相關(guān)。因此蔗糖和牛肉膏分別為最適碳源和氮源。詳見(jiàn)圖5、圖6。

1.無(wú)碳源；2.結(jié)晶紫；3.乳糖；4.淀粉；5.葡萄糖；6.蔗糖；7.果糖

1.無(wú)氮源；2.硝酸鈉；3.氯化銨；4.尿素；5.牛肉膏；6.蛋白胨；7.酵母粉

2.4.2不同溫度、pH值對(duì)降解菌C-2的影響 溫度和培養(yǎng)液初始 pH 值對(duì)降解菌C-2的影響如圖7所示。在20～37℃可以生長(zhǎng)，其中30℃培養(yǎng)后菌體OD600可達(dá)到0.907，明顯高于其他溫度下菌體的OD600值，是該菌的最適溫度；在10～20℃和42℃時(shí)降解菌仍有微弱的生長(zhǎng)，可能是過(guò)低和過(guò)高環(huán)境溫度降低了菌體內(nèi)酶的生物活性引起菌體生長(zhǎng)緩慢，這說(shuō)明溫度對(duì)降解菌C-2的影響較大，但可生長(zhǎng)的溫度范圍較寬，適應(yīng)性強(qiáng)。在pH3.0～5.0和12.0時(shí)菌體生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制；在pH6.0～11.0之間降解菌C-2均能較好生長(zhǎng)，這表明降解菌C-2的可生長(zhǎng)pH值的范圍較寬，其中pH為7.0時(shí)菌體生長(zhǎng)較旺盛，OD600可達(dá)到0.910，是降解菌C-2的最適pH值。

圖7 溫度和初始pH值對(duì)C-2生長(zhǎng)的影響

2.4.5轉(zhuǎn)速和裝液量對(duì)降解菌C-2的影響 如圖8所示，降解菌在靜止時(shí)可以緩慢生長(zhǎng)，隨著轉(zhuǎn)速增加，培養(yǎng)液內(nèi)外氧氣交換加快，菌體的生長(zhǎng)量也相應(yīng)增加，但轉(zhuǎn)速高于150rpm/min時(shí)，菌體生長(zhǎng)增加趨勢(shì)不明顯；隨著裝液量增加，菌體生長(zhǎng)也增加，當(dāng)裝液量高于125mL時(shí)菌體生長(zhǎng)增量不明顯。因此降解菌C-2的培養(yǎng)基裝液量為125mL、轉(zhuǎn)速為150rpm/min較適宜。

圖8 轉(zhuǎn)速和裝液量對(duì)C-2生長(zhǎng)的影響

2.5生長(zhǎng)曲線繪制

降解菌C-2在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況如圖9所示。在前2h菌體生長(zhǎng)緩慢，處于適應(yīng)期，從第3h開(kāi)始菌體迅速生長(zhǎng)，處于對(duì)數(shù)期，12-38 h處于穩(wěn)定期，38h后逐漸進(jìn)入衰亡期。降解菌C-2的生長(zhǎng)適應(yīng)期較短，適應(yīng)環(huán)境后菌體快速增殖從而迅速進(jìn)入穩(wěn)定期。

圖9 降解菌株C-2的生長(zhǎng)曲線

2.6降解菌對(duì)不同濃度結(jié)晶紫的降解情況

降解菌C-2在結(jié)晶紫濃度為100、200、300、400mg/L時(shí)均能較好的降解該染料，如圖10所示。在濃度100mg/L時(shí)，僅14h后結(jié)晶紫降解率達(dá)88.98%，這說(shuō)明降解菌對(duì)該濃度的結(jié)晶紫適應(yīng)性較強(qiáng)，菌體量迅速增加促進(jìn)了染料的生物降解。隨著結(jié)晶紫濃度增加，染料對(duì)降解菌的生長(zhǎng)影響變大，菌體適應(yīng)期延長(zhǎng)，降解的速度放慢，但降解效率較高。在濃度600mg/L時(shí)，降解率在低水平上略有增加，在第20h降解率突然增加，可能是降解菌在高濃度的染料下生長(zhǎng)雖受到嚴(yán)重抑制，但仍能微弱生長(zhǎng)，增加的菌體量使結(jié)晶紫被生物降解和被細(xì)胞吸附；之后降解率回落至更低水平且無(wú)大的變化，推測(cè)是染料和染料中間代謝產(chǎn)物的毒性較強(qiáng)，使菌體迅速死亡，導(dǎo)致被吸附在細(xì)胞表面的結(jié)晶紫和菌體內(nèi)的大部分結(jié)晶紫被重新釋放，具體原因還需進(jìn)一步研究。

圖10 結(jié)晶紫初始質(zhì)量濃度對(duì)C-2降解結(jié)晶紫的影響

3討論

該研究從某印染廠排水口附近土壤分離到一株結(jié)晶紫降解菌C-2，經(jīng)鑒定屬于液化沙雷氏菌屬Serratia liquefaciens。該細(xì)菌能在較寬的pH值范圍和溫度范圍內(nèi)良好生長(zhǎng)，對(duì)高濃度結(jié)晶紫染料有較強(qiáng)的適應(yīng)能力和降解能力。生物法去除廢水染料的關(guān)鍵是高效降解脫色微生物的分離純化，該菌對(duì)濃度高達(dá)400mg/L的結(jié)晶紫染料38h后降解率高達(dá)84.34%。這不僅顯示該菌的高效降解性能，更是補(bǔ)充了沙雷氏菌屬降解結(jié)晶紫染料的報(bào)道，擴(kuò)大了可降解結(jié)晶紫染料微生物的范圍，為后期的深入研究結(jié)晶紫生物降解機(jī)理和進(jìn)一步探索能降解結(jié)晶紫染料不同微生物間的代謝途徑和規(guī)律奠定了良好的基礎(chǔ)