基于葉綠體DNA序列atpI-rsp2和psbC-trnS 的山藥種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

張靜珍 張文英 雷劍 柴沙沙 靳曉杰 王崇 楊園園 程賢亮 楊新筍 王連軍

摘要：【目的】基于葉綠體DNA（cpDNA）序列atpI-rsp2和psbC-trnS分析山藥種質(zhì)資源的遺傳多樣性，為山藥種質(zhì)資源鑒定、創(chuàng)新利用及新品種選育提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳詠碜?4個(gè)?。▍^(qū)）的64份山藥種質(zhì)為材料，對其atpI-rsp2和psbC-trnS序列進(jìn)行多態(tài)性擴(kuò)增并測序，經(jīng)拼接、比對后，利用MEGA 7.0計(jì)算種質(zhì)間的遺傳距離并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，并利用DNAsp 5.0分析核苷酸多態(tài)性，采用NET Framework 4.6.1繪制單倍型間的中介鄰接網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)?！窘Y(jié)果】atpI-rsp2和psbC-trnS序列合并序列長度為1938 bp，共有117個(gè)插入/缺失位點(diǎn)（IS）和14個(gè)變異位點(diǎn)（Vs），轉(zhuǎn)換率（Si）為49.1%，總體轉(zhuǎn)換/顛換偏倚率（R）為0.928，共產(chǎn)生30種單倍型，其中有21種為獨(dú)享單倍型，9種為共享單倍型，單倍型多樣性（Hd）和核苷酸多樣性（p）分別為0.9206和0.00139。atpI-rsp2序列和psbC-trnS序列及合并序列的Tajima’s D、Fu and Li’s D*和F*均為負(fù)值，其差異均未達(dá)顯著水平（P>0.10），說明這2個(gè)序列在進(jìn)化上符合中性進(jìn)化模式。64份山藥種質(zhì)的遺傳距離為0～0.003865，平均遺傳距離均為0.001400。中介鄰接網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，30種單倍型可分為3類，其中，H5為較原始單倍型?！窘Y(jié)論】64份山藥種質(zhì)資源的遺傳距離較近，遺傳背景相似，可能是由于長期地區(qū)間引種導(dǎo)致，與地理距離不完全相關(guān)。atpI-rsp2和psbC-trnS序列可用于山藥物種鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化分析等研究領(lǐng)域。

關(guān)鍵詞： 山藥;葉綠體DNA（cpDNA）;atpI-rsp2;psbC-trnS;遺傳多樣性;遺傳分化

中圖分類號： S632.102.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2022）01-0125-09

Genetic diversity of yam germplasm revealed by chloroplast DNA sequences atpI-rsp2 and psbC-trnS

ZHANG Jing-zhen1，2， ZHANG Wen-ying2，LEI Jian1， CHAI Sha-sha1， JIN Xiao-jie1，

WANG Chong1，2， YANG Yuan-yuan1， CHENG Xian-liang1，

YANG Xin-sun1*， WANG Lian-jun1*

（1Hubei Sweet Potato Engineering and Technology Research Centre， Institute of Food Corps， Hubei Academy of Agricultural Sciences/Hubei Key Laboratory of Food Crops Germplasm and Genetic Improvement，

Wuhan? 430064， China; 2College of Agriculture，Yangtze University， Jingzhou? 434025， China）

Abstract：【Objective】The genetic diversity of 64 yam germplasm was analyzed based on the chloroplast DNA（cp-DNA） sequences atpI-rsp2 and psbC-trnS to provide a theoretical basis for the selection， innovative utilization and bree-ding of yam germplasm resources. 【Method】The atpI-rsp2 and psbC-trnS sequences of 64 yam germplasm collected from 14 provinces（regions） were amplified and sequenced for polymorphism. After mosaic and comparison， the genetic distance between germplasms was calculated by MEGA 7.0 and a phylogenetic tree was constructed. The nucleotide polymorphisms were analyzed by DNAsp 5.0 and NET Framework 4.6.1 was used to draw the intermediate adjacency network structure between haplotypes. 【Result】The combined sequence length of atpI-rsp2 and psbC-trnS was 1938 bp， with contained 117 insert/missing sites（IS） and 14 variable sites（Vs）. The conversion frequency（Si） was 49.1%， and the overall transition/transversion bias（R） value was 0.928， resulting in 30 haplotypes. Of these， 21 haplotypes were exclusive and 9 haplotypes were shared， corresponding to a haplotype diversity index value（Hd） of 0.92063 and nucleotide diversity value（p） of 0.00139. The Tajima’s D values， Fu and Li’s D * and F * of the? atpI-rsp2 sequence and the psbC-trnS sequence and the merged sequences were all negative， and the difference was not significant（P>0.10）， suggesting the sequences in yams fitted the neutral evolutionary model. The genetic distance of 64 yam germplasm ranged from 0 to 0.003865 with an average of 0.001400. The results of the structure analysis of the intermediate adjacency network showed that the 30 haplotypes could be divided into three types，? H5 was the primitive haplotype. 【Conclusion】The 64 yam germplasm resources have close genetic distance and similar genetic background， which may be caused by long-term interregional introduction. It is not entirely correlated with geographical distance. atpI-rsp2 and psbC-trnS sequences can be used for species identification and the phylogenetic analysis of yam.

Key words： yam; chloroplast DNA（cpDNA）; atpI-rsp2; psbC-trnS; genetic diversity; genetic differentiation

Foundation items： Hubei Agricultural Science and Technology Innovation Center Funding Project（2020-620-000-001-007）; Characteristic Discipline Project of Hubei Academy of Agricultural Sciences（2021）

0 引言

【研究意義】山藥（Dioscorea spp.）是百合目（Li-liales）薯蕷科（Dioscoreaceace）薯蕷屬（Dioscorea）一年生或多年生纏繞性藤本植物，可藥食兩用（雷伏貴，2011），主要分布于我國亞熱帶地區(qū)，具有豐富的山藥種質(zhì)資源。近年來，由于人類長期引種馴化、歷史變遷等因素，使山藥種質(zhì)資源遺傳背景復(fù)雜，難以從形態(tài)學(xué)角度進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定和分類（雷伏貴，2011）。DNA序列分析是植物鑒定和分類的重要方法，可在較短時(shí)間內(nèi)為傳統(tǒng)園藝學(xué)分類及物種鑒定提供依據(jù)。植物葉綠體DNA（Chloroplast DNA，cpDNA）為雙鏈共價(jià)閉合環(huán)狀分子，其分子量小，約120～210 kb，母系遺傳，結(jié)構(gòu)簡單，其非編碼區(qū)序列進(jìn)化速率比編碼區(qū)（CDS）快，適用于低分類類群和種內(nèi)的系統(tǒng)學(xué)研究（高麗楊等，2017）。常用的cpDNA序列有rbcL、matK、trnL-trnF和trnH-psbA等?；赾pDNA分子水平對山藥種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，對于山藥種質(zhì)資源開發(fā)、保護(hù)和鑒定具有重要研究意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，葉綠體DNA非編碼區(qū)域已廣泛應(yīng)用于木材樹種（張蓉等，2014）、黑藻（付春霖等，2017）、梨（齊丹等，2018）、何首烏（張宏意等，2018）、楸子（高源等，2020）等植物的遺傳多樣性研究。張蓉等（2014）基于木材樹種的cpDNA序列trnL、trnL-trnF、trnH-trnK和psbC-trnS構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些序列對木材樹種鑒定成功率較高。馬雙姣等（2017）利用高通量測序技術(shù)對薯蕷（D. opposita）和叉蕊薯蕷（D. collettii）cpDNA序列進(jìn)行測序分析，經(jīng)過多序列比對發(fā)現(xiàn)薯蕷屬葉綠體基因組中非編碼區(qū)序列變異高于保守的編碼區(qū)，從中篩選出5個(gè)蛋白編碼基因和5個(gè)基因間隔區(qū)作為鑒定薯蕷屬植物的特異性DNA條形碼序列，但這些DNA條形碼在薯蕷屬物種中的鑒定效率需大量種質(zhì)資源進(jìn)行驗(yàn)證分析，且對葉綠體全基因組進(jìn)行比對能更加全面地反映薯蕷屬物種的序列變異情況，可為葉綠體基因組序列中篩選特異性DNA條形碼鑒定序列提供參考。付春霖等（2017）對黑藻cpDNA分子標(biāo)記進(jìn)行篩選并研究其遺傳多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黑藻居群遺傳差異的主要影響因子為生境差異和地理隔離。齊丹等（2018）利用5個(gè)葉綠體非編碼區(qū)序列trnL-trnF-1、trnL-trnF-2、trnS-psbC、accD-psaI、rps16-trnQ和1個(gè)基因區(qū)域rbcL對我國秦嶺淮河以南地區(qū)的188份梨種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣化及演化分析，根據(jù)cpDNA序列變異信息可推測秦嶺淮河以南地區(qū)的砂梨和白梨親緣關(guān)系較近，同時(shí)來自湖南地區(qū)的砂梨種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性。張宏意等（2018）利用psbA-trnH序列對7個(gè)?。▍^(qū)）15個(gè)居群共116份何首烏種質(zhì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測序分析，并分析cpDNA序列信息，結(jié)果顯示何首烏的遺傳變異豐富，聚類結(jié)果和種質(zhì)產(chǎn)地分布較一致，且不同產(chǎn)地的何首烏psbA-trnH序列遺傳變異較顯著，為何首烏種源分子鑒定提供理論依據(jù)。高源等（2020）利用cpDNA序列trnH-psbA、trnS-trnG spacer+intron、trnT-5′trnL和5′trnL-trnF對楸子種質(zhì)遺傳多樣性進(jìn)行研究，結(jié)果表明楸子的遺傳變異主要存在于群體內(nèi)部，與地理距離不完全相關(guān)。【本研究切入點(diǎn)】我國具有豐富的山藥種質(zhì)資源，但對其分類鑒定尚缺乏可靠的分子依據(jù)。目前鮮見基于cpDNA序列對我國山藥種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以64份山藥種質(zhì)資源為研究對象，基于前人（馬雙姣等，2017;沈奇等，2019）研究結(jié)果篩選適宜的cpDNA基因間隔區(qū)序列atpI-rsp2和psbC-trnS，對其進(jìn)行擴(kuò)增及測序，并分析山藥種質(zhì)的親緣關(guān)系及遺傳多樣性，為我國山藥種質(zhì)資源系統(tǒng)進(jìn)化、種質(zhì)資源保護(hù)及育種親本選擇提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試的64份山藥種質(zhì)資源為河南省焦作市溫縣山藥種質(zhì)資源圃（表1）。Easy Taq DNA聚合酶、10×Easy Taq Buffer for PAGE、dNTPs等均購自武漢全式金生物技術(shù)有限公司。主要儀器設(shè)備：離心機(jī)（Eppendorf，德國）、凝膠成像儀（Bio-Rad，美國）、NanoDrop2000分光光度計(jì)（Thermo，美國）和PCR儀（Bio-Rad，美國）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 DNA提取 采用改良的CTAB法提取山藥幼嫩葉片的DNA（張安世等，2009）。使用NanoDrop2000分光光度計(jì)測量DNA濃度，將山藥種質(zhì)DNA溶液稀釋至50～60 ng/μL，取2 μL稀釋后的DNA用1.0%瓊脂糖凝膠電泳（恒定電壓120 V，20 min）進(jìn)行檢測。

1. 2. 2 PCR擴(kuò)增 參照馬雙姣等（2017）設(shè)計(jì)的特異引物，用于山藥cpDNA的PCR擴(kuò)增和測序。根據(jù)擴(kuò)增條帶的清晰度、穩(wěn)定性及多態(tài)性共篩選出2對cpDNA非編碼區(qū)序列（atpI-rsp2和psbC-trnS）引物，如表2所示。反應(yīng)體系25.0 μL：2.5 μL 10×Buffer，10 mmol/L dNTPs 2.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，5 U/mL Taq DNA聚合酶0.5 μL，50 ng/μL DNA模板1.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至25.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，52 ℃（或54 ℃） 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min;4 ℃保存。取2.0 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳（恒定電壓120 V，20 min）進(jìn)行檢測，將PCR產(chǎn)物送至由天一輝遠(yuǎn)（武漢）生物科技有限公司進(jìn)行正、反雙向測序。

1. 2. 3 序列特征分析 利用DNAMAN 7.0對雙向測序成功的序列進(jìn)行比對，并去除兩端的不可靠的側(cè)翼序列，再生成用于MEGA 7.0和DNAsp 5.0分析的FASTA數(shù)據(jù)格式。利用DNAsp 5.0計(jì)算插入/缺失位點(diǎn)[Insertion/deletion（Indel），Is）]和突變位點(diǎn)數(shù)目，包括單一突變位點(diǎn)（Singleton variable site，Ss），簡約信息位點(diǎn)（Parsimony informative site，Ps）。利用MEGA 7.0對對位排列后的序列進(jìn)行序列長度、變異位點(diǎn)（Variable site，Vs）、顛換率（Transversion ratio，Sv）、轉(zhuǎn)換率（Transition ratio，Si）、總體轉(zhuǎn)換/顛換偏倚率（R）（Si/Sv）和GC含量等序列特分析。

1. 2. 4 倍性多態(tài)性分析 利用DNAsp 5.0計(jì)算單倍型數(shù)目（Number of haplotype，h）、單倍型多態(tài)性（Haplotype diversity，Hd），核苷酸多樣性（Nucleotide diversity，p）和平均核苷酸差異（Average number of nucleotide difference，k），并計(jì)算Tajima’s D、Fu and Li’s D*和Fu and Li’s F*進(jìn)行中性檢驗(yàn)（Neutrality tests）。

1. 2. 5 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹及單倍型間的進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 根據(jù)比對結(jié)果，利用MEGA 7.0中的Kimura-2-parameter（K2P）模型計(jì)算遺傳距離，以最大似然法（ML）構(gòu)建64份山藥種質(zhì)的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，以鄰接法（NJ）構(gòu)建單倍型系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，對分支的可靠性使用Bootstrap（1000次重復(fù)）進(jìn)行評價(jià)分析（Kumar et al.，2016）。自展數(shù)值>75%表示支持率高，50%～74%表示弱支持率，<50%表示不支持（朱元娣等，2014）。采用NET Framework 4.6.2以最大簡約法繪制單倍型間的中介鄰接網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（Polzin and Daneshmand，2003）。

2 結(jié)果分析

2. 1 序列特征分析

利用cpDNA序列atpI-rsp2和psbC-trnS的擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增及其產(chǎn)物電泳檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2條清晰的目的條帶，大小分別約600和1300 bp（圖1）。根據(jù)這2個(gè)片段的雙向測序結(jié)果，去除兩端的不可靠的側(cè)翼序列后，分別獲得了589和1349 bp的片段序列（表3）。atpI-rsp2序列的GC含量為30.44%～31.15%，AT含量為67.85%～69.67%;psbC-trnS序列的GC含量為44.02%～44.28%;AT含量為55.72%～55.98%。

atpI-rsp2序列的保守位點(diǎn)為469個(gè)，變異位點(diǎn)（Vs）共9個(gè)，約占擴(kuò)增位點(diǎn)總數(shù)的1.52%，其中包括7個(gè)簡約信息位點(diǎn)（Ps）和2個(gè)單一突變位點(diǎn)（Ss），插入/缺失位點(diǎn)（Is）111個(gè)，轉(zhuǎn)換率（Si）為42.9%，顛換率（Sv）為57.1%，總體轉(zhuǎn)換/顛換偏倚率（R）為0.736;psbC-trnS序列的多態(tài)性較低，有2個(gè)單一突變位點(diǎn)（Ss），3個(gè)簡約信息位點(diǎn)（Ps），6個(gè)插入/缺失位點(diǎn)（Is），轉(zhuǎn)換率（Si）80.5%，而顛換率（Sv）僅占19.5%，均為C與T之間的轉(zhuǎn)換，總體轉(zhuǎn)換/顛換偏倚率（R）為4.066。

atpI-rsp2和psbC-trnS合并后對位排列長度為1938 bp，GC含量為39.05%～41.03%，共有131個(gè)突變位點(diǎn)，其中包括14個(gè)變異位點(diǎn)（Vs）和117個(gè)插入/缺失位點(diǎn)（Is）（表3）。合并序列的10個(gè)簡約信息位點(diǎn)（Ps）分別出現(xiàn)在142、269、475、486、510、551、555、642、841和1069位點(diǎn);4個(gè)單一突變位點(diǎn)（Ss）分別出現(xiàn)在500、553、637和1931位點(diǎn)，7個(gè)插入/缺失片段分別在271～397、457～458、1885、1893、1903～1904、1928和1935，共117個(gè)位點(diǎn);轉(zhuǎn)換率（Si）為49.1%，總體轉(zhuǎn)換/顛換偏倚率（R）為0.928。

2. 2 倍性多態(tài)性分析及中性檢驗(yàn)

分別對atpI-rsp2序列和psbC-trnS序列進(jìn)行單倍型多樣性分析，結(jié)果（表4）表明，在64份山藥種質(zhì)中，atpI-rsp2和psbC-trnS序列的單倍型數(shù)（h）分別為16和13個(gè)，atpI-rsp2序列的單倍型多樣性（Hd）和核苷酸多樣性（p）較高，分別為0.8517和0.00441;合并序列的單倍型（h）為30種，即H1～H30（表5），單倍型多樣性（Hd）和核苷酸多樣性（p）分別為0.9206和0.00139。atpI-rsp2和psbC-trnS序列及二者合并序列的平均核苷酸差異（k）分別為2.110、0.469和2.526。

為檢驗(yàn)山藥居群是否發(fā)生擴(kuò)張，對atpI-rsp2和psbC-trnS序列進(jìn)行中性檢驗(yàn)，結(jié)果（表4）顯示，atpI-rsp2序列和psbC-trnS序列及二者合并序列的Tajima’s D、Fu and Li’s D*和F*均為負(fù)值，且差異均未達(dá)顯著水平（P>0.10），符合中性進(jìn)化模式，表明從物種水平上山藥atpI-rsp2序列和psbC-trnS序列及合并序列符合中性進(jìn)化假設(shè)。

2. 3 聚類分析結(jié)果

采用MEGA 7.0中的K2P模型計(jì)算山藥不同種質(zhì)間cpDNA序列的遺傳距離，結(jié)果顯示，山藥種質(zhì)間遺傳距離為0～0.003865，平均遺傳距離為0.001400，其中，沁陽太谷山藥、芹峰淮山藥和安砂小葉薯3個(gè)種質(zhì)與紫玉淮山藥遺傳距離最大，均為0.003865，與臺灣紫山藥遺傳距離次之，均為0.003864。

為了解64份供試山藥種質(zhì)的群體遺傳結(jié)構(gòu)，利用ML構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果如圖2所示。64份山藥種質(zhì)可分為八大類，其中，河北的白山藥和日本的白山藥聚在第Ⅱ類中，山西的太谷山藥和太谷縣南陽村山藥聚類在第Ⅴ類中，推測上述種質(zhì)存在同物異名的現(xiàn)象，或存在地區(qū)間引種現(xiàn)象;第VII類中的種質(zhì)大部分來自江蘇、福建和江西等地，其中，蘇蕷4號和蘇蕷6號紫山藥由江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所選育，福建省三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育的明淮1號、明淮3號、陽明山山藥及臺灣的紫玉淮山藥均為紫山藥，上述6個(gè)種質(zhì)聚在一個(gè)小分支，表明其親緣關(guān)系較近;第Ⅷ類中的種質(zhì)主要來自河南、山西和山東，其中，山東鐵棍和河南鐵棍山藥聚在一個(gè)小分支，推測山東鐵棍為河南鐵棍山藥的引種，為同一種質(zhì)。

從已獲得的64條序列中定義了30種單倍型（H1～H30），單倍型比對后變異位點(diǎn)如表6所示。其中，H5為共享單倍型，在所有種質(zhì)中出現(xiàn)了16次，占25.0%，單倍型H6出現(xiàn)了6次（9.3%），H7出現(xiàn)了5次（7.8%）。在30種單倍型中，有21種單倍型為獨(dú)享單倍型。由單倍型系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖3）可看出，分支上顯示的置信度較低，H14和H15單倍型的置信度僅為9，說明單倍型差異較小，不能形成可靠分支。

2. 4 山藥cpDNA單倍型中介網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

根據(jù)中介鄰介網(wǎng)絡(luò)（MJ）算法和最大簡約算法（MP）優(yōu)化計(jì)算結(jié)果并分析2個(gè)cpDNA序列組合的單倍型關(guān)聯(lián)圖（圖4）。單倍型的中介矢量位點(diǎn)分別用H和mv表示，其中mv代表可能出現(xiàn)的原始單倍型。分析結(jié)果顯示，單倍型H5和H7為古老單倍型，H4和H21為較進(jìn)化單倍型;單倍型H5、H7、H10、H15、H19、H25、H20和H27與mv1～mv6位于軀干位置上，分化時(shí)間早，其中單倍型H5和H7在序列上表現(xiàn)為3個(gè)堿基差異。山藥單倍型可分成3種類型：Type A（在atpI-rsp2中存在長度為109 bp的缺失）、Type B（在psbC-trnS片段缺失）和Type C（在atpI-rsp2片段缺失的）。其中，Type A包括5個(gè)單倍型H4、H11、H12、H13和H23，由mv4延伸出來。Type B包括18個(gè)單倍型，可分為3個(gè)組（B1～B3），B1組包括單倍型H1、H2、H6、H21、H24和H25，均由H5單倍型派生出來;B2組包括單倍型H20、H27、H29和H30，由mv6延伸出來;B3組包括單倍型H7、H9、H10、H14、H19和H28，由mv5延伸出來;Type C包括3組（C1～C3），C1組包括單倍型H17和H18，由mv1延伸出來，C2組包括單倍型H3、H8、H15和H16，由mv2和mv4延伸出來;C3組包括H22和H26，由mv2延伸出來，為獨(dú)有單倍型。

3 討論

目前對山藥種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定及保護(hù)是山藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。隨著地區(qū)間互相引種，導(dǎo)致同物異名等現(xiàn)象日益突出，通過形態(tài)特征鑒定種質(zhì)的差異難度增大。程月琴等（2019）利用cpDNA序列trnQ-rps16和psbM-trnD對20個(gè)懷山藥品種及其他20個(gè)山藥品種進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，懷山藥在trnQ-rps16序列出現(xiàn)了長度為210 bp的缺失，說明該序列可有效區(qū)分懷山藥和其他山藥品種。本研究也發(fā)現(xiàn)，懷山藥為獨(dú)有單倍型（H14），在序列上存在3個(gè)堿基差異，可有效區(qū)分于其他種質(zhì)。本研究通過atpI-rsp2和psbC-trnS序列分析發(fā)現(xiàn)，64份山藥種質(zhì)的遺傳距離為0～0.003865，表明種質(zhì)間遺傳距離較近，遺傳背景相似，與地理距離不完全相關(guān)，可能是由于長期地區(qū)間引種所導(dǎo)致。太谷山藥原產(chǎn)于山西，鐵棍山藥原產(chǎn)于河南溫縣，形態(tài)相似，兩者存在109 bp的堿基缺失（270～379 bp）和3個(gè)堿基差異，遺傳距離為0.0011，說明太谷山藥和鐵棍山藥間存在明顯的遺傳變異，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，為鑒別山藥種質(zhì)提供依據(jù)，與吳志剛（2012）利用cpDNA序列rbcL序列對14份山藥種質(zhì)的分析結(jié)果相似，14份山藥種質(zhì)的平均遺傳距離為0.0044，太谷山藥和鐵棍山藥存在11處堿基差異，說明atpI-rsp2和psbC-trnS序列可有效鑒定山藥品種。

本研究利用篩選出cpDNA非編碼區(qū)序列atpI-rsp2和psbC-trnS對來自不同地區(qū)64份山藥種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示，在64份山藥種質(zhì)中共發(fā)現(xiàn)131個(gè)突變位點(diǎn)，在整個(gè)區(qū)段均有分布，共產(chǎn)生了30種單倍型，具有較高的單倍型多樣性，其單倍型數(shù)量高于李亞屬物種（章秋平等，2017）和茶樹（劉振等，2020）的單倍型數(shù)量，可能是由于山藥種質(zhì)具有更強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力。由于H5單倍型分布最廣泛，推測這種單倍型是山藥植株適應(yīng)環(huán)境變化并在居群中穩(wěn)定存在的優(yōu)勢單倍型。在30種單倍型中，有9種為共享單倍型，有21種單倍型是獨(dú)享單倍型，其中，來自河南的山藥種質(zhì)的單倍型數(shù)量最多，共14種單倍型，表明該地區(qū)山藥種質(zhì)資源較豐富，對不同環(huán)境具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，這可能與物種特點(diǎn)、生態(tài)環(huán)境變化和栽培習(xí)性有關(guān)。

64份山藥種質(zhì)的30種單倍型中，有8種單倍型H5、H7、H10、H15、H19、H25、H20和H27與mv1～mv6位于軀干位置上，其中，單倍型H5包含了來自9個(gè)地區(qū)的16個(gè)種質(zhì)，是所有單倍型中種質(zhì)數(shù)量最多，來源最廣泛的類型。若單倍型在種群或居群中覆蓋范圍最廣、出現(xiàn)頻率最高，并處于單倍型網(wǎng)絡(luò)的中心位置，故推測這種單倍型是所有單倍型中最古老的類型（Posada and Crandall，2001），以H5為中心呈星狀輻射，說明其發(fā)生種群擴(kuò)張?？梢姡狙芯炕赾p-DNA非編碼區(qū)序列atpI-rsp2和psbC-trnS對山藥種質(zhì)遺傳多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了大量的變異位點(diǎn)，獲得了較全面的遺傳信息。由于不同來源的山藥群體之間的遺傳關(guān)系和遺傳分化不完全與地理距離相關(guān)的情況，可能與群體數(shù)量有關(guān)。因此，在今后研究中，應(yīng)加大種質(zhì)資源收集力度和增加采集地點(diǎn)，目標(biāo)是以較少的種質(zhì)代表該地區(qū)的遺傳變異，需要結(jié)合其他分子標(biāo)記，比如核基因或線粒體基因組的分子標(biāo)記，或進(jìn)一步加深對山藥居群的遺傳機(jī)制研究，為山藥系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析提供新思路。

4 結(jié)論

64份山藥種質(zhì)資源的遺傳距離較近，遺傳背景相似，可能是由于長期地區(qū)間引種導(dǎo)致，與地理距離不完全相關(guān)。atpI-rsp2和psbC-trnS序列可用于山藥物種鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化分析等研究領(lǐng)域。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）