熟地黃高壓炮制工藝研究*

陳子月 ，彭小園 ，解偉松 ，孫雙龍 ，劉興超 ，4，肖學鳳 △

（1. 天津中醫(yī)藥大學中藥學院，天津 301617； 2. 河北中醫(yī)學院，河北 石家莊 050200； 3. 河北仁心藥業(yè)有限公司，河北 保定 071200； 4. 河北省高校中藥組方制劑應用技術(shù)研發(fā)中心，河北 石家莊 050200）

地黃為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosaLibosch.的新鮮或干燥塊根［1］，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品。常用入藥形式有鮮地黃、生地黃、熟地黃、生地炭、熟地炭等，不同炮制品的性味、功效不同。鮮地黃性寒，味甘苦，清熱生津、涼血止血；生地黃性寒，清熱涼血、養(yǎng)陰生津；熟地黃性溫，補血滋陰、益精填髓［2］。地黃炮制方法在古代有蒸制、熬制、醋炒制等，現(xiàn)代炮制方法主要有生用、酒炒制、炭炒制等［3-4］。《中國藥典（一部）》《全國中藥材炮制規(guī)范》及各省市中藥材炮制規(guī)范中，熟地黃的現(xiàn)代制法各異，甚至簡化為一次性蒸制或酒燉，但炮制時間均過長［5-8］。研究發(fā)現(xiàn)，炮制時間與次數(shù)對熟地黃的活性成分含量的影響較大［9］。地黃中主要含有環(huán)烯醚萜苷類、苯乙醇苷類、呋喃醛衍生物等化合物［10-11］。本研究中以地黃代表性成分梓醇、地黃苷D、毛蕊花糖苷和5 - 羥甲基糠醛（5 - HMF）為指標性成分，探討了熟地黃的最佳炮制工藝，為工業(yè)化生產(chǎn)提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC - 20AT 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；ME204E102 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為十萬分之一）；YX - 280D 型手提式壓力蒸汽滅菌器（合肥華泰醫(yī)療設備有限公司）；KQ - 300DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為300 W，頻率為40 kHz）；Mili-Q型純水/超純水系統(tǒng)（美國Milipore公司）。

1.2 試藥

懷地黃（安國市祁利堂中藥材銷售有限公司，批號為20200316），經(jīng)河北中醫(yī)學院鄭開顏副教授鑒定為正品；梓醇對照品（批號為AF9030401），毛蕊花糖苷對照品（批號為 AF20110904），5 - HMF 對照品（批號為AF9052005），純度均不低于98%，均購于成都埃法生物科技有限公司；地黃苷D 對照品（上海詩丹德標準技術(shù)服務有限公司，批號為7534，純度不低于98%）；甲醇為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：WondaSil?C18-WR柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-水溶液（B），梯度洗脫（程序見表1）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：210 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Catalpol 2.5 - HMF 3.Rehmannioside D 4.VerbascosideA - B.Test solution（Rehmanniae Radix and Rehmanniae Radix Praeparata） C.Mixed control solutionFig.1 HPLC chromatograms

表1 流動相梯度洗脫程序（%）Tab.1 Gradient elution procedure of the mobile phase（%）

2.1.2 溶液制備

取懷地黃/ 熟地黃粗粉0.1 g，精密稱定，加25 mL 50%甲醇溶解，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷至室溫，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，用0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。分別取梓醇、5-HMF、地黃苷D、毛蕊花糖苷對照品4.44，4.40，6.02，3.49 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，用甲醇 - 水溶液（50∶50，V/V）定容，超聲處理（功率為300 W，頻率為40 kHz）至完全溶解，配制成上述4種成分質(zhì)量濃度分別為0.444，0.440，0.602，0.349 mg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3 方法學考察

線性關(guān)系考察：取2.1.2 項下混合對照品溶液，分別吸取2，6，10，14，18 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇 -水溶液（50∶50，V/V）定容，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，以各成分的質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程。結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果（n=5）Tab.2 Results of linear relationship test（n=5）

精密度試驗：取2.1.2 項下混合對照品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定6 次，記錄各對照品的峰面積。結(jié)果梓醇、5-HMF、地黃苷D、毛蕊花糖苷峰面積的RSD分別為0.20%，0.29%，0.09%，0.34%（n= 6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：精密吸取2.1.2 項下供試品溶液20 μL，分別于0，3，6，9，12 h 時按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果梓醇、5 - HMF、地黃苷D和毛蕊花糖苷峰面積的RSD分別為1.40%，1.60%，0.46%，0.62%（n= 5），表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復性試驗：取2.1.2 項下供試品溶液適量，共6份，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結(jié)果梓醇、5-HMF、地黃苷D、毛蕊花糖苷含量的RSD分別為0.35%，0.79%，0.95%，1.86%（n= 6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品0.1 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，取10 mL，共6 份；分別取梓醇、5 - HMF、地黃苷D、毛蕊花糖苷對照品0.171，0.205，0.333，0.306 mg，精密稱定，加入每份供試品溶液中，超聲處理（功率為300 W，頻率為40 kHz）使完全溶解，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結(jié)果見表3。

環(huán)保型水利工程的建設可減少空氣污染。在施工過程中，需要減少施工現(xiàn)場的煙塵，減少廢氣中有害氣體的排放。進行材料運輸時，需要采用封閉性較好的運輸車，同時使用灑水車進行輔助，從而減少粉塵污染。使用工程機械時，需要安裝除煙塵裝置。對于廢水以及廢棄物對環(huán)境的污染問題，需要嚴格按照相關(guān)標準進行控制，可對廢水和廢棄物進行處理后回收利用，對于不可回收的材料，需要嚴格按照相關(guān)標準進行處理，嚴禁隨意丟棄，如重金屬材料。

表3 加樣回收試驗結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of recovery test（n=6）

2.1.4 樣品含量測定

取各蒸制時間段的樣品適量，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定3 次，記錄峰面積，并計算各蒸制時間段4 個成分的含量。結(jié)果見表4和表5。

表4 120 ℃條件下地黃一次蒸制各成分含量測定結(jié)果（%，n=3）Tab.4 Determination results of various ingredients content in Rehmanniae Radix first steaming at 120 ℃（%，n=3）

表5 120 ℃條件下地黃二次蒸制各成分含量測定結(jié)果（%，n=3）Tab.5 Determination results of various ingredients content in Rehmanniae Radix second steaming at 120 ℃（%，n=3）

2.2 炮制工藝研究

采用高壓炮制熟地黃。1）高壓一次蒸制：將生懷地黃清洗干凈，置高壓鍋中，設蒸制溫度為120 ℃，分別蒸制10，15，20，25，30，35，40 min，蒸制完畢，取出，切片，晾干，用于含量測定。2）高壓二次蒸制：將生懷地黃清洗干凈，置高壓鍋中，設蒸制溫度為120 ℃，先蒸制10 min，然后加入40%的水燜潤4 h，再分別蒸制10，20，30，40 min，蒸制完畢，取出，切片，晾干，用于含量測定。

含量測定結(jié)果：高壓一次蒸制和高壓二次蒸制各成分含量變化見表4 和表5。可見，2 次蒸制梓醇、地黃苷D和毛蕊花糖苷的含量都隨蒸制時間的增加而降低，而5-HMF的含量隨蒸制時間的增加而升高。梓醇的含量在蒸制過程中下降很快，毛蕊花糖苷的含量也下降較快，而地黃苷D的含量在炮制過程中雖有下降，但下降幅度不高。一次蒸制40 min時，梓醇含量為0，5-HMF、地黃苷D 和毛蕊花糖苷的含量分別為0.37%，0.67%，0.14%；二次蒸制20 min 時，梓醇含量為0，5-HMF、地黃苷D 和毛蕊花糖苷的含量分別為0.14%，0.67%，0.17%，均符合2020 年版《中國藥典（一部）》中熟地黃含量測定標準。

外觀評價：高壓一次蒸制40 min 時，切制的熟地黃片仍不符合《中國藥典》要求；高壓二次蒸制20 min 時，切制的熟地黃均符合要求。

優(yōu)選的炮制工藝：通過分析4 種成分的含量變化和對炮制品外觀評價，優(yōu)化了熟地黃的炮制工藝，即高壓二次蒸制，將生地黃先蒸制10 min，用水或黃酒燜潤4 h，再蒸制20 min。第1 次蒸制的目的是加快水的吸收、燜潤完全。分別考察二次蒸制10，20，30，40 min 時炮制熟地黃成品的外觀，結(jié)果二次蒸制20 min 能完全滿足試驗要求，達到了二次蒸制的目的。

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

3.2 指標成分選擇

參考2015 年版和2020 年版《中國藥典（一部）》中生地黃和熟地黃的檢測指標，選取梓醇、毛蕊花糖苷和地黃苷D 作為檢測指標。地黃炮制過程中，大多數(shù)成分含量都呈下降趨勢，而5-HMF 的含量明顯上升，故選擇5-HMF為熟地黃炮制過程變化的標志物。

3.3 藥材產(chǎn)地差異影響炮制質(zhì)量

炮制過程中，發(fā)現(xiàn)生地黃若用水或黃酒燜潤透，進一步蒸制所需時間就會縮短，而由于產(chǎn)地差異問題，在燜潤過程中，生地黃內(nèi)部存在硬芯，導致蒸制時間即使延長也會出現(xiàn)不合格產(chǎn)品。

3.4 方法評價

二次蒸制可獲得合格的熟地黃，通過對熟地黃中指標性成分的測定與炮制過程中成分含量變化的比較，優(yōu)化熟地黃的炮制新工藝在保證產(chǎn)品質(zhì)量的同時大大縮短了炮制時間，為熟地黃的工業(yè)化生產(chǎn)提供了參考。