槐花顆?？寡趸煞痔崛∫后w外抗氧化活性及抑菌作用研究*

辛?xí)苑?，劉特津，潘童?/p>

（1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山中醫(yī)院，廣東 中山 528401； 2. 廣東藥科大學(xué)，廣東 中山 528458）

槐花顆粒由槐花、野菊花等經(jīng)現(xiàn)代制藥工藝提取、濃縮、干燥制粒而成，具有涼血止血、清熱解毒、瀉火平肝功效，用于治療便血、痔血、肝熱目赤、頭痛眩暈，同時(shí)還可治療血痢、崩漏、吐血、衄血。方中，槐花為君藥，野菊花為臣藥?；被ㄖ饕J丁、槲皮素等黃酮類化合物，對(duì)超氧陰離子和1，1 - 二苯基 - 2 - 3 硝基苯肼（DPPH）自由基具有較強(qiáng)的清除能力［1］，槐花多糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用良好［2］。野菊花具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化等活性，還原能力較強(qiáng)，且對(duì)超氧陰離子有較強(qiáng)的清除能力［3］。菊花對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用良好［4］。本研究中探討了槐花顆粒的體外抗氧化活性和抑菌作用及作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與菌種

儀器：UV-2550型紫外分光光度計(jì)（Shimadzu Corporation）；Multiskan FC 型酶標(biāo)儀（賽默飛世爾<上海>儀器有限公司）；BH - DHS - 35 型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；BS224S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，精度為萬(wàn)分之一）；HWS-12型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；DDB - 303A 型便攜式電導(dǎo)率儀（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；HN192007 - 20 - 004 型醫(yī)用離心機(jī)（湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司）；3870J 型立式滅菌器（精銳科學(xué)儀器有限公司）；BSC - 1100ⅡB2 型生物安全柜（蘇州諾達(dá)凈化科技有限公司）。

試藥：槐花顆粒（院內(nèi)制劑，批號(hào)為20001）；DPPH（梯希愛<上海>化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號(hào)為BFQNI-SL）；維生素C 片（佛山手心制藥有限公司，批號(hào)為2011109）；雙氧水（H2O2，貝斯特集團(tuán)有限公司，批號(hào)為B00060001）；Tris - HCl 緩沖液（杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為71712251）；濃鹽酸（西隴化工股份有限公司，批號(hào)為201912051）；Mueller - Hinton（MH）瓊脂培養(yǎng)基（杭州威晟生物科技有限公司，批號(hào)為1086721）；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（江門市凱林貿(mào)易有限公司，批號(hào)為1083215）；空白藥敏紙片（比克曼生物有限公司，直徑為6 mm）。

菌種：金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus（廣東省中山市中醫(yī)院標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌菌株，編號(hào)為ATCC29213）。

1.2 體外抗氧化活性試驗(yàn)

1.2.1 溶液制備

取樣品適量，120 ℃干燥至恒重，取10 g，精密稱定，加入無(wú)水乙醇50 mL，于70 ℃水浴加熱3 h［5］，趁熱濾過，置50 mL容量瓶中，用少量無(wú)水乙醇洗滌容器，收集洗液，放冷，用乙醇定容至50 mL容量瓶中［6］。按生藥量換算，即得質(zhì)量濃度為320 mg/mL 的提取液，吸取5 mL，定容至100 mL容量瓶中，即得質(zhì)量濃度為16 mg/mL的抗氧化成分提取液A液，稀釋得質(zhì)量濃度為8，4，2 mg/mL的抗氧化成分提取液。取樣品9.375 g，重復(fù)上述步驟，用無(wú)水乙醇提取，定容至50 mL容量瓶中，取2 mL，定容至100 mL容量瓶中，即得抗氧化成分質(zhì)量濃度為6 mg/mL的提取液［6］。

1.2.2 抗氧化能力測(cè)定

對(duì)DPPH 自由基的清除能力：分別取0.5 mL 不同質(zhì)量濃度（2，4，6，8 mg/ mL）的提取液和陽(yáng)性對(duì)照溶液，置具塞試管中，加入2.0 mL DPPH 溶液［7］、1.5 mL純化水，充分混勻，快速振蕩，室溫下避光放置30 min。采用紫外分光光度計(jì)分別于517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，從相同體積純化水作空白對(duì)照。按公式［8］計(jì)算對(duì)DPPH自由基的清除率，清除率越高，抗氧化能力越強(qiáng)。

清除率（%）=［A0-（A1-A2）］/A0×100%

式中，A0為純化水的吸光度，A1為提取液+陽(yáng)性對(duì)照溶液的吸光度，A2為提取液的吸光度。

對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力：分別取1 mL 不同質(zhì)量濃度的提取液（2，4，6，8 mg/mL）和陽(yáng)性對(duì)照溶液，置試管中，分別加入4 mL 50 mmol/ L Tris - HCl（pH 8.2）緩沖液、0.5 mL 25 mmo/L 鄰苯三酚溶液，靜置10 min，加入1 mL濃鹽酸終止反應(yīng)，于299 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（Ax）。用相同體積蒸餾水代替提取液，作空白對(duì)照，測(cè)得A0。按公式［9］計(jì)算清除率。

金門巖體位于英德弧形構(gòu)造前弧東翼內(nèi)側(cè)，NE向雪山嶂—浪傘頂背斜東翼，NE向構(gòu)造與EW向構(gòu)造交匯區(qū)，呈橢圓狀到不規(guī)則狀侵入金門背斜(雪山嶂背斜)軸部泥盆系東崗嶺組(D2d)中，向南東深部側(cè)伏，地表出露面積約為1.5km2(圖2)。該巖體與其侵入的泥盆系發(fā)生強(qiáng)烈的接觸變質(zhì)作用，形成大量的矽卡巖(圖3)，外接觸帶即為磁鐵礦化矽卡巖(圖4)。據(jù)重磁推斷，區(qū)內(nèi)存在規(guī)模巨大的隱伏巖體，北部與大東山-貴東巖體相連，南部與佛岡巖體相接[5]。

清除率（%）=［A0-Ax］/A0×100%

對(duì)Fe3+的還原能力：分別取2.5 mL 不同質(zhì)量濃度的提取液（2，4，6，8 mg/ mL）和陽(yáng)性對(duì)照溶液，分別加入2.5 mL 0.2 mol/L 磷酸緩沖液（pH 6.6）和10 g/L鐵氰化鉀溶液50 ℃恒溫水浴20 min，加2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，離心（轉(zhuǎn)速為3 000 r/min）10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL 蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，于700 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，并繪制質(zhì)量濃度-吸光度曲線。

對(duì)過氧化氫的清除能力：分別取2.4 mL 0.1 mol/L的磷酸緩沖液（pH 7.4）、0.6 mL 40 mmol/L 過氧化氫溶液，置具塞試管中，分別加入1 mL不同質(zhì)量濃度的提取液（2，4，6，8 mg/mL）和陽(yáng)性對(duì)照溶液，混勻，劇烈振蕩，室溫下放置10 min，于230 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A樣）。用相同體積水代替樣品測(cè)得A損傷，用相同體積水代替過氧化氫測(cè)得A未損傷，按公式計(jì)算清除率。

清除率（%）=（A樣-A損傷）/（A未損傷-A損傷）× 100%

1.3 體外抑菌效果研究

1.3.1 培養(yǎng)基制備

取牛肉膏3 g，精密稱定，取蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，加入蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH 至7.4，高壓滅菌，即得液體培養(yǎng)基。取牛肉膏3 g，精密稱定，取10 g 蛋白胨、18 g瓊脂、5 g 氯化鈉，溶于 1 000 mL 蒸餾水，調(diào) pH 至 7.4，高壓滅菌，倒入培養(yǎng)皿，即得固體培養(yǎng)基。

1.3.2 提取液、菌懸液制備

提取液：取樣品25 g，精密稱定，加入50 mL 蒸餾水，加熱回流20 min，濾液用水補(bǔ)足至50 mL，即得質(zhì)量濃度為0.8 g / mL 的提取液（低劑量組），同法制備3.1 g/mL 和1.6 g/mL 的提取液（高、中劑量組）。將提取液置滅菌器中滅菌（121 ℃，15 min），備用。

菌懸液：在生物安全柜中進(jìn)行無(wú)菌操作，先將裝有5 mL 無(wú)菌生理鹽水的試管置比濁儀中進(jìn)行比濁度調(diào)零，用接種環(huán)挑取金色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株置已調(diào)零的試管中，置漩渦混勻器，混勻，置比濁儀中進(jìn)行測(cè)量，至0.5麥?zhǔn)媳葷岫龋吹镁鷳乙骸?/p>

1.3.3 瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定抑菌環(huán)直徑

將藥敏紙分別浸泡于高、中、低劑量組的已滅菌平皿中12 h，傾出剩余藥液，將平皿置37 ℃恒溫箱中密閉熱干。將濃度為108cfu/ mL 的菌液用無(wú)菌棉簽均勻涂布于MH 瓊脂培養(yǎng)基，用無(wú)菌鑷子［10-11］將浸泡好的藥敏紙粘貼在平板上，分別為高、中、低劑量組（3.1，1.6，0.8 g/mL），培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌環(huán)直徑，并確定提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性。

1.3.4 最低抑菌濃度（MIC）、最低殺菌濃度（MBC）測(cè)定

MIC：采用二倍稀釋法［12］進(jìn)行稀釋，得到質(zhì)量濃度分別為 780.0，390.0，195.0，97.5，48.8，24.4，12.2，6.1，3.1，1.6 mg/ mL 的提取液，與培養(yǎng)基制成具有濃度梯度的含藥培養(yǎng)基。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，取無(wú)菌96 孔板，第2 孔至第12 孔均加入低劑量組提取液100 μL 肉湯培養(yǎng)基，分別吸取低劑量組提取液100 μL，注入第1孔和第2 孔，反復(fù)吹打，充分混勻；于第2 孔中吸取100 μL注入第3 孔，等倍稀釋，直至第10 孔，吹打，混勻，棄去100 μL。第11孔為不加提取液的受試菌對(duì)照管，即為陰性對(duì)照組；第12孔為加入60%乙醇的受試菌對(duì)照管，即為陽(yáng)性對(duì)照組。第1 孔至第12 孔中加入調(diào)整好的菌液10 μL，且每孔最終含菌濃度為 5 × 105cfu/ mL。以第 1列為空白孔進(jìn)行調(diào)零，于600 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔A0［13］，重復(fù) 3 次，取平均值作為本底。于 37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測(cè)定A1，重復(fù)3次，求平均值。同時(shí)，以A1與A0的差值（試驗(yàn)微孔的A凈值）判斷MIC。根據(jù)公式計(jì)算，A凈值> 0.02 視為有菌生長(zhǎng)，以完全無(wú)菌生長(zhǎng)的最低濃度為MIC。

MBC：取上述測(cè)定MIC的96 孔板，分別從無(wú)菌生長(zhǎng)的試驗(yàn)孔中吸取培養(yǎng)基100 μL，注入MH瓊脂培養(yǎng)基表面，涂布均勻，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出，采用活菌計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)菌落，將培養(yǎng)基中平均菌落數(shù)少于5的最小生藥濃度記作MBC［14］。重復(fù)3次，取平均值。

1.4 體外抑菌作用機(jī)制研究

細(xì)菌細(xì)胞膜電導(dǎo)率測(cè)定：將細(xì)菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，分別加入稀釋后的提取液。搖床培養(yǎng)，分別于0，2，4，6，8 h 時(shí)取菌液4 mL，離心（轉(zhuǎn)速為5 000 r/min）10 min，取上清液，測(cè)定電導(dǎo)率。重復(fù)3次，取平均值。

細(xì)菌培養(yǎng)液中DNA 及RNA 等大分子含量測(cè)定：取不同質(zhì)量濃度槐花顆粒提取液（0.8，1.6，3.1 g/mL），加入菌懸液，搖勻，使藥物終濃度分別為MIC的0，2，4，8 倍，含菌濃度為106cfu/mL，取上述培養(yǎng)基置37 ℃培養(yǎng)1 h，取樣，離心（轉(zhuǎn)速為4 500 r/min）10 min，取上清液，稀釋20倍，于260 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度［15］。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外抗氧化活性試驗(yàn)

對(duì)DPPH 自由基的清除能力：由圖1 可知，不同質(zhì)量濃度（2～8 mg/mL）抗氧化成分提取液對(duì)DPPH 自由基均有較強(qiáng)的清除能力，且與質(zhì)量濃度存在量效關(guān)系，清除能力隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)；質(zhì)量濃度為8 mg/mL時(shí)，與陽(yáng)性對(duì)照溶液的清除能力相近。

圖1 槐花顆?？寡趸煞痔崛∫簩?duì)DPPH的清除能力Fig.1 Scavenging ability of antioxidant ingredients exact of Huaihua Granules to DPPH

對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力：由圖2 可知，不同質(zhì)量濃度（2～8 mg/ mL）抗氧化成分提取液對(duì)超氧陰離子均有較強(qiáng)的清除能力，但弱于陽(yáng)性對(duì)照溶液；清除能力隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，表現(xiàn)出較好的清除能力。

圖2 槐花顆?？寡趸煞痔崛∫簩?duì)超氧陰離子自由基的清除能力Fig.2 Scavenging ability of antioxidant ingredients exact of Huaihua Granules to superoxide anion radical

對(duì)Fe3+的還原能力：由圖3 可知，不同質(zhì)量濃度（2～8 mg/mL）抗氧化成分提取液對(duì)Fe3+均有較強(qiáng)的還原能力，比陽(yáng)性對(duì)照溶液的還原能力強(qiáng)，且還原能力隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。

圖3 槐花顆?？寡趸煞痔崛∫簩?duì)Fe3+的還原能力Fig.3 Reduction ability of antioxidant ingredients exact of Huaihua Granules to Fe3 +

對(duì)過氧化氫的清除能力：由圖4 可知，不同質(zhì)量濃度（2～8 mg/ mL）提取液對(duì)過氧化氫均有良好的清除能力，清除能力隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，質(zhì)量濃度為8 mg/mL時(shí)比陽(yáng)性對(duì)照溶液清除能力強(qiáng)。

圖4 槐花顆?？寡趸煞痔崛∫簩?duì)過氧化氫的清除能力Fig.4 Scavenging ability of antioxidant ingredients exact of Huaihua Granules to hydrogen peroxide

2.2 體外抑菌試驗(yàn)

對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果：不同槐花顆粒抗氧化成分提取液（質(zhì)量濃度為0.8，1.6，3.1 g/mL）的抑菌環(huán)直徑分別為5.0，7.0，10.0 mm，對(duì)金黃色葡萄球菌均有良好的抑菌效果，且抑菌效果隨著質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)。結(jié)果見圖5。

圖5 槐花顆?？寡趸煞痔崛∫簩?duì)金黃色葡萄球菌的抑菌直徑Fig.5 Antibacterial circle diameters of antioxidant ingredients exact of Huaihua Granules against Staphylococcus aureus

MIC：槐花顆粒抗氧化成分提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用見表1?？梢姡琈IC為48.8 mg/mL。

表1 槐花顆?？寡趸煞痔崛∫簩?duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用Tab.1 Inhibitory effect of antioxidant ingredients exact of Huaihua Granules on Staphylococcus aureus

MBC：質(zhì)量濃度為 390.0 mg/ mL 時(shí)，MH 培養(yǎng)基中菌落數(shù)為1，滿足平均菌落數(shù)少于5的要求，故槐花顆?？寡趸煞痔崛∫旱腗BC為390.0 mg/mL。

2.3 槐花顆粒抑菌機(jī)制研究

對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜電導(dǎo)率的影響：細(xì)胞膜為細(xì)胞正常生命活動(dòng)提供了相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，參與了細(xì)胞與周圍環(huán)境中的物質(zhì)交換過程，保持了細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡。在槐花顆?？寡趸煞痔崛∫旱淖饔孟?，細(xì)菌的細(xì)胞膜遭到破壞，表現(xiàn)為培養(yǎng)基電導(dǎo)率的改變。由圖6可知，電導(dǎo)率隨著槐花顆?？寡趸煞痔崛∫簩?duì)金黃色葡萄球菌作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，細(xì)菌體內(nèi)有電解質(zhì)滲出，表明槐花顆?？寡趸煞痔崛∫嚎赡芡ㄟ^破壞金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁而抑制其生長(zhǎng)。

圖6 槐花顆?？寡趸煞痔崛∫簩?duì)電導(dǎo)率的影響Fig.6 Effect of antioxidant ingredients exact of Huaihua Granules on electrical conductivity

對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)液中DNA 及RNA 等大分子含量的影響：在槐花顆?？寡趸煞痔崛∫旱淖饔孟拢?xì)菌的細(xì)胞膜遭到破壞，細(xì)胞內(nèi)DNA 及RNA 等大分子物質(zhì)的外漏，于260 nm 波長(zhǎng)處菌體培養(yǎng)液的吸光度升高。由圖7可知，吸光度隨著槐花顆粒抗氧化成分提取液質(zhì)量濃度的增加而升高，表明槐花顆粒抗氧化成分提取液通過破壞細(xì)菌細(xì)胞膜抑制金黃色葡萄球菌。

圖7 槐花顆粒抗氧化成分提取液對(duì)大分子含量的影響Fig.7 Effect of antioxidant ingredients exact of Huaihua Granules on macromolecular contents

3 討論

由本研究結(jié)果可知，槐花顆粒具有良好的抗氧化活性，對(duì)DPPH 自由基、超氧陰離子、過氧化氫均有良好的清除能力，對(duì)Fe3+有良好的還原能力，且隨著抗氧化成分質(zhì)量濃度的增加而升高。若人體內(nèi)缺少抗氧化物，會(huì)造成體內(nèi)自由基過多，易致人體健康受損，甚至誘發(fā)痔血、便血?；被w粒具有涼血止血、清肝瀉火功效，可能與槐花顆粒的抗氧化活性有一定關(guān)系。此外，槐花顆?？寡趸煞痔崛∫簩?duì)金黃色葡萄球菌具有良好的抑制效果。由MIC和MBC試驗(yàn)結(jié)果可知，較低濃度即有抑菌效果，且MBC在治療劑量?jī)?nèi)。通過破壞金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，可抑制其生長(zhǎng)。痔血易導(dǎo)致肛門感染，細(xì)菌、毒素、膿栓易侵入血液引發(fā)敗血癥、毒血癥，槐花顆粒抗氧化成分提取液抑菌效果良好，可降低肛門感染細(xì)菌的風(fēng)險(xiǎn)。后續(xù)將進(jìn)一步研究其體外抗氧化活性及其抑菌機(jī)制和藥理作用。