天水秋椒葉黃酮的提取工藝優(yōu)化

劉曉瑩，盧利平，2，金偉嘉，李佳怡，楊 揚(yáng)

（1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心中國馬來西亞國家聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030）

0 引言

花椒（Zanthoxylum bungeanum）是蕓香科植物，一種歷史久遠(yuǎn)的食物香料[1]。中國是世界花椒栽培面積與產(chǎn)量最大的國家[2]，在我國分布廣泛，北起東北南部，南至五嶺北坡，東南至江蘇、浙江沿海地區(qū)，西南至西藏東南部，常見于平原至海拔較高的山地，在青海海拔2 500 m的坡地也有栽種；耐旱、喜陽光，各地多栽種[3]。隨著政府部門精準(zhǔn)扶貧工作力度的不斷加大和花椒價格高、效益好，甘肅省天水市甘谷縣將花椒栽植作為貧困山區(qū)精準(zhǔn)扶貧精準(zhǔn)脫貧產(chǎn)業(yè)富民的主要產(chǎn)業(yè)來培育，栽植面積逐年擴(kuò)大[4]。秋椒作為當(dāng)?shù)靥赜谢ń菲贩N也隨栽植面積的擴(kuò)大而增產(chǎn)增收，其花椒葉作為花椒的主要副產(chǎn)物，也是很好的調(diào)味品[5]，具有抗菌、活血、止痛等藥用價值[6-7]。且花椒葉化學(xué)成分組成豐富，近年來國內(nèi)外對花椒葉的研究表明，花椒葉的主要成分為揮發(fā)油、黃酮、多酚、多糖、酰胺、香豆素等。豐富的化學(xué)組成使其具有多種生物活性，擁有良好的藥用價值，具有廣闊的研究前景[8]。人類心腦血管疾病、腫瘤、老年性癡呆、震顫麻痹癥等疾病幾乎都與氧自由基有關(guān)[9]。但花椒葉一直沒有得到良好的利用，造成了一定的資源浪費(fèi)[10]。黃酮是一種很強(qiáng)的抗氧化劑，可有效清除體內(nèi)的氧自由基，可以改善血液循環(huán)、降低膽固醇[11]，大大降低了心腦血管疾病的發(fā)病率，也可以改善心腦血管疾病的癥狀。黃酮類化合物具有很強(qiáng)的抑菌活性[12]。此外，黃酮類化合物具有降血糖、降血脂的作用[13-15]，還可清除高眼壓狀態(tài)下視網(wǎng)膜組織中產(chǎn)生的自由基損害，對高眼壓狀態(tài)下視網(wǎng)膜組織具有重要的保護(hù)作用[16]。響應(yīng)面法（Response surface methodology，RSM）作為一種非常重要的試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化方法，在中藥提取工藝優(yōu)化等方面得到廣泛的應(yīng)用[17]。響應(yīng)面法是將影響提取試驗(yàn)結(jié)果的因素進(jìn)行設(shè)計(jì)，按照設(shè)計(jì)方案進(jìn)行試驗(yàn)得到試驗(yàn)結(jié)果。分析試驗(yàn)因素和試驗(yàn)結(jié)果之間的數(shù)學(xué)關(guān)系，進(jìn)而得到最優(yōu)的試驗(yàn)條件[18-19]。關(guān)于花椒葉中黃酮的提取雖有報(bào)道，但對于天水甘谷縣花椒中秋椒葉的黃酮提取未見報(bào)道。以當(dāng)?shù)厍锝啡~為原料，通過超聲輔助提取、單因素試驗(yàn)法、響應(yīng)面法優(yōu)化秋椒葉總黃酮的提取工藝，得到了較高的黃酮提取率，從而提高甘肅天水秋椒葉的利用率，變廢為寶。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

秋椒葉，2020年5月采摘于甘肅甘谷縣大象山鎮(zhèn)；丙酮、無水乙醇、蒸餾水、亞硝酸鈉、九水合硝酸鋁、氫氧化鈉，均為分析純，蘭州市奧科生物技術(shù)有限公司提供；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，Solarbio公司提供。

WJX-200型高速多功能粉碎機(jī)，江陰市億豐機(jī)械設(shè)備有限公司產(chǎn)品；SB-500DTY型超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；BSM-120型電子分析天平，上海坤誠科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；DT5型離心機(jī)，上海京工實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；HHS4A型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司產(chǎn)品；DHG-9420A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；MHY-19642型可見分光光度計(jì)，北京美華儀科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花椒葉總黃酮提取工藝流程圖

秋椒葉干燥→粉碎過篩→脫色處理→超聲提取→離心→黃酮提取液。

1.2.2 原料處理

摘取新鮮的秋椒葉洗凈，在70℃烘箱中烘至恒質(zhì)量。粉碎花椒葉并過80目篩，經(jīng)丙酮溶液浸泡過夜，抽濾，得到脫色處理后的干燥秋椒葉粉，裝入封口袋中密封保存，備用。

1.2.3 提取

準(zhǔn)確稱量1 g秋椒葉粉于比色管中，超聲頻率40 kHz，功率比60%，在特定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液、液料比、超聲時間、超聲溫度下進(jìn)行超聲波輔助提取。以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心15 min，收集提取液2次后將濾液合并，最終提取液定容至50 mL。

1.2.4 黃酮含量的測定

移取0.5 mL提取液到10 mL具塞試管中，用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液補(bǔ)至5 mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加入10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，反應(yīng)6 min，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%NaOH溶液4 mL，混合均勻后用蒸餾水定容至刻度線，15 min后于波長510 nm處測定其吸光度（A510）。秋椒葉中黃酮濃度依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算，并計(jì)算黃酮的得率[20]。

式中：

Y——秋椒葉總黃酮得率，%；

C——測得的黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——秋椒葉樣品定容體積，mL；

n——稀釋倍數(shù)；

m——秋椒葉樣品質(zhì)量，g。

1.2.5 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制特定質(zhì)量濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別吸取體積0，0.5，1.0，1.5，2.0 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液置于10 mL具塞試管中，加入80%乙醇溶液定容至5 mL，混合均勻后同1.2.4操作方法進(jìn)行反應(yīng)后，于波長510 nm處測定其吸光度（A510）[21]。

1.3 單因素試驗(yàn)

按照1.2.4中的試驗(yàn)步驟，分別研究不同梯度單因素對秋椒葉黃酮提取率的影響。設(shè)置各單因素梯度為乙醇體積分?jǐn)?shù)（45%，50%，55%，60%，65%，70%）；浸提時間（20，30，40，50，60，70 min）；浸提溫度（40，45，50，55，60，65℃）；料液比（1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，1∶45（g∶mL））。

1.4 試驗(yàn)因素水平選取

根據(jù)單因素試驗(yàn)所得的提取工藝條件，以秋椒葉黃酮得率為響應(yīng)值，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、超聲時間（B）、超聲溫度（C）、料液比（D）4個因素作為考查變量，依據(jù)如表1所示的試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化秋椒葉黃酮的提取工藝。

響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=8.687 1X+0.002 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3，且在質(zhì)量濃度0.01～0.05 mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮得率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮得率的影響見圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮得率的影響

由圖2可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%時，黃酮得率達(dá)到最高。依據(jù)相似相溶原理可知，黃酮溶于乙醇的量與兩者極性密切相關(guān)，秋椒葉中黃酮的極性與55%的乙醇溶液相近，故此時得率為最大值。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大，黃酮得率下降。因此，根據(jù)秋椒葉黃酮得率曲線走勢，選取50%，55%，60%的乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.2.2 超聲時間對黃酮得率的影響

超聲時間對黃酮得率的影響見圖3。

由圖3可知，在一定時間范圍內(nèi)，秋椒葉黃酮得率呈現(xiàn)先增加后減少的變化規(guī)律，在超聲時間為50 min時，黃酮得率最高為19.51%；超過50 min后，黃酮得率曲線呈現(xiàn)緩慢下降趨勢。根據(jù)秋椒葉黃酮得率曲線走勢，超聲時間選取40，50，60 min進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

圖3 超聲時間對黃酮得率的影響

2.2.3 超聲溫度對黃酮得率的影響

超聲溫度對黃酮得率的影響見圖4。

由圖4可知，當(dāng)超聲溫度為40～55℃時，黃酮得率隨著超聲溫度的上升而增大，當(dāng)溫度超過55℃后，秋椒葉黃酮得率開始下降。這是因?yàn)檫m宜的溫度范圍能夠提高黃酮分子的運(yùn)動速率，從而提高黃酮的溶出，但是高于一定的溫度界限，黃酮結(jié)構(gòu)被破壞，溶出量減少，其他雜質(zhì)的析出比例上升，因而黃酮得率會有所降低。根據(jù)秋椒葉黃酮得率曲線走勢，超聲溫度選取50，55，60℃進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

圖4 超聲溫度對黃酮得率的影響

2.2.4 料液比對黃酮得率的影響

料液比對黃酮得率的影響見圖5。

圖5 料液比對黃酮得率的影響

由圖5可知，在料液比為1∶20～1∶35時，黃酮得率隨著料液比的升高而升高，當(dāng)料液比超過1∶35后，黃酮得率呈下降趨勢。這是由于料液比比較低時，秋椒葉中黃酮不能夠完全溶出；隨著溶劑量增加，雜質(zhì)溶出量增加導(dǎo)致黃酮提率降低，過量的乙醇導(dǎo)致黃酮損失。根據(jù)秋椒葉黃酮得率曲線走向規(guī)律，料液比選取1∶30，1∶35，1∶40（g∶mL）進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，通過Design Expert 8.06軟件設(shè)計(jì)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、超聲時間（B）、超聲溫度（C）、料液比（D）為自變量，以秋椒葉黃酮得率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析，其中25，26，27，28，29是中心試驗(yàn)，其余為析因試驗(yàn)。得到黃酮提取液的擬合回歸方程為：

響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

回歸方程方差分析見表3。

由表3可知，通過p值可知，對黃酮得率影響極顯著的因素為C，A2，B2，C2，D2，說明試驗(yàn)因素與響應(yīng)值之間，對其影響較大為二次項(xiàng)，四因素之間交互作用不顯著。整體模型的p值＜0.01，差異極顯著（p＜0.01），表明回歸方程模型顯著，失擬項(xiàng)p值為0.050 4，較顯著（p＜0.05），表明該模型的擬合度較好，變異系數(shù)CV=7.74，說明試驗(yàn)可操作性較好。該模型的決定系數(shù)R2=0.923 0和R2Adj=0.864 5。綜上所述，該模型可以用于秋椒葉中黃酮得率理論值的進(jìn)一步分析和預(yù)測。通過F值可得，各因素對黃酮得率的影響次序?yàn)镃＞D＞A＞B，即超聲溫度＞料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞超聲時間。

表3 回歸方程方差分析

2.3.2 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)

乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時間對黃酮得率影響的響應(yīng)面圖見圖6，乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲溫度對黃酮得率影響的響應(yīng)面圖見圖7，乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比對黃酮得率影響的響應(yīng)面圖見圖8，超聲溫度與超聲時間對黃酮得率影響的響應(yīng)面圖見圖9，超聲時間與料液比對黃酮得率影響的響應(yīng)面圖見圖10，超聲溫度與料液比對黃酮得率影響的響應(yīng)面圖見圖11。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時間對黃酮得率影響的響應(yīng)面圖

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲溫度對黃酮得率影響的響應(yīng)面圖

圖8 乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比對黃酮得率影響的響應(yīng)面圖

圖9 超聲溫度與超聲時間對黃酮得率影響的響應(yīng)面圖

圖10 超聲時間與液料比對黃酮得率影響的響應(yīng)面圖

交互效應(yīng)的強(qiáng)弱趨向可以被響應(yīng)面坡度陡峭程度和等高線橢圓形狀反應(yīng)，交互效應(yīng)強(qiáng)弱水平可以從投影面的等高線形狀中觀察，曲面傾斜度越大，則該因素對響應(yīng)值的影響越顯著。對比圖6～圖11，超聲溫度對秋椒葉黃酮得率的影響最大，液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)次之，超聲時間的影響最小。各因素等高線橢圓形狀不明顯（圖6～11b），表明其交互作用不顯著，符合回歸方程的方差分析結(jié)果。

圖11 超聲溫度與液料比對黃酮得率影響的響應(yīng)面圖

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)過響應(yīng)面結(jié)果分析得到工藝條件的最優(yōu)值分別為乙醇體積分?jǐn)?shù)55.04%，超聲時間50.88 min，超聲溫度56.39℃，料液比1∶36.55（g∶mL），此時黃酮得率為25.858 8%?？紤]實(shí)際操作的可行性及驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性，將工藝參數(shù)調(diào)整為乙醇體積分?jǐn)?shù)55%，超聲時間50 min，超聲溫度56℃，料液比1∶36（g∶mL），在同等條件下進(jìn)行3組重復(fù)試驗(yàn)，得到秋椒葉總黃酮的得率為25.76%，與預(yù)測值接近（相對誤差為0.34%），說明響應(yīng)面法優(yōu)化秋椒葉總黃酮的提取工藝條件具有可行性。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面法（RSM）優(yōu)化了超聲輔助提取秋椒葉黃酮的工藝，建立了乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度、超聲時間和料液比對秋椒葉黃酮含量影響的回歸模型。結(jié)果表明，各因素對黃酮得率的影響次序?yàn)槌暅囟龋玖弦罕龋疽掖俭w積分?jǐn)?shù)＞超聲時間，由此得到最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)55%，浸提時間50 min，浸提溫度56℃，料液比1∶36（g∶mL），在該條件下，大紅袍花椒葉中黃酮得率達(dá)到25.76%±0.05%。秋椒葉中總黃酮含量很高，黃酮具有非常好的研究價值和醫(yī)用價值，可進(jìn)行更加深入的研究，提高秋椒葉的附加值，為花椒副產(chǎn)物的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論參考。