大別山白頭翁組織培養(yǎng)外植體選擇與消毒技術(shù)優(yōu)化

黃 萍，張佳佳，竇 娜，蔣素華

(1. 鄭州師范學(xué)院 生物工程研究所，河南 鄭州 450044；2. 河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南 中牟 451450)

0 引言

白頭翁(Pulsatillachinensis)為毛茛科白頭翁屬多年生草本植物，主要分布于東北、華北、華東、中南、西南等地，河南各地均有分布，為豫南地區(qū)常見(jiàn)藥用植物之一，已被國(guó)家藥典收錄[1]。作為一味傳統(tǒng)的中藥材，白頭翁在臨床中被廣泛應(yīng)用[2]，常用于預(yù)防和治療細(xì)菌性腹瀉[3]，還具有顯著的抗腫瘤作用[2]。白頭翁不僅藥用價(jià)值高，而且花期早、花色鮮、花朵碩大、果實(shí)奇特，具有較高的觀賞價(jià)值，開(kāi)發(fā)利用前景非常廣闊。但其生態(tài)分布極具局限性[4]，種子自然發(fā)芽率極低，且發(fā)芽持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，種子壽命短，隔年種子完全喪失活力；移栽野生苗和分根繁殖雖出苗率高，但生長(zhǎng)過(guò)程中成活率較低[5]。人工繁殖困難導(dǎo)致目前市場(chǎng)需求主要依靠挖掘野生資源來(lái)滿足。長(zhǎng)期不規(guī)范采挖以及生存環(huán)境的人為破壞導(dǎo)致野生資源日漸稀少，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求，利用離體快繁技術(shù)，實(shí)現(xiàn)白頭翁規(guī)?；斯ぴ耘嘁殉蔀槠惹行枰?/p>

目前，白頭翁的化學(xué)成分、藥理作用研究備受關(guān)注[6]，相關(guān)文獻(xiàn)較多，而對(duì)于人工栽培繁殖的研究較少，關(guān)于其組織培養(yǎng)技術(shù)的研究主要見(jiàn)于東北興安白頭翁[4]和朝鮮白頭翁[5]，主要研究了其不定芽的誘導(dǎo)、增殖以及生根培養(yǎng)等，尚未見(jiàn)河南大別山地區(qū)野生白頭翁組織培養(yǎng)的相關(guān)報(bào)道。針對(duì)白頭翁生長(zhǎng)緩慢、葉片偏少，外植體材料非常有限，且白頭翁全株密被絨毛不易消毒的情況，本文對(duì)白頭翁外植體及其消毒技術(shù)的優(yōu)化展開(kāi)專門(mén)研究，通過(guò)選用不同外植體與不同消毒藥劑的不同消毒時(shí)間進(jìn)行正交試驗(yàn)，比較各因子對(duì)污染率及出愈率的影響，以找出大別山白頭翁啟動(dòng)培養(yǎng)的最佳外植體，以及低毒高效、對(duì)環(huán)境危害小的最佳消毒方案，為后續(xù)繼代培養(yǎng)的成功和減少消毒劑對(duì)環(huán)境的污染提供可靠保障。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為野生白頭翁，初春3—4月挖自河南大別山區(qū)，移栽緩苗1個(gè)月以上，生長(zhǎng)穩(wěn)定后取材。每次取材時(shí)間為晴天午后14時(shí)左右，分別剪取幼葉葉片、中葉葉片和中葉葉柄為外植體。幼葉為黃綠色、質(zhì)地稍軟，中葉為剛轉(zhuǎn)綠的葉片、質(zhì)地略硬，葉柄挑選健壯的中葉葉柄。剪取的材料用濕毛巾包裹后，冰袋低溫保存并立即帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為比較不同外植體的消毒效果，并找到體積分?jǐn)?shù)75%乙醇和體積分?jǐn)?shù)2%次氯酸鈉不同消毒時(shí)間、體積分?jǐn)?shù)20%過(guò)氧化氫和體積分?jǐn)?shù)2%次氯酸鈉不同消毒時(shí)間的最佳組合，設(shè)計(jì)兩組3因素3水平正交試驗(yàn)。

試驗(yàn)(1)3因素分別為：外植體、75%乙醇消毒時(shí)間和2%次氯酸鈉消毒時(shí)間，各因素水平見(jiàn)表1。

表1 白頭翁消毒正交試驗(yàn)(1)因素水平表Tab. 1 The factor and level of orthogonal test (1) about Pulsatilla chinensis disinfection

試驗(yàn)(2)3因素分別為：外植體、20%過(guò)氧化氫消毒時(shí)間和2%次氯酸鈉消毒時(shí)間，各因素水平見(jiàn)表2。

表2 白頭翁消毒正交試驗(yàn)(2)因素水平表Tab. 2 The factor and level of orthogonal test (2) about Pulsatilla chinensis disinfection

兩組正交試驗(yàn)均選用L9(34)正交表安排試驗(yàn)，各設(shè)9個(gè)處理，每處理接種20個(gè)外植體，3次重復(fù)。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析和方差分析，分別篩選出兩組試驗(yàn)的最佳消毒組合，然后對(duì)兩組試驗(yàn)的最佳組合進(jìn)行驗(yàn)證與比較，并對(duì)兩組試驗(yàn)中不同外植體的消毒效果進(jìn)行比較。

1.3 試驗(yàn)方法

采回的外植體材料先用流水洗去表面塵土，再用洗潔精浸泡清洗，葉柄、葉脈凹陷部位用軟毛刷輕輕刷洗，最后用流水沖洗10～15 min，瀝干水分后轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)，按正交試驗(yàn)方案消毒組合進(jìn)行消毒。

材料消毒后，切去被消毒劑損傷的變色部分，然后將葉片切成約0.8 cm2的方塊，葉柄只選用靠近葉片的上段，切成約1 cm的小段。切好的材料接種于相同的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基為：MS+2, 4-D 0.2 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+TDZ 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L[1]，高壓滅菌前pH值調(diào)至6.2～6.4。接種后置于培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度(25±1 ℃)，濕度50%，光照度3 000～3 400 lx，光照時(shí)間16 h/d。

培養(yǎng)期間每隔3 d觀察統(tǒng)計(jì)污染情況，記錄后及時(shí)清理，30 d后統(tǒng)計(jì)最終污染率和出愈率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS13.0 軟件進(jìn)行方差分析，采用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。采用Excel 2007制作圖表。

2 結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)(1)各因子對(duì)消毒效果的影響

外植體、75% 乙醇消毒時(shí)間、2% 次氯酸鈉消毒時(shí)間3因素正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。污染率的極差分析結(jié)果顯示，3個(gè)因素的極差值均大于空白對(duì)照，表明這3個(gè)因素對(duì)白頭翁消毒效果均構(gòu)成影響。其中外植體因素的極差值最大，遠(yuǎn)高出空白對(duì)照，是影響污染率的最關(guān)鍵因素；其次是次氯酸鈉消毒時(shí)間，影響最小的是乙醇消毒時(shí)間。

表3 白頭翁消毒正交試驗(yàn)(1)結(jié)果的直觀分析Tab. 3 The intuitive analysis of orthogonal test (1) about Pulsatilla chinensis disinfection

出愈率極差值同樣是外植體因素位居第一，遠(yuǎn)高出空白對(duì)照，對(duì)出愈率影響最大；其次是次氯酸鈉消毒時(shí)間，乙醇消毒時(shí)間對(duì)出愈率影響最小。出愈率的方差分析結(jié)果(表4)進(jìn)一步驗(yàn)證了外植體水平不同，會(huì)顯著影響愈傷組織誘導(dǎo)率即出愈率的大小(P<0.05)，而乙醇消毒時(shí)間和次氯酸鈉消毒時(shí)間對(duì)出愈率的影響不顯著(P>0.05)。

綜合考慮污染率和出愈率的平均值大小(表3)，A的最優(yōu)水平為A2，B的最優(yōu)水平為B2，C因素 C1為最佳，故正交試驗(yàn)(1)消毒的最優(yōu)組合應(yīng)為A2B2C1，即選中葉葉片為外植體，先用75%乙醇處理20 s ，再用2%次氯酸鈉處理8 min會(huì)有最佳的消毒效果，但此處理組合不在試驗(yàn)中，而試驗(yàn)處理5(A2B2C3)和處理6(A2B3C1)的實(shí)際出愈率最高，污染率均為0，所以還需進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，以確定選出的處理組合與處理5和處理6哪一個(gè)為最優(yōu)。

表4 白頭翁消毒正交試驗(yàn)(1)出愈率方差分析Tab. 4 The variance analysis of orthogonal test (1) about Pulsatilla chinensis disinfection

2.2 白頭翁消毒正交試驗(yàn)(2)各因子對(duì)消毒效果的影響

外植體、20% 過(guò)氧化氫消毒時(shí)間、2% 次氯酸鈉消毒時(shí)間進(jìn)行3水平正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果的直觀分析如表5所示。從污染率的極差值可以看出，外植體類型是污染率最主要的影響因子;其次是次氯酸鈉消毒時(shí)間，過(guò)氧化氫消毒時(shí)間對(duì)污染率基本沒(méi)有影響。

表5 白頭翁消毒正交試驗(yàn)(2)結(jié)果的直觀分析Tab. 5 The intuitive analysis of orthogonal test (2) about Pulsatilla chinensis disinfection

3個(gè)因素對(duì)出愈率的影響依次為：外植體>過(guò)氧化氫時(shí)間>次氯酸鈉時(shí)間，外植體類型對(duì)出愈率的影響最大。出愈率方差分析結(jié)果也表明(表6)，外植體類型對(duì)出愈率的影響差異極顯著(P<0.01)，過(guò)氧化氫時(shí)間、次氯酸鈉時(shí)間不同水平出愈率的差異不顯著(P>0.05)。過(guò)氧化氫處理時(shí)間雖不影響污染率，但對(duì)出愈率的影響位居第二，消毒過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)，20%過(guò)氧化氫處理后，外植體材料明顯受傷變色，影響后期愈傷組織的誘導(dǎo)，而2% 次氯酸鈉處理時(shí)沒(méi)出現(xiàn)材料受傷變色情況。

表6 白頭翁消毒技術(shù)正交試驗(yàn)(2)出愈率方差分析Tab. 6 The variance analysis of orthogonal test (2) about Pulsatilla chinensisdisinfection

根據(jù)表5平均值的大小可以確定，正交試驗(yàn)(2)A因素的最優(yōu)水平為A2，B因素的最優(yōu)水平為B1，C因素污染率和出愈率最優(yōu)水平不一致，考慮到啟動(dòng)培養(yǎng)是否成功關(guān)鍵在于愈傷組織誘導(dǎo)情況，有些材料雖無(wú)污染但受傷變褐嚴(yán)重?zé)o法長(zhǎng)出正常的胚性愈傷組織，所以最優(yōu)水平應(yīng)主要看出愈率，這樣C因素C2為最佳，故正交試驗(yàn)(2)消毒的最優(yōu)組合應(yīng)為A2B1C2，即選中葉葉片為外植體，先用20% 過(guò)氧化氫處理8 min ，再用2% 次氯酸鈉處理8 min，此組合正是試驗(yàn)方案中的處理4，實(shí)際出愈率和污染率均為最優(yōu)。但處理5(A2B2C3)與處理4(A2B1C2)結(jié)果相同，所以還需進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，以確定處理4和處理5哪一個(gè)為最優(yōu)。

2.3 白頭翁消毒最佳組合驗(yàn)證與比較

對(duì)兩組正交試驗(yàn)進(jìn)行直觀分析得出的最佳組合，以及實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果中表現(xiàn)最優(yōu)的組合，共5個(gè)處理組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行多重比較，以確定白頭翁消毒的最佳方案，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 白頭翁消毒最佳組合驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab. 7 Validation test results of the best combination of Pulsatilla sterilization disinfection

正交試驗(yàn)(1)的3個(gè)組合中，A2B2C1出愈率最高， 但A2B2C3與其差異不顯著，二者出愈率均顯著高于A2B3C1，且A2B2C3污染率最低，故若選用75% 乙醇與2% 次氯酸鈉對(duì)白頭翁進(jìn)行聯(lián)合消毒，最佳方案選A2B2C1或 A2B2C3均可。正交試驗(yàn)(2)的2個(gè)組合中，二者污染率差異不顯著，但A2B1C2出愈率顯著高于A2B2C3，故若選用20% 過(guò)氧化氫與2% 次氯酸鈉對(duì)白頭翁進(jìn)行聯(lián)合消毒，最佳方案應(yīng)選A2B1C2。兩組正交試驗(yàn)相比，雖然正交試驗(yàn)(2)的兩個(gè)組合污染率較低，但出愈率均低于正交試驗(yàn)(1)，且消毒時(shí)材料易受傷變褐，愈傷組織顏色和生長(zhǎng)狀態(tài)普遍不如正交試驗(yàn)(1)的健康(圖1，a-d)。綜合以上分析，白頭翁消毒的最佳方案應(yīng)為正交試驗(yàn)(1)的A2B2C1或A2B2C3。

注：圖a、b、c依次為正交試驗(yàn)(1)組合A2B2C1、A2B2C3、A2B3C1培養(yǎng)25 d時(shí)愈傷組織狀態(tài)；圖d為正交試驗(yàn)(2)組合A2B1C2培養(yǎng)25 d時(shí)愈傷組織狀態(tài)；圖e、f分別為中葉柄和幼葉葉片培養(yǎng)45 d時(shí)愈傷組織狀態(tài)

2.4 兩組正交試驗(yàn)中不同外植體的消毒效果比較

正交試驗(yàn)具有整齊可比性，可對(duì)每一因素的各個(gè)水平間進(jìn)行比較，表8即兩組正交試驗(yàn)中外植體不同水平的消毒效果比較。可以看出，正交試驗(yàn)(1)中葉葉片出愈率顯著高于幼葉葉片和中葉葉柄，正交試驗(yàn)(2)中葉葉片出愈率顯著高于幼葉葉片和中葉葉柄，兩組試驗(yàn)的污染率均是中葉葉片最低，故中葉葉片為外植體最佳水平。3種外植體中，中葉葉柄的消毒效果最差，污染率最高，出愈率最低，材料培養(yǎng)過(guò)程中容易褐變，愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)，一般需要25～28 d，多在與葉片交接處形成少量愈傷組織，且愈傷組織顏色偏白色(圖1e)。幼葉葉片出愈率高于中葉葉柄，但耐消毒能力較差，材料消毒時(shí)易受傷變色，出愈慢，在培養(yǎng)25～28 d后愈傷組織才開(kāi)始出現(xiàn)且生長(zhǎng)緩慢(圖1f)，而中葉葉片是在培養(yǎng)7～10 d后即出現(xiàn)黃綠色胚性愈傷組織。

表8 不同外植體的消毒效果Tab. 8 Disinfection effect of different explants

3 討論

植株不同器官或部位的生理狀態(tài)及再生能力存在著明顯的差別[7]，一般較幼嫩的部位代謝旺盛，形態(tài)發(fā)生能力較強(qiáng)，愈傷組織誘導(dǎo)成功率較高，但這種類型外植體也容易受消毒劑的損傷。因此，選擇外植體時(shí)，需要在外植體對(duì)消毒劑的耐受力與再生能力之間取得平衡才能達(dá)到最佳的消毒效果。有研究表明，枇杷中度成熟葉是最佳的誘導(dǎo)材料[8]。劉江娜等[9]認(rèn)為，安祖花以中葉為外植體比幼葉存活率高。本研究選擇幼葉葉片、中葉葉片、中葉葉柄3種外植體與不同消毒劑的不同消毒時(shí)間進(jìn)行正交，結(jié)果發(fā)現(xiàn)幼嫩程度適中的中葉葉片為外植體最佳水平，其消毒效果最好，出愈快，愈傷量大，培養(yǎng)成功率最高。其次是幼葉葉片，中葉葉柄最差。幼葉葉片消毒時(shí)易受傷變褐，出愈量少。中葉葉柄污染率最高，一方面可能是因?yàn)槿~柄離地面近，且生長(zhǎng)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，帶雜菌多，另一方面可能是因?yàn)槠浔砻娣e小，消毒劑不易滲入。研究還發(fā)現(xiàn)葉柄形態(tài)學(xué)上端與葉片交接處更容易誘導(dǎo)成功。這與周麗麗等[10]的研究結(jié)果一致，可能是因?yàn)樵搮^(qū)域分生組織發(fā)達(dá)，輸導(dǎo)組織密集，內(nèi)源激素含量高的緣故?？傮w來(lái)說(shuō)，白頭翁葉片的消毒效果好于葉柄，誘導(dǎo)愈傷組織容易成功，而且葉片作為外植體材料來(lái)源豐富，更容易獲得。草本植物中，報(bào)道葉片為最佳外植體的文獻(xiàn)較多[10-12]，可能與葉片細(xì)胞排列疏松，誘導(dǎo)后易于脫分化有關(guān)。與同屬植物相比，本結(jié)果與廉玉姬等[5]對(duì)朝鮮白頭翁的研究結(jié)果不一致，朝鮮白頭翁葉柄的再生率高于葉片，不一致的原因可能是不同種之間存在差異，也可能是選取葉片幼嫩程度不同所致。

植物組織培養(yǎng)中，外植體常用的消毒劑有氯化汞(升汞)、次氯酸鈉、酒精和過(guò)氧化氫等，其中升汞的消毒效果極佳，在組培實(shí)踐中應(yīng)用最為廣泛[13]，但其毒性大，易殘留，環(huán)境污染風(fēng)險(xiǎn)高，購(gòu)買和使用受到嚴(yán)格管控[14]。尋找一種高效安全、環(huán)境友好的消毒藥劑成為外植體消毒的必然要求。本研究?jī)山M正交試驗(yàn)結(jié)果均顯示，除外植體因素外，次氯酸鈉消毒時(shí)間是影響白頭翁消毒效果的關(guān)鍵因素，對(duì)白頭翁葉片而言，次氯酸鈉和酒精搭配可以達(dá)到最佳消毒效果，不僅可以有效控制污染率，還能最好地保證愈傷組織的誘導(dǎo)，低毒友好的次氯酸鈉完全可以替代升汞，成為白頭翁葉片消毒的首選藥劑。這與謝羽等[15]、喻娜[16]的研究結(jié)論一致。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，20% 過(guò)氧化氫容易使材料受傷褐變，出愈率降低，可能是因?yàn)闈舛冗^(guò)高所致，這與喻娜[16]對(duì)旱半夏葉柄消毒的研究、楊晨星等[17]對(duì)大巖桐葉片消毒的研究結(jié)果相似，他們的研究報(bào)道均表明，使用過(guò)氧化氫消毒時(shí)，材料褐化較嚴(yán)重。

綜上所述，河南大別山野生白頭翁組織培養(yǎng)的最佳外植體為幼嫩程度適中的中葉葉片，影響消毒效果的最關(guān)鍵因素是外植體類型，2%的次氯酸鈉和75%酒精搭配可以達(dá)到最佳消毒效果。但是，試驗(yàn)并未對(duì)次氯酸鈉及過(guò)氧化氫不同濃度梯度和不同消毒時(shí)間的搭配進(jìn)行研究，這也是接下來(lái)要研究的方向。