miR-146a在子癇前期患者中的表達及臨床意義

謝潔，裴廣麗，葉元華

近年來，子癇前期(preeclampsia，PE)作為在妊娠過程中導致圍產(chǎn)期高發(fā)病率和高死亡率的主要并發(fā)癥之一[1]，以出現(xiàn)進行性高血壓、水腫、蛋白尿等并發(fā)癥為主要特征，PE程度嚴重的還可能出現(xiàn)臟器(肝、腎臟)退化、胎盤功能障礙甚至發(fā)生母體腦退化[2]，后果十分嚴重。因此，對于PE的發(fā)病原因一直以來都是研究的重點，然而具體的緣由及機制仍然不是十分清楚[3]，綜合目前的研究成果，相關家族病史、糖尿病、肥胖、患有不育癥或有卵母細胞捐贈等被列為PE的誘因[4]。臨床上對PE的診斷主要依靠患者的相關癥狀和體征，其中臨床的相關癥狀主要包括出現(xiàn)腹痛、胎動減少、視力模糊、高血壓等，因此孕期對胎兒健康的實時監(jiān)測和評估尤為重要[5]。因為其發(fā)病機制尚不明確[6]，目前很少有干預措施能夠有效預防和治療該疾病，分娩是唯一已知的有效治療方法[7]，因此迫切需要研究和探索新的治療靶點以預防和治療PE。

作為高度保守且在轉(zhuǎn)錄后參與調(diào)控基因表達的小分子非編碼RNA，miRNAs可能參與大約60%的基因(哺乳動物)的調(diào)控[8]，細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等各種生理過程都有miRNAs的參與[9]。人類胎盤中也存在大量的miRNAs表達，有證據(jù)表明它們可能參與妊娠相關疾病的病理進程，多項報道證實PE患者的胎盤組織中出現(xiàn)多種差異miRNAs[10]。這些證據(jù)表明，miRNA在PE的發(fā)病機制中發(fā)揮了重要作用，并可能成為潛在的治療靶點。本研究通過觀察患者miR-146a和氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,OXLDL)水平的變化，探索miR-146a在PE中的作用機制及其臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取臨沂市中醫(yī)醫(yī)院2019年10月至2020年9月收治的PE患者24例作為PE組，另選取同期于本院分娩的24例健康妊娠婦女作為對照組，對照組年齡20～36歲，孕周36～39周。PE組年齡22～36歲，孕周35～39周。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，詳見表1。納入標準：① PE患者符合《婦產(chǎn)科學》第八版中的診斷標準[11]；② 具備基礎文字閱讀和書寫能力，患者及家屬均同意并簽署相關協(xié)議。排除標準：① 多胎妊娠及人工受孕；② 患者伴有心臟、肝臟、腎臟、肺等并發(fā)癥；③ 患者伴有心理和精神疾??；④ 年齡大于40歲。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗材料與儀器 RNA提取試劑盒；二甲苯；無水乙醇；碧云天BCA蛋白測定試劑盒；OXLDL抗體(orb110361 )；GAPDH抗體(AP0063)；山羊抗兔二抗(BE0101)；經(jīng)過消毒的研缽、凍存管；Mini-10K+C迷你離心機；Thermo fisher nanodrop分光光度計；JY02S紫外分析儀；Applied Biosystems熒光定量PCR儀；Millipore PVDF膜；醫(yī)用X射線膠片；酸性定影粉、顯影粉；電泳儀、固定夾、電泳槽和轉(zhuǎn)移槽；搖床。

1.2.2 樣品收集 胎盤從母體娩出后5 min內(nèi)收集組織，注意避開出血點,用專門洗凈消毒的剪子小心剪取小塊組織，用鑷子放入提前備好的凍存管，迅速放入液氮罐，經(jīng)過一夜后第二天轉(zhuǎn)入-80℃冰箱，儲藏用于后續(xù)研究。

1.2.3 熒光定量PCR 從冰箱取出胎盤組織(n=10)，按照試劑盒說明對所取樣本中的總RNA進行提取，之后對其進行質(zhì)量檢測：① 測定RNA濃度，分光光度計(NanoDrop? ND-2000)測量前先用DEPC水進行調(diào)零。濃度計算：A260×40 ng/uL(260 nm處讀值為1表示40 ng RNA/uL)，詳見下頁表2。② 純度評估：對溶液RNA純度檢測方法采用A260/A280的比值法，參照比值范圍1.8～2.1。NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索miR-146a和U6基因序列，然后采用Primer Premier 5.0軟件設計相關引物，相關引物由生物技術公司合成(詳見下頁表3)。接下來，進行反轉(zhuǎn)錄：取500 ng的總RNA，加入反轉(zhuǎn)錄引物，接下來進行Realtime-PCR反應分析。

表1 兩組患者臨床資料比較

表2 RNA濃度測定

表3 miR-146a和U6引物序列

1.2.4 蛋白質(zhì)免疫印跡 從凍存的胚胎組織(每組n=10)中提取總蛋白，然后采用BCA法測定各組織中蛋白濃度(Beyotime生物技術研究所，中國上海)(詳見表4)，并調(diào)整各組蛋白濃度達到相同。采用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠對提取的蛋白質(zhì)(30 ng)進行電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。膜用5%脫脂奶粉孵育2 h，用Tween 20 (TBST) Tris緩沖生理鹽水清洗，加入以下一抗：OXLDL(稀釋1∶1 000)；GAPDH(稀釋1∶5 000)。然后用TBST溶液清洗膜3次(5 min/time)，用抗兔二抗(稀釋1∶10 000)孵育1 h。經(jīng)電化學發(fā)光溶液處理后，在暗室曝光，室溫自然干燥，保存掃描結(jié)果。

表4 BCA法蛋白濃度測定

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物擴增與溶解曲線

miR-146a和U6的擴增曲線(循環(huán)數(shù))平緩，miR-146a在大約18個循環(huán)達到平臺期，U6則在大約16個循環(huán)達到(見圖1、圖2)，此外，miR-146a與U6的溶解曲線展現(xiàn)出引物的特異性較好。

2.2 miR-146a水平測定結(jié)果

RT-PCR對胎盤組織RNA檢測的結(jié)果表明，對照組和PE組胎盤組織中miR-146a均有表達，miR-146a在PE組胎盤組織中的表達比對照組高(0.442±0.148)倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

2.3 miR-146a的靶點預測以及OXLDL蛋白水平測定

首先運用在線預測數(shù)據(jù)庫TargetScan預測到miR-146a與氧化低密度脂蛋白受體1(OLR1)有結(jié)合位點(見下頁圖4A)。用蛋白質(zhì)免疫印跡(WB)對PE組及對照組OXLDL的表達進行驗證，PE組OXLDL表達高于對照組(見下頁圖4B)，且定量分析結(jié)果表明兩組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見下頁圖4C)。

圖1 miR-146a基因?qū)崟r擴增曲線圖及產(chǎn)物溶解曲線圖

圖2 U6基因?qū)崟r擴增曲線圖及產(chǎn)物溶解曲線圖

注：*P<0.05表示與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義。

3 討論

PE由于其發(fā)病的復雜性被定義為一種多系統(tǒng)的疾病，其臨床診斷主要為出現(xiàn)高血壓、蛋白尿等并發(fā)癥，容易造成圍手術期疾病、相關孕產(chǎn)婦疾病甚至是產(chǎn)婦死亡，然而到目前為止，PE的發(fā)病機制及預防、治療措施等尚未完全闡明[12]。在胎盤形成過程中，滋養(yǎng)細胞的入侵和增殖、血管生成和免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)都是關鍵環(huán)節(jié)，有研究表明，這些環(huán)節(jié)會因為miRNAs的上調(diào)或下調(diào)而受到不同程度的控制[13]，因此PE的特征基因譜和miRNA差異表達譜的挖掘?qū)τ陉U明PE的進展意義非凡，有助于篩選出相關生物標志物為PE提供新的預防和治療靶點[14]。

注：*P<0.05表示與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義。

miRNA是一種小的大約22個核苷酸長度的非編碼RNA分子，在許多物種中廣泛存在并具有調(diào)節(jié)生理進程的作用。miRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達主要通過基因表達抑制或者直接促進基因的mRNA降解，其具體的調(diào)控機制在很大程度上會受到miRNA與其mRNA靶點互補程度的控制。miRNA與mRNA靶點的部分互補也可以調(diào)控基因翻譯的程度，這就出現(xiàn)了單個miRNA可能會具備調(diào)控很多基因的能力[15]。通過對miRNA的靶mRNA的負調(diào)控，會對細胞的增殖、分化、凋亡和壞死等生理進程產(chǎn)生影響[16]。多個研究小組進一步鑒定了一些胎盤miRNA的異常表達，這些miRNA的異常表達與子宮內(nèi)環(huán)境或產(chǎn)婦狀態(tài)的紊亂有關。這些發(fā)現(xiàn)引起了人們對miRNA參與胎盤基因調(diào)控的興趣，以及發(fā)現(xiàn)胎盤miRNA作為PE和相關疾病的臨床生物標志物的可能用途的興趣。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a與孕婦胎盤中(因胎兒畸形進行流產(chǎn)治療)的有害物質(zhì)積累顯著相關[17]，此外懷孕期間有吸煙習慣的孕婦胎盤中的miR-146a出現(xiàn)顯著的變化[18]。在本研究中，我們通過RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)PE患者胎盤組織中miR-146a表達顯著升高，表明miR-146a可能在PE的治療中發(fā)揮作用。

PE中會出現(xiàn)內(nèi)皮功能障礙，其具體發(fā)病機制中有氧化應激(增強)的參與，有證據(jù)表明OXLDL (循環(huán)氧化LDL)和Ab-oxLDL(OXLDL抗體)參與了動脈粥樣硬化疾病進程[19]，且在PE病程中，減少胎盤中OXLDL受體表達可能上調(diào)OXLDL濃度[20]。通過TargetScan在線數(shù)據(jù)庫進行預測發(fā)現(xiàn)miR-146a可能與OXLDL受體結(jié)合，進而調(diào)控OXLDL表達水平。在本研究中，為了對預測結(jié)果進行進一步驗證，我們通過WB對OXLDL蛋白表達水平進行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PE患者的胎盤組織中OXLDL表達升高，進一步進行定量分析兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義。這一結(jié)果表明miR-146a可能通過靶向OXLDL受體對OXLDL水平進行調(diào)控，進而干預PE疾病進程。通過這一發(fā)現(xiàn)，可以在后期對PE疾病的進一步研究中，探討過表達miR-146a通過靶向受體降低OXLDL蛋白的表達進而改善PE疾病。

在PE的病程中，滋養(yǎng)細胞的侵襲會出現(xiàn)一定程度的異常，例如未能正常侵入子宮、淺層滋養(yǎng)細胞出現(xiàn)浸潤、侵襲性滋養(yǎng)細胞數(shù)量減少、螺旋動脈轉(zhuǎn)換障礙等。在這項研究中，我們證明了miR-146a在PE患者胎盤組織中表達升高，且可能通過靶向相關受體調(diào)控OXLDL水平。但是，本研究仍然存在一些局限：其一，收集的樣本是分娩后的妊娠晚期胎盤，不能代表妊娠早期胎盤。因此，我們實驗中顯示的變化可能并不完全代表胎盤的發(fā)育變化；其二，我們通過在線數(shù)據(jù)庫預測了miR-146a與OXLDL受體的靶向關系，雖然測定了OXLDL蛋白的表達情況，但還應該通過免疫組織化學等實驗確認miR-146a與OXLDL受體的靶向關系；其三，我們只對胎盤組織樣本的miR-146a和OXLDL蛋白水平進行了測定，沒有分離滋養(yǎng)層細胞進行miR-146a對其細胞增殖、凋亡、分化、浸潤等進程產(chǎn)生影響研究，因此本研究應進一步論證以突破以上局限性。

綜上所述，本研究結(jié)果表明miR-146a在PE患者胎盤組織中表達升高，可能是作用于OXLDL受體抑制OXLDL阻斷節(jié)點信號。miR-146a在胎盤中的表達升高可能導致PE發(fā)病機制中節(jié)點受體—OXLDL信號通路的過度激活，這一發(fā)現(xiàn)可能是一種潛在的阻斷節(jié)點信號通路的治療策略。