地衣芽胞桿菌發(fā)酵合成L-酪氨酸以及莽草酸途徑代謝節(jié)點的研究

許銀彪,李由然,石貴陽*

1(糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122) 2(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)

芳香族化合物被廣泛用作生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品的原材料,如聚合物、食品添加劑和藥品,或者用作生物燃料,如2-苯基乙醇[1]。芳香族氨基酸是典型的芳香族化學物質,通過微生物莽草酸途徑產(chǎn)生。在該途徑中,從共同的前體磷酸烯醇式丙酮酸和四磷酸赤蘚糖經(jīng)分支酸產(chǎn)生L-苯丙氨酸、L-色氨酸和L-酪氨酸[2]。由于在藥物和工業(yè)中的廣泛應用,酪氨酸已引起了廣泛的關注,并被用于生產(chǎn)食品添加劑[3],芐基異喹啉生物堿[4]、阿片類藥物[5]和柚皮苷[6]。除此之外,L-酪氨酸還可用于帕金森氏病藥物左旋多巴[7]和芳香族聚合物黑色素[8]的合成。

迄今為止,科研工作者已對多種微生物進行了酪氨酸合成的改造,谷氨酸棒桿菌[9]、球形雙節(jié)桿菌[10]、乳鐵短桿菌[11]和大腸桿菌[12]。其中,大腸桿菌相關的酪氨酸合成研究較為詳細。盡管在過去40年中對莽草酸途徑進行了大量研究,但是酪氨酸的高效合成仍然具有很大的挑戰(zhàn)[13-14]。在大腸桿菌合成酪氨酸的研究中,工作主要集中于影響芳香族氨基酸生物合成的轉錄調(diào)節(jié)子tyrR,3-脫氧-7-磷酸庚酮酸合酶(AroGfbr,D146N),預苯酸脫氫酶(TyrAfbr,M53I/A354V),莽草酸脫氫酶(YidB),莽草酸激酶I(AroK)和莽草酸激酶II(AroL)[14-15]。有學者首先將aroGfbr和tyrAfbr基因克隆到低拷貝質粒,并轉化入敲除tyrR的大腸桿菌K12中,在發(fā)酵過程中可產(chǎn)生0.346 g/L的L-酪氨酸,且aroGfbr,tyrAfbr,ydiB和aroK的組合過表達可以產(chǎn)生0.27 g/g DCW[15-16]。JUMINAGA等[17]通過將整個生物合成途徑集中在2個質粒上,并改變質?？截?強啟動子替換,優(yōu)化基因密碼子和在基因前添加操縱子來解除瓶頸,酪氨酸產(chǎn)量達到2.17 g/L。KIM等[18]優(yōu)化了一種質粒系統(tǒng)和DO-stat補料方法,通過在tyrP敲除菌中共表達aroGfbr,aroL和tyrC,合成了43.14 g/LL-酪氨酸。地衣芽胞桿菌是一種安全的革蘭氏陽性菌,已被用作生產(chǎn)多糖生物絮凝劑[19]、聚-γ-谷氨酸[2,20]、抗菌肽[21]和堿性蛋白酶[22]。先前研究已實現(xiàn)了地衣芽胞桿菌代謝合成酪氨酸,并找出了酪氨酸合成的主要瓶頸問題[23]。

本研究對酪氨酸合成進行了發(fā)酵優(yōu)化,并進一步探討了地衣芽胞桿菌莽草酸途徑的影響因素,通過以下4個方面對地衣芽胞桿菌合成酪氨酸進行了闡述：(1)碳源、溫度以及溶氧;(2)vgb基因過表達;(3)莽草酸途徑節(jié)點基因不同組合方式;(4)莽草酸補加。該研究為進一步實現(xiàn)地衣芽胞桿菌高效合成酪氨酸提供理論依據(jù)和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

本研究中所使用的菌株、質粒如表1所示。

表1 本研究所用的菌株及質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 主要儀器與試劑

L-酪氨酸標品,上海源葉生物科技有限公司;胰蛋白胨、酵母提取物,Oxoid公司;限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶,美國Thermo Fisher公司;2×Taq PCR Master Mix,杭州寶賽公司;質粒DNA提取試劑盒、DNA純化試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、RNA提取試劑盒,康寧生命科學有限公司(上海);卡那霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素,Sigma公司;其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g,酵母粉5 g,NaCl 10 g,蒸餾水1 L,固體LB培養(yǎng)基需加入20 g/L的瓊脂粉。LX發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30 g,蛋白胨FP321 20 g,酵母粉FM408 10 g,玉米漿干粉5 g,K2HPO4·3H2O 9.12 g,KH2PO41.36 g,CaCl20.50 g,MgSO4·7H2O 0.50 g,(NH4)2HPO410 g,蒸餾水1 L。菌株構建和發(fā)酵過程中,培養(yǎng)基中添加的氨芐青霉素、卡那霉素、四環(huán)素終質量濃度分別為100、30、20 mg/L。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞生長、乳糖消耗和莽草酸含量檢測

為了檢測生物量的增長,不同時間點收集1 mL發(fā)酵液在12 000×g下離心5 min,去除上清液,細胞沉淀用9 g/L NaCl溶液洗滌并重懸于等體積的水中。分光光度計測定600 nm下吸光值,確保稀釋樣品OD600讀數(shù)為在0.3～0.8。日立高效液相示差檢測器測定乳糖濃度[16]和紫外檢測器210 nm下測定莽草酸濃度[24],液相色譜柱為Shodex SUGAR SH1011色譜柱(300 mm×8 mm),上清液使用終質量濃度50 g/L三氯乙酸4 ℃處理于3 h并12 000×g下離心20 min。將500 μL上清液加入液相瓶中,流動相為10 mmol/L H2SO4,流速為0.8 mL/min,持續(xù)25 min。

1.2.2 RT-PCR引物的設計和擴增效率檢測

RT-PCR引物由Beacon Designer 7.0 軟件設計(http://www.premierbiosoft.com/molecular_beacons/index.html),引物序列如表2所示。

表2 本研究熒光定量PCR所用引物Table 2 Primers for qRT-PCR in this study

RT-PCR產(chǎn)物的特異性通過高分辨率凝膠電泳分析,反應得到單一產(chǎn)物所需的長度。引物擴增效率值按公式(1)計算[25]：

(1)

式中：E,引物擴增效率值;k,標準曲線斜率。不同基因引物擴增效率值：aroA,1.95;aroB,1.91;aroC,1.96;aroD,1.94;aroE,1.96;aroF,1.96;aroK,2.00;aroH,1.98;tyrA,1.99;hisC,1.91;rpsE,2.01。

1.2.3 莽草酸途徑轉錄水平分析

重組菌細胞4 ℃,12 000×g下離心1 min。去除上清液,細胞使用冰水洗滌3次,然后使用RNAprep純細胞/細菌試劑盒(天根,中國)提取總RNA并使用QUAWELL Q5000(上海)檢測RNA濃度。根據(jù)操作手冊,用gDNA Eraser(TaKaRa,日本)處理后總RNA作為模板。根據(jù)操作手冊,使用PrimeScriptTMRT試劑盒(TaKaRa,日本)在42 ℃下合成cDNA。將cDNA稀釋至200 ng/μL并進行下一步的RT-PCR。使用SYBR?Premix Ex TaqTMII(TaKaRa,日本)將上述cDNA與合適的引物混合用于定量RT-PCR并使用CFX96檢測系統(tǒng)(Bio-Rad,美國)進行實時定量檢測。PCR條件：95 ℃,30 s;95 ℃,5 s和60 ℃,30 s,40個循環(huán)。rpsE作為內(nèi)參基因[23]并使用PFAFFL[25]提出的模型進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4L-酪氨酸分析

將發(fā)酵液樣品以1∶1的體積比用2 mol/L HCl處理,以確保L-酪氨酸完全溶解,然后4 ℃下12 h后將處理液以12 000×g離心20 min,將總體積為500 μL的上清液加入到液相瓶中。上清液通過HPLC(Agilent 1260系列;Agilent Technologies,USA)分析,使用鄰苯二甲醛3-巰基丙酸衍生化,并通過二極管陣列檢測器使用ODS HYPERSIL色譜柱(4.6 mm×250 mm,3.5 μm)檢測。流動相由溶劑A和溶劑B組成。溶劑A是5 g/L乙酸鈉溶液,用2%乙酸調(diào)整pH值為7.2。溶劑B(1 L)由5 g乙酸鈉,400 mL甲醇和400 mL乙腈,200 mL超純水組成,用5%的乙酸將其調(diào)整至pH 7.2。檢測方法：0 min,92%溶劑A+8%溶劑B,流速1 mL/min;27.5 min,40%溶劑A+60%溶劑B,流速1 mL/min;31.5 min,100%溶劑B,流速1.5 mL/min;32 min,100%溶劑B,流速1.5 mL/min;34 min,100%溶劑B,流速1 mL/min;35.5 min,92%溶劑A + 8%溶劑B,流速1 mL/min?？傔\行時間為40 min。用于檢測L-酪氨酸的檢測器波長為338 nm,帶寬為4 nm。

2 結果與分析

2.1 酪氨酸合成重組質粒構建

大腸桿菌來源的aroGfbr與tyrAfbr按照地衣芽胞桿菌密碼子偏好性進行密碼子優(yōu)化并送往公司合成(Synbio Technologies,中國)。aroGfbr與tyrAfbr優(yōu)化后基因核酸序列提交至NCBI,序列號分別為MK002699和MK002700。aroC、aroD和aroK通過PCR擴增于地衣芽胞桿菌基因組,片段大小分別為762、837和528 bp。將重組質粒A以及片段aroC、aroD、aroK以及aroGfbr分別使用BamH I與NheI雙酶切,按照1.2.2的方法構建了重組質粒AC、AD、AK和AG。與此同時,將不同強度啟動子連接至重組質粒AG,構建了重組質粒HAHG與HAPG。進一步將aroC、aroD與aroK分別連接至HAPG,構建了重組質粒HAPGC、HAPGD和HAPGK。將重組質粒HGHA中tyrAfbr的啟動子HpaII替換為啟動子P43以及在此基礎上分別串聯(lián)表達基因aroC、aroD、aroK以及aroL,成功構建了重組質粒HGPA、HGPAC、HGPAD、HGPAK、HGPAL。所有插入基因片段均經(jīng)公司測序正確,說明HGPA等12種酪氨酸合成重組質粒構建成功(如表1所示)。

2.2 碳源、溫度、溶氧以及接種量對酪氨酸合成的影響

為了更好地評價構建菌株,首先對發(fā)酵碳源以及發(fā)酵條件進行優(yōu)化。根據(jù)文獻報道,地衣芽胞桿菌發(fā)酵過程中在使用不同碳源情況下發(fā)酵結果差異性較大,在葡萄糖作為碳源時地衣芽胞桿菌生長比較旺盛,而利用乳糖更有利于合成儲存物質[26]。乳糖的添加可將地衣芽胞桿菌合成桿菌肽效價從960 U/mL提升至1 143 U/mL,提高了19%[27]。如圖1-a所示,在葡萄糖、蔗糖、乳糖以及木糖做為碳源時,發(fā)酵48 h時地衣芽胞桿菌合成酪氨酸單位菌體產(chǎn)量分別為20.10、22.98、31.05和5.15 mg/L。在使用乳糖作為碳源時,酪氨酸單位菌體產(chǎn)量較葡萄糖提高54%,說明乳糖作為碳源時更利于地衣芽胞桿菌合成酪氨酸。同時,地衣芽胞桿菌利用乳糖為碳源不會合成2,3-丁二醇,減少了碳源的損失。在后續(xù)重組菌評價過程中,選擇了乳糖作為地衣芽胞桿菌發(fā)酵碳源。在乳糖作為碳源條件下,對溫度、轉速以及接種量進行了初步優(yōu)化(圖1-b,1-c,1-d),確認最適的發(fā)酵條件為37 ℃、轉速200 r/min和3%接種量。在此條件下發(fā)酵120 h,重組菌HGPA最終合成酪氨酸單位菌體產(chǎn)量可以達到71 mg/L(圖2-a)。

2.3 vgb基因過表達對酪氨酸合成的影響

透明顫菌血紅蛋白(Vitreoscillahemoglobin,VHb)是一種由基因vgb編碼的同型二聚氧結合蛋白,可通過促進氧氣輸送來增強細菌在低氧環(huán)境下的呼吸和代謝;該蛋白具有自己的核糖體結合位點,已成功應用到各種異源細菌和真核生物中,以提高細胞密度、蛋白質合成和氧化代謝[28]。vgb基因過表達對左旋多巴合成具有促進作用,而左旋多巴的前體為酪氨酸[29]。因此vgb基因的過表達有可能可以促進酪氨酸的合成。將HGPA電轉入vgb基因整合菌株后經(jīng)驗證發(fā)現(xiàn),vgb基因的過表達可以將酪氨酸單位菌體產(chǎn)量從71 mg/L提升至100 mg/L,提升了40.8%(圖2-a)。該結果說明提升地衣芽胞桿菌的攝氧能力有助于酪氨酸的合成。

a-碳源;b-發(fā)酵溫度;c-發(fā)酵轉速;d-發(fā)酵接種量圖1 地衣芽胞桿菌發(fā)酵合成酪氨酸的碳源以及發(fā)酵條件優(yōu)化Fig.1 Optimization of carbon source and fermentation conditions in synthesizing L-tyrosine by B.licheniformis

a-酪氨酸合成;b-莽草酸途徑基因轉錄水平圖2 地衣芽胞桿菌過表達vgb基因對酪氨酸合成以及莽草酸途徑基因轉錄水平的影響Fig.2 Effect of overexpression of vgb gene on L-tyrosine synthesis and gene transcription level of shikimate pathway in B.licheniformis注：b虛線指示對照菌CICIM B6902莽草酸途徑基因轉錄水平

為了挖掘酪氨酸提升的因素,對原始菌與vgb整合菌進行了莽草酸途徑轉錄分析(圖2-b)。vgb重組菌中aroA,aroC,aroD,aroF以及aroH較原始菌分別提升了2.19,2.57,2.91,2.98和2.89倍。值得注意的是,vgb重組菌中aroK的表達水平較原始菌并沒有明顯的變化。先前文獻報道,地衣芽胞桿菌中aroC,aroD和aroK基因是酪氨酸合成的限速步驟并且在消耗葡萄糖的條件下過表達aroK可以提高酪氨酸的合成量[16]。vgb的表達以及莽草酸途徑基因的轉錄水平分析從另一角度證明了增強地衣芽胞桿菌攝氧能力可以提升胞內(nèi)aroC與aroD的表達水平,進而增強地衣芽胞桿菌合成酪氨酸的能力。同時,該結果表明aroC與aroD的表達與胞內(nèi)溶氧水平相關聯(lián)。但高溶氧條件并不是酪氨酸合成的最適條件(圖1-c),說明高溶氧條件可能會對其他酪氨酸合成關鍵代謝步驟起到抑制作用。

2.4 莽草酸途徑節(jié)點基因不同組合方式對酪氨酸合成的影響

將aroC,aroD,aroK以及aroGfbr與tyrAfbr共表達分別可以合成866,754,686和831 mg/L酪氨酸,比單獨表達tyrAfbr分別提升了68.7,53.4,85.8和93.8%(圖3-a)。由于過表達aroGfbr對酪氨酸提升幅度最大,研究通過改變aroGfbr啟動子來優(yōu)化其表達強度(圖3-b)。在AG質粒基礎上分別在aroGfbr基因錢端插入HpaII與P43兩種不同強度啟動子。在轉錄強度相對弱的啟動子HpaII下表達有利于酪氨酸的合成,產(chǎn)量達到1 089 mg/L。值得注意的是,在強啟動子P43下表達aroGfbr后,酪氨酸合成量急劇降低至97 mg/L。該情況可能是由于aroGfbr表達強度過高,導致后續(xù)代謝途徑堵塞并引起反饋抑制。為驗證該推測,在HAPG的基礎上分別過表達了aroC、aroD和aroK(圖3-c)。在表達aroD與aroK的情況下,酪氨酸分別有不同程度的回升。HAPGD與HAPGK的酪氨酸產(chǎn)量分別回升至1 062和319 mg/L,HAPGC依舊沒有酪氨酸合成。該結果證明了aroD和aroK為地衣芽胞桿菌合成酪氨酸的重要節(jié)點,aroGfbr表達強度過高會引起該途徑節(jié)點的堵塞。為了進一步提升酪氨酸合成量,在HGPA基礎上分別過表達了aroC、aroD、aroK以及大腸桿菌來源的aroL。其中aroC以及aroL并沒有起到促進酪氨酸合成的作用。HGPAD與HGPAK的酪氨酸合成能力類似,酪氨酸產(chǎn)量均可以達到1 200 mg/L(圖3-d)。

a-aroC、aroD、aroK以及aroGfbr分別與tyrAfbr串聯(lián)表達;b-aroGfbr的不同表達強度;c-在aroGfbr強表達下,aroC、aroD與aroK過表達;d-在tyrAfbr強表達下,aroC、aroD、aroK以及aroL過表達圖3 地衣芽胞桿菌中莽草酸途徑關鍵節(jié)點基因不同組合方式對酪氨酸合成的影響Fig.3 Effects of different combinations of key node genes in shikimate pathway on L-tyrosine synthesis by B.licheniformis

2.5 莽草酸補加對酪氨酸合成的影響

雖然HGPAD與HGPAK的酪氨酸合成比HGPA提升了14.1%,但是要遠低于AD與AK相對A的提升幅度(53.4%和85.8%)。據(jù)此,進一步分析了在不同莽草酸濃度情況下HGPA與HGPAK的酪氨酸合成狀況(圖4)。在發(fā)酵結束時,補加3 g/L莽草酸對HGPA與HGPAK的酪氨酸合成能力并沒有明顯的提升。當莽草酸質量濃度提升至5 g/L時,HGPA與HGPAK的酪氨酸合成分別可以達到1 311和1 490 mg/L。隨著莽草酸質量濃度提升至10 g/L,酪氨酸濃度不再提升,說明添加5 g/L莽草酸時,莽草酸途徑代謝流已經(jīng)處于飽和狀態(tài)。由此表明,aroD和aroK的過表達未能徹底解除節(jié)點代謝流的限制。地衣芽胞桿菌中存在調(diào)控該節(jié)點的機制并有待挖掘。

圖4 添加不同濃度莽草酸對酪氨酸合成的影響Fig.4 Effect of different concentrations of shikimic acid on the synthesis of L-tyrosine by B.licheniformis

3 結論與討論

本研究以地衣芽胞桿菌為研究對象,通過基因過表達,初步實現(xiàn)L-酪氨酸在地衣芽胞桿菌中的代謝合成。通過檢測碳源、溫度、轉速和接種量對L-酪氨酸產(chǎn)量的影響對發(fā)酵條件進行優(yōu)化,在添加乳糖,溫度37 ℃,轉速200 r/min和3%接種量的條件下,重組菌HGPA最終合成酪氨酸單位菌體產(chǎn)量可以達到71 mg/L,較優(yōu)化前提升77%。增強地衣芽胞桿菌攝氧能力可以提升胞內(nèi)aroC與aroD的表達水平,進而增強地衣芽胞桿菌合成酪氨酸的能力,酪氨酸單位菌體產(chǎn)量從71 mg/L提升至100 mg/L,提升了40.8%。在地衣芽胞桿菌中過表達aroGfbr,tyrAfbr,aroD或aroK,產(chǎn)物質量濃度可以達到1 200 mg/L。進一步通過體外莽草酸補給,L-酪氨酸合成量可以達到1 500 mg/L。地衣芽胞桿菌合成酪氨酸過程中,基因aroD和aroK是莽草酸途徑的關鍵瓶頸,基因的過表達并不能徹底解除節(jié)點代謝流的限制,該節(jié)點的其他調(diào)控機制有待進一步挖掘。