MicroRNA-99b-5p通過抑制成纖維細(xì)胞生長因子21表達(dá)促進心肌細(xì)胞肥大

陳麗文，郭 晶，陳澤潤，朱杰寧，徐金東，郭惠明，單志新，，，王 晟

（1.廣東省心血管病研究所//廣東省人民醫(yī)院//廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東廣州 510080；2.華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510006；3.南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510280）

近年來，我國心血管疾病引發(fā)的死亡率和發(fā)病率仍呈增長趨勢［1］。心肌肥厚是多種心血管疾病發(fā)生的病理基礎(chǔ)，主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞在長度和寬度上的改變，即心肌細(xì)胞肥大，而非數(shù)量上的增加［2］。心肌細(xì)胞發(fā)生病理性肥大時會出現(xiàn)心臟胎兒基因的重新激活和表達(dá)，如心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）以及β 肌球蛋白重鏈（β myosin heavy chain，β-MHC）等的編碼基因［3］。在心肌肥厚的早期階段，心肌收縮力增加是一種短期的適應(yīng)機制，而持續(xù)的刺激將導(dǎo)致適應(yīng)性不良的心臟重構(gòu)，并最終發(fā)展為心力衰竭［4］。目前，心肌肥厚及后續(xù)轉(zhuǎn)變?yōu)樾牧λソ叩拇_切分子機制尚未明確，有待進一步的研究證實。越來越多的研究表明微小RNA（microRNA，miRNA）參與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的肥大［5］。MicroRNA 通過與靶基因mRNA 結(jié)合，抑制靶基因的翻譯，進而發(fā)揮調(diào)節(jié)相關(guān)生物學(xué)過程的重要作用［6］。多種microRNA 可靶向調(diào)節(jié)與心臟疾病相關(guān)的基因表達(dá)［6-7］，如心肌特異性敲除miR-22 可減輕應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌肥厚［8］；miR-206 可被YAP 上調(diào)，并介導(dǎo)YAP 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大［9］。我們以往的研究證實miR-199a-3p 和miR-199b-5p 可分別通過結(jié)合Rb-1 和CDK9，發(fā)揮促進心肌細(xì)胞肥大的作用［10-11］。成纖維細(xì)胞生長因子21（fibroblast growth factor 21，F(xiàn)gf21）是一種可在多種的組織器官中表達(dá)并發(fā)揮多種起生物學(xué)功能的分泌蛋白［12］。有研究顯示在異丙腎上腺素誘導(dǎo)肥厚的小鼠心肌，增加Fgf21 表達(dá)能夠減輕小鼠心肌肥厚的發(fā)生，其可能機制是Fgf21 通過增加SIRT1 表達(dá)來減弱血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）誘導(dǎo)的心肌肥厚［13］，但Fgf21 發(fā)揮心臟保護作用的分子機制尚不完全清楚。我們的前期工作已證實circRNA_005647 可作為分子海綿吸附miR-99b-5p來抑制心肌細(xì)胞發(fā)生肥大［14］，但miR-99b-5p在心肌肥大中的具體作用機制尚不明確。本文旨在探討miR-99b-5p 對小鼠心肌細(xì)胞（neonatal mouse ventricular cardiomyocytes，NMVCs）肥大相關(guān)基因表達(dá)的促進作用，并闡明Fgf21 是否介導(dǎo)miR-99b-5p 發(fā)揮對心肌肥大表型的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

利用RT-qPCR 檢測并比較心衰（heart failure，HF）患者、健康器官捐獻(xiàn)者心肌組織標(biāo)本中miR-99b-5p 的表達(dá)水平。臨床患者組織樣本由廣東省心血管病研究所提供，開展的實驗均經(jīng)過廣東省人民醫(yī)院倫理委員會審批［批準(zhǔn)號No.GDREC201923 8H（R1）］，心衰及健康對照患者病例資料信息同以往報道［15］。

1.2 實驗動物

C57BL/6 乳小鼠（出生日齡1～3 d，雌雄不限）和8周的性成熟雄性C57BL/6小鼠由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，屬于無特定病原體級別動物。開展的動物實驗通過廣東省人民醫(yī)院倫理委員會審批［批準(zhǔn)號：粵醫(yī)科倫理2017015A 號］，實驗動物許可證號為SCXK（粵）2013-0034。

1.3 主要試劑

TRizol 總RNA 提取裂解液（Invitrogen）；逆轉(zhuǎn)錄試劑（TaKaRa）；miR-99b-5p、U6、Fgf21等序列引物（Invitrogen）；2× SYBR Green Pro Taq HS Premix（艾科瑞）；DMEM/F-12 無血清培養(yǎng)基、0.25%EDTA 胰蛋白酶（Gibco）、特級澳洲胎牛血清；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、Oligofectamine（Invitrogen）；miR-99b-5p mimic、Fgf21 siRNA、超氧化物歧化酶2（Superoxide dismutase，Sod2）siRNA（廣州銳博）；RIPA蛋白裂解緩沖液（碧云天）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（碧云天）；4×loading buffer、蛋白marker 26616（Thermo Fisher Scientific）；BCA 蛋 白濃度測定試劑盒；PVDF 膜（Whatman）；抗心房鈉尿肽抗體（Bioworld）；抗β 肌球蛋白重鏈抗體（Sigma）；抗FGF21 抗體（SAB 公司）；抗SOD2 抗體（Cell Signaling Technology）、抗GAPDH 抗體（Protein Technology）；螢光素酶活性檢測試劑盒（Promega）；抗氧化 劑N-Acetyl-L-cysteine（MCE 公司）等。

1.4 主要方法

1.4.1 原代乳小鼠心肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 取SPF級C57BL/6乳小鼠心臟于高壓滅菌后的PBS溶液中漂洗去除殘血，并修剪去除血管等其他組織，轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，加入0.25% EDTA 胰蛋白酶及PBS 溶液，于4 ℃搖床10 h。次日于裝有乳小鼠心臟的離心管加入完全培養(yǎng)基，放入37 ℃中溫浴10 min 停止消化。巴氏管將心臟吸至新的離心管，加入不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基及膠原酶Ⅱ，37 ℃中輕搖10 min。待組織吹散后加入完全培養(yǎng)基進行離心，用干凈PBS 溶液重懸下面一層的細(xì)胞后，經(jīng)濾網(wǎng)（70 μm 孔徑）過濾至新的離心管里后進行離心，重旋轉(zhuǎn)至培養(yǎng)瓶。1.5 h 后將瓶中的懸液吸出，分至細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)。

1.4.2 C57BL/6 小鼠橫向主動脈弓縮窄模型建立 利用橫向主動脈弓縮窄（transverse aortic restriction，TAC）法建立小鼠心肌肥厚模型。將小鼠置于誘導(dǎo)麻醉盒中，2%異氟烷吸入誘導(dǎo)麻醉，麻醉后仰臥位固定，以第二肋骨為中心剪開表皮，從第二肋骨與胸骨連接處剪開暴露主動脈弓，于無名動脈和左頸總動脈結(jié)扎主動脈弓，待小鼠情況穩(wěn)定后縫合，術(shù)后進行連續(xù)3周的觀察和飼養(yǎng)。

1.4.3 原代乳小鼠心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-99b-5p 和siRNA 將NMVCs 于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板穩(wěn)定培養(yǎng)后，在EP管中加入Oligofectamine（1.75 μL/孔）與無血清培養(yǎng)基混合，在另外的EP 管中加入mimic 或siRNA（100 nmol/L）與無血清培養(yǎng)基混合，將Oligo與mimic 或siRNA 輕輕混勻，靜置包裹15 min。將NMVCs 用PBS 緩沖液清洗后更換為含3 %血清的培養(yǎng)基，再加入包裹好的混合物，置于體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h。

1.4.4 Fgf21和Sod2重組腺病毒的構(gòu)建和包裝 參照已報道方法［16］，分別將小鼠Fgf21 和Sod2 基因編碼區(qū)序列定向插入pAd-Track-cmv 載體，并繼續(xù)進行后續(xù)的相應(yīng)重組腺病毒質(zhì)粒載體構(gòu)建和重組腺病毒的包裝及擴增。實驗時以rAd-GFP 作為對照組腺病毒（rAd-Fgf21、rAd-Sod2 和rAd-GFP 的MOI均是5）。

1.4.5 麥胚凝集素染色 麥胚凝集素（triticum vulgaris lectin，WGA）染色參照我們已報道的方法［15］，并略有改進。

1.4.6 實時熒光定量PCR TRIzol 法提取NMVCs或小鼠心肌組織總RNA，20 μL mRNA 逆轉(zhuǎn)錄體系中加入5×Prime Script RT Master Mix 4 μL 以及1.0 μg 總RNA 模板進行逆轉(zhuǎn)錄，獲得相應(yīng)的cDNA，以GAPDH 為內(nèi)參照檢測相關(guān)基因mRNA 表達(dá)水平。MiRNA 成熟體逆轉(zhuǎn)錄體系中加入5×PrimeScript RT Buffer、RT Enzyme Mix、miR-99b-5p RT 引物、U6 RT 引物，以1.0 μg總RNA為模板進行成熟體逆轉(zhuǎn)錄，獲得相應(yīng)產(chǎn)物用于檢測miR-99b-5p 表達(dá)水平。利用ViiA 7 Quantitative PCR System（Applied Biosystems）進行實時熒光定量PCR 并分析得到的實驗結(jié)果。計算相應(yīng)的2-ΔΔCt值，比較不同實驗分組間miR-99b-5p、Fgf21 以及肥大相關(guān)基因的表達(dá)水平。相應(yīng)的引物序列列于表1。

表1 PCR引物序列Table 1 The sequences of the primers for PCR

1.4.7 蛋白質(zhì)免疫印跡法 利用含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解緩沖液裂解細(xì)胞培養(yǎng)板中的NMVCs或小鼠心肌組織（組織需進行研磨）后，高速離心，測蛋白濃度。等質(zhì)量分裝蛋白后再與4×SDS loading buffer震蕩混勻，放入99 ℃進行變性10 min。按相應(yīng)的分組，將樣品加入凝膠梳孔中，電泳分出大小差異的蛋白。取出凝膠后，在電轉(zhuǎn)緩沖液中將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上。封閉后利用相應(yīng)的一抗［β-MHC（1：1 000）、ANP（1：1 000）、FGF21（1：2 000）、SOD2（1：1 000）、GAPDH（1：5 000）］孵育4 ℃過夜，TBST 液清洗后敷上相應(yīng)的二抗，1 h 后TBST再次清洗，即可進行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。

1.4.8 雙螢光素酶報告基因檢測 將Fgf21 的3’UTR 序列及其與miR-99b-5p 潛在的結(jié)合位點突變后的3’UTR序列分別構(gòu)建入pGL3-promoter載體中。在構(gòu)建好重組質(zhì)粒后，將相應(yīng)質(zhì)粒pGL3-promoter-Fgf21、pGL3-promoter-Fgf21-mut 以及miR-99b-5p mimic 與內(nèi)參照pRL-TK 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293 細(xì)胞中，24 h 后測定螢火蟲螢光素酶（FL）和海腎螢光素酶（RL）的活性。通過計算比較FL/RL比值的大小，判斷miR-99b-5p 與Fgf21 的結(jié)合作用。

1.4.9 鬼筆環(huán)肽染色 將原代乳小鼠心肌細(xì)胞于Confocal皿中培養(yǎng)，進行實驗干預(yù)后，用干凈PBS清洗。在血中加入40 g/L 多聚甲醛溶液進行固定。然后更換成PBS溶液，置于搖床上輕輕漂洗。接下來，配制0.1% TritonX-100 透化液，加入皿中透化處理細(xì)胞，再次漂洗。加入鬼筆環(huán)肽工作液后避光，細(xì)胞染色60 min。染色完成用PBS 洗后，加入含DAPI 封片劑，在4 ℃冰箱用錫箔紙避光保存，待激光共聚焦顯微鏡觀察心肌細(xì)胞形態(tài)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

圖像處理軟件Image J 分析蛋白條帶，利用GraphPad Prism8、SPSS 21.0 進行統(tǒng)計分析。計量資料結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較采用t檢驗；方差不齊的兩組數(shù)據(jù)比較用Welch’st檢驗；多組間比較采用單因素方差分析；采用Bonferroni校正的t檢驗進行組間兩兩比較。P＜0.05時，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MiR-99b-5p在發(fā)生肥厚的心肌中表達(dá)增加

與對健康捐獻(xiàn)者心肌相比，WGA 染色顯示心衰患者心肌細(xì)胞的橫截面積明顯增大（P＜0.001；圖1A），同時心衰患者心肌中miR-99b-5p 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05；圖1B）。我們將C57BL/6 小鼠分為假手術(shù)組（Sham）和TAC 手術(shù)組，并進行相應(yīng)的手術(shù)處理。WGA 染色顯示TAC 手術(shù)小鼠心肌細(xì)胞的橫截面積明顯增大（P＜0.01；圖1C），并且TAC手術(shù)小鼠心肌中miR-99b-5p水平顯著增加（P＜0.01；圖1D）。我們用AngⅡ進行處理NMVCs，建立心肌細(xì)胞肥大模型。鬼筆環(huán)肽染色顯示，AngⅡ處理的NMVCs 細(xì)胞明顯增大（P＜0.05；圖1E），RT-qPCR 結(jié)果顯示發(fā)生肥大的NMVCs 中miR-99b-5p水平顯著上調(diào)（P＜0.01；圖1F）。

圖1 miR-99b-5p在肥厚心肌中表達(dá)增加Fig.1 Upregulation of miR-99b-5p in the hypertrophic myocardium

2.2 MiR-99b-5p 促進原代乳小鼠心肌細(xì)胞中肥大相關(guān)基因表達(dá)

鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-99b-5p mimic 的NMVCs 細(xì)胞面積明顯增大（P＜0.05；圖2A）。RT-qPCR 和Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-99b-5p mimic的NMVCs中肥大相關(guān)基因Myh7和Anp 表達(dá)顯著增加（P＜0.01 或P＜0.001；圖2B、2C）。

圖2 miR-99b-5p促進NMVCs中心肌肥大相關(guān)基因表達(dá)Fig.2 MiR-99b-5p enhances hypertrophy-related gene expression in NMVCs

2.3 MiR-99b-5p靶向Fgf21發(fā)揮促進NMVCs中心肌肥大相關(guān)基因表達(dá)的作用

生物信 息學(xué)分 析（https：//www.mirbase.org/；https：//starbase.sysu.edu.cn/）結(jié)果提示Fgf21 基因的3’UTR 存在與miR-99b-5p 潛在結(jié)合的位點（圖3A）。進一步的雙螢光素酶報告基因?qū)嶒炞C實miR-99b-5p與Fgf21 3’UTR間結(jié)合作用，經(jīng)單因素方差分析，四組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=4.976，P=0.011 7），采用Bonferroni 法進一步作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)miR-99b-5p 與Fgf21 3’UTR 間存在特異結(jié)合作用（P＜0.01），而突變3’UTR 的相應(yīng)結(jié)合序列后，miR-99b-5p 則不能降低螢光素酶的活性（圖3B）。RT-qPCR 結(jié)果顯示，F(xiàn)GF21 mRNA 在心衰病人心肌中表達(dá)降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖3C），而Fgf21 mRNA 在TAC 手術(shù)誘導(dǎo)肥厚的小鼠心肌中表達(dá)顯著降低（P＜0.05；圖3D）。轉(zhuǎn)染miR-99b-5p mimic 可在RNA 和蛋白水平抑制NMVCs 中Fgf21表達(dá)（P＜0.01；圖3E，3F）。

Western blot 結(jié)果顯示，F(xiàn)gf21 siRNA 和miR-99b-5p mimic 可一致性地增強NMVCs 中β-MHC和ANP蛋白表達(dá)（P＜0.000 1；圖3G）。而利用腺病毒介導(dǎo)在NMVCs 過表達(dá)Fgf21 可顯著抑制NMVCs中肥大相關(guān)基因Myh7 和Anp 表達(dá)（P＜0.001），并逆轉(zhuǎn)miR-99b-5p對心肌細(xì)胞肥大相關(guān)基因表達(dá)的促進作用（P＜0.0001；圖3H）。

圖3 miR-99b-5p靶向Fgf21發(fā)揮促進NMVCs中心肌肥大相關(guān)基因表達(dá)作用Fig.3 Fgf21 mediates the pro-hypertrophic effect of miR-99b-5p on NMVCs

2.4 Fgf21/Sod2 軸介導(dǎo)miR-99b-5p促進NMVCs中心肌肥大相關(guān)基因表達(dá)作用

Western blot 結(jié)果顯示，ROS 抑制劑NAC 與Fgf21 能一致地有效逆轉(zhuǎn)miR-99b-5p 促心肌細(xì)胞肥大的作用（P＜0.01 或P＜0.001；圖4A）。利用腺病毒介導(dǎo)過表達(dá)Fgf21 和Sod2 均能顯著抑制NMVCs 中β-MHC 和ANP 表達(dá)（P＜0.01），并且Fgf21 可增加NMVCs 中SOD2 表達(dá)（P＜0.05 或P＜0.000 1；圖4B）。用siRNA 敲減Fgf21 的NMVCs 中SOD2 表達(dá)顯著降低（P＜0.000 1），而沉默F(xiàn)gf21 和Sod2 表達(dá)則可與miR-99b-5p mimic 一致地促進NMVCs 中β-MHC 和ANP 的表達(dá)（P＜0.05 或P＜0.01；圖4C）。

圖4 Fgf21/Sod2軸介導(dǎo)miR-99b-5p促進NMVCs中心肌肥大相關(guān)基因表達(dá)作用Fig.4 Fgf21/Sod2 axis mediates the pro-hypertrophic effect of miR-99b-5p on NMVCs

3 討論

在本文中，我們證實miR-99b-5p 在心力衰竭患者心肌、TAC 誘導(dǎo)的小鼠心肌以及AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥厚細(xì)胞模型中均表達(dá)增強，提示miR-99b-5p 可能參與心肌肥厚的過程。功能實驗的結(jié)果證實轉(zhuǎn)染miR-99b-5p可特異增加小鼠心肌細(xì)胞面積和心肌肥大相關(guān)基因表達(dá)，具有促進心肌細(xì)胞肥大的作用。本研究明確了介導(dǎo)miR-99b-5p發(fā)揮促心肌細(xì)胞肥大作用的下游靶基因，為闡明circRNA_005647 通過結(jié)合miR-99b-5p 來抑制心肌細(xì)胞肥大的作用機制提供科學(xué)依據(jù)。

已有研究顯示miR-99b-5p參與人成骨細(xì)胞增殖、骨關(guān)節(jié)炎以及非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移等過程［17-19］，但尚未見miR-99b-5p參與心肌細(xì)胞相關(guān)表型調(diào)控的報道。我們通過miRNA 數(shù)據(jù)網(wǎng)站的TargetScan、miRanda 和PicTar 等軟件共同預(yù)測到Fgf21 是miR-99b-5p 的潛在靶基因，鑒于已有報道顯示Fgf21 可以調(diào)控miR-143［20］和miR-27b［21］發(fā)揮調(diào)節(jié)心血管疾病進程的作用，但尚未見有關(guān)miRNA 調(diào)控Fgf21表達(dá)的報道，因而本文擬探討miR-99b-5p 是否可通過調(diào)節(jié)Fgf21 表達(dá)發(fā)揮促進心肌細(xì)胞肥大作用。本文通過雙螢光素酶報告基因?qū)嶒烇@示miR-99b-5p 可 與Fgf21 基因的3’UTR 特異結(jié) 合，并明確miR-99b-5p 可在轉(zhuǎn)錄水平抑制Fgf21 表達(dá)?；谛乃ゲ∪诵募『蚑AC 小鼠心肌中miR-99b-5p 和Fgf21 mRNA 表達(dá)的檢測結(jié)果也提示兩者在心肌肥厚過程中表達(dá)負(fù)相關(guān)。功能實驗證實在細(xì)胞水平敲減Fgf21 可與miR-99b-5p 一致性地抑制心肌細(xì)胞肥大表型，而過表達(dá)Fgf21 可有效逆轉(zhuǎn)miR-99b-5p的促心肌細(xì)胞肥大作用，因此Fgf21介導(dǎo)了miR-99b-5p 的促進心肌細(xì)胞肥大作用。本文上述結(jié)果與以往Fgf21 具有抑制心肌細(xì)胞肥大作用的報道相符［13］。

長時間的病理性刺激可加重心肌的氧化損傷，而氧自由基清除劑和抗氧化劑可以減輕氧化應(yīng)激所致的亞細(xì)胞功能缺損和心臟功能的降低［22］。已有研究證實Fgf21 可減輕心肌受到的氧化損傷作用［23］，因此本文試圖明確miR-99b-5p 是否通過靶向Fgf21 來調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激和肥大表型。我們發(fā)現(xiàn)抗氧化劑NAC 和過表達(dá)FGF21 均能一致抑制miR-99b-5p 的促心肌細(xì)胞肥大的作用，提示miR-99b-5p 通過增加氧化應(yīng)激途徑來促進心肌細(xì)胞肥大。既往研究表明，SOD2 是細(xì)胞線粒體內(nèi)中和超氧陰離子自由基（·O）的主要抗氧化酶，在維持正常心臟功能和抑制心肌肥厚表型中發(fā)揮重要作用［24-26］。已有報道Fgf21 可在mRNA 水平上促進抗氧化基因Sod2 表達(dá)［21］，而本文進一步在蛋白水平證實Fgf21可調(diào)控NMVCs中Sod2表達(dá)，并從功能上明確Fgf21/Sod2 軸介導(dǎo)了miR-99b-5p 的促心肌細(xì)胞肥大作用。

綜上，本文證實了miR-99b-5p 通過抑制其下游靶基因Fgf21，進而抑制其下游Sod2 基因表達(dá)來促進心肌細(xì)胞肥大。在后續(xù)的研究中，我們將繼續(xù)探討Fgf21/Sod2 軸介導(dǎo)miR-99b-5p 促心肌細(xì)胞肥大的分子機制，并在整體水平上明確Fgf21 介導(dǎo)miR-99b-5p 發(fā)揮促進心肌肥厚的作用機制。