法舒地爾通過Nrf2/ARE和NF-κB途徑對糖尿病周圍神經病變大鼠的作用*

吉桂芳 馬明梅 張靜雅 蓋祥云

(1.青海大學附屬醫(yī)院藥劑科，青海 西寧 810000；2.青海民族大學藥學院，青海 西寧，810007；3.青海大學附屬醫(yī)院靜脈配置中心，青海 西寧810000)

糖尿病周圍神經病變(Diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，常見的形式為糖尿病感覺運動多發(fā)性神經病和影響外周神經系統(tǒng)的感覺、運動和自主神經功能[1]。DPN的全球患病率為16%～66%[2]。目前，DPN的有效治療方法較少，藥物的治療效果受到許多因素，如嚴重的不良反應等。因此，還需繼續(xù)探索新的治療策略來治療DPN[3]。法舒地爾是目前唯一獲得臨床批準的Rho關聯(lián)卷曲螺旋蛋白激酶抑制劑，由于其強大的血管舒張功能，法舒地爾已被廣泛應用于血管痙攣性疾病，如蛛網膜下腔出血和缺血性心臟病[4]。目前已有研究[5]表明，法舒地爾可改善高血糖誘導的糖尿病小鼠心肌纖維化，抑制炎癥反應。目前，關于法舒地爾對DPN的作用尚不明確。有研究[6]表明，核因子紅系相關因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)通過調節(jié)抗氧化反應元件(Antioxidant response element，ARE)能夠刺激內源性抗氧化防御和解毒酶的產生從而調節(jié)神經性病變。核因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)是一種轉錄因子，能促進炎細胞因子的產生，從而參與DPN中炎癥反應的激活[7]。因此，本研究旨在探究法舒地爾對DPN及Nrf2/ARE和NF-κB通路的影響，以期為明確舒地爾對DPN的作用機制及開發(fā)新的DPN治療策略提供新的科學資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 法舒地爾購自天津紅日藥業(yè)股份有限公司，普瑞巴林購自重慶賽維藥業(yè)有限公司，鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司，丙二醛(MDA)測定試劑盒(TBA法)、還原型谷胱甘肽(GSH)測定試劑盒(分光光度法)和總超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(WST-1 法)購自南京建成生物工程研究所，IL-1β、IL-6和TNF-αELISA檢測試劑盒購自美國Biovision，BCA試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司，Nrf2抗體和HO-1抗體購自艾博抗(上海)貿易有限公司，p-p65抗體和p65抗體購自美國Cell Signaling Technology，GAPDH抗體購自北京義翹神州科技股份有限公司。

1.2 動物飼養(yǎng) 雄性清潔級SD大鼠60只，體質量220～250 g，在20～25℃、明暗交替(12 h/12 h)條件下飼養(yǎng)。所有大鼠自由飲水和進食。待大鼠適應環(huán)境1周后，進行分組造模及給藥處理。本研究符合動物倫理要求，并經醫(yī)院倫理委員會審核批準。

1.3 模型的建立及給藥處理 將60只SD大鼠隨機分為對照組、模型組、陽性對照組、法舒地爾低劑量組、法舒地爾高劑量組，每組各12只。依照參考文獻[8]建立DPN大鼠模型。模型組、陽性對照組、法舒地爾低劑量組、法舒地爾高劑量組大鼠用高脂飼料喂養(yǎng)6周，對照組大鼠用標準飼料喂養(yǎng)6周。6周后，除對照組外，其余組大鼠腹腔注射STZ(35 mg/kg)，對照組大鼠注射等量溶劑。72 h后，大鼠禁食禁水12 h，采集大鼠尾靜脈血，血糖儀檢測各組大鼠空腹血糖值，血糖值>16.7 mmol/L者即為糖尿病模型造模成功。對照組大鼠用標準飼料喂養(yǎng)，其余組大鼠用高脂飼料喂養(yǎng)。陽性對照組大鼠灌胃普瑞巴林(30 mg/kg)[9]；法舒地爾低劑量組和法舒地爾高劑量組分別灌胃法舒地爾(15 mg/kg和30 mg/kg)[10]，每天給藥1次，對照組和模型組灌胃生理鹽水，連續(xù)給藥8周后，進行大鼠行為學測試。

1.4 血糖檢測 給藥結束后，各組大鼠禁食不禁水12 h，測量各組大鼠體重。隨后用血糖儀檢測各組大鼠空腹血糖值。

1.5 熱板實驗 參考文獻[11]，采用Eddy熱板法檢測各組大鼠熱傷害性閾值。給藥結束后，將各組大鼠置于熱板儀內，熱板儀溫度(55±0.5)℃，記錄第一次反應(閃爍、舔后爪或跳躍)所需的時間，即為熱縮腿潛伏期(Thermal withdrawal latency，TWL)。截斷時間設為15 s，以避免組織損傷。

1.6 Von Frey實驗 參考文獻[12]，采用Von Frey法檢測各組大鼠機械性超敏反應，確定其對傷害性刺激的痛閾。給藥結束后，將各組大鼠轉移到高架鐵絲網籠子中，待大鼠適應環(huán)境20 min后，用 Von Frey壓力施加器對后肢足底中部施加持續(xù)增加的壓力刺激。用數字式壓力計記錄動物出現反應(縮爪或輕快抬起)的最大壓力，即為壓力-縮腿閾(Paw-Withdrawal Threshold，PWT)。

1.7 Randall Selitto實驗 參考文獻[13]，采用Randall-Selitto法測定機械性痛覺超敏(Mechanical allodynia，MWT)，確定機械性傷害閾值。給藥結束后，將各組大鼠固定后，用Randall-Selitto痛覺測試儀對后肢表面施加持續(xù)增加的壓力刺激，用數字壓力計記錄動物表現出反應(爪子縮回、吱吱叫或掙扎)的最大壓力，即為MWT。

1.8 神經傳導速度(Nerve conduction velocity，NCV)檢測 給藥結束后，3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定，隨后暴露右側坐骨神經。參考文獻[14]，采用雙極針電極(24G)對坐骨神經進行單次刺激(5V)。使用數據采集系統(tǒng)記錄M波和H波反射。人工記錄兩個刺激點之間的距離。運動神經傳導速度(Motor nerve conduction velocity，MNCV)(m/s)=距離/M波潛伏期，感覺神經傳導速度(Sensory nerve conduction velocity，SNCV)=距離/H波潛伏期。

1.9 HE染色檢測坐骨神經病理學變化 末次給藥結束后，3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈采血。取出坐骨神經，4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明。組織塊石蠟包埋，切片機切片。最后將切片置于溫箱中烘干。石蠟切片二甲苯、梯度酒精脫蠟至水，蒸餾水沖洗切片后，蘇木素染色液染色15 min，切片流水沖洗1 min，1%鹽酸乙醇分化3 s后，氨水返藍，伊紅染色液染色10 s后，流水沖洗。切片梯度酒精脫水、二甲苯脫水透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。

1.10 甲苯胺藍染色檢測坐骨神經軸突數量 取新鮮坐骨神經，10%甲醛液固定組織，常規(guī)脫水包埋。對包埋的組織塊進行修塊后，切片機切片。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。加入甲苯胺藍染色液，將切片置于60℃溫箱中孵育40 min。蒸餾水清洗切片后，1%鹽酸乙醇分化3 s，切片梯度酒精脫水、二甲苯脫水透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。

1.11 MDA、GSH和SOD含量測定 取坐骨神經，加入預冷提取液，制備組織勻漿。組織勻漿離心取上清液，根據MDA、GSH和SOD檢測試劑盒說明書所示，檢測上清液中MDA、GSH和SOD的含量。

1.12 IL-1β、IL-6和TNF-α含量測定 給藥結束后，腹主動脈采血，分離血清后，根據ELISA試劑盒說明書所示，測定血清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量。

1.13 Western blot檢測Nrf2、HO-1、p-p65和p65蛋白水平 取坐骨神經，加入液氮研磨，隨后加入含1 mmol/L苯甲基磺酰氟的RIPA裂解緩沖液，充分混勻后，冰上反應30 min。離心收集上清液，BCA試劑盒檢測上清液蛋白濃度。根據所測濃度，取30 μg蛋白加入凝膠上樣孔內，進行SDS-PAGE電泳和轉膜操作。5%脫脂奶粉室溫封閉3 h。隨后加入Nrf2抗體(1:1000)、HO-1抗體(1:1000)、p-p65抗體(1:2000)、p65抗體(1:1000)和GAPDH抗體(1:5000)，于4℃條件下孵育過夜。加入特異性二抗(1:5000)，室溫條件下孵育1 h后，凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶。Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度值。

2 結果

2.1 法舒地爾對DPN大鼠體質量和血糖水平的影響 與對照組相比，模型組大鼠體質量顯著降低(P<0.05)，血糖顯著升高(P<0.05)；陽性對照組、法舒地爾低劑量組和法舒地爾高劑量組大鼠體重和血糖水平與模型組相比差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)；法舒地爾高劑量組大鼠體重和血糖水平與法舒地爾低劑量組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體質量和血糖水平比較Table 1 Comparison of body weight and blood glucose level of rats in each group

2.2 法舒地爾對DPN大鼠行為學的影響 與對照組相比，模型組大鼠TWL、MWT和PWT顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、法舒地爾低劑量組、法舒地爾高劑量組大鼠TWL、MWT和PWT顯著升高(P<0.05)；與法舒地爾低劑量組相比，法舒地爾高劑量組大鼠TWL、MWT和PWT顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠行為參數的比較Table 2 Comparison of behavioral parameters of rats in each group

2.3 法舒地爾對DPN大鼠MNCV和SNCV的影響 與對照組相比，模型組大鼠MNCV和SNCV顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、法舒地爾低劑量組、法舒地爾高劑量組大鼠MNCV和SNCV顯著升高(P<0.05)；與法舒地爾低劑量組相比，法舒地爾高劑量組大鼠MNCV和SNCV顯著升高(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠MNCV和SNCV的比較Table 3 Comparison of MNCV and SNCV of rats in each group

2.4 法舒地爾對DPN大鼠坐骨神經病理學變化和軸突密度的影響 對照組大鼠坐骨神經纖維分布均勻，排列緊密整齊，形態(tài)正常。神經髓鞘細胞染色均勻，結構完整清晰，形態(tài)正常，與對照組相比，模型組大鼠坐骨神經表現出明顯神經病變，并伴有明顯炎性細胞浸潤，神經纖維數量減少且纖維分布稀疏，神經髓鞘細胞變性、腫脹，部分神經髓鞘溶解脫失，染色不均，軸突數量顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、法舒地爾低劑量組、法舒地爾高劑量組大鼠坐骨神經病理學變化均有不同程度的改善，神經纖維排列趨于規(guī)則，神經髓鞘細胞病變減輕，各組大鼠軸突數量均顯著升高(P<0.05)，其中陽性對照組和法舒地爾高劑量組改善效果最為明顯；與法舒地爾低劑量組相比，法舒地爾高劑量組大鼠坐骨神經病理學變化得到進一步改善，軸突數量顯著升高(P<0.05)。見圖1、2和表4。

表4 各組大鼠軸突數量的比較Table 4 Comparison of the number of axons in each group of rats

圖1 HE染色檢測坐骨神經病理學變化(400×)Figure 1 HE staining was used to detect the pathological changes of sciatic nerve注：A.對照組；B.模型組；C.陽性對照組；D.法舒地爾低劑量組；E.法舒地爾高劑量組

圖2 甲苯胺藍染色檢測坐骨神經軸突數量(400×)Figure 2 Toluidine blue staining was used to detect the number of sciatic nerve axons 注：A.對照組；B.模型組；C.陽性對照組；D.法舒地爾低劑量組；E.法舒地爾高劑量組

2.5 法舒地爾對DPN大鼠坐骨神經氧化應激的影響 與對照組相比，模型組大鼠坐骨神經組織中MDA顯著升高(P<0.05)，GSH和SOD含量顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、法舒地爾低劑量組、法舒地爾高劑量組大鼠坐骨神經組織中MDA顯著降低(P<0.05)，GSH和SOD含量顯著升高(P<0.05)；與法舒地爾低劑量組相比，法舒地爾高劑量組大鼠坐骨神經組織中MDA顯著降低(P<0.05)，GSH和SOD含量顯著升高(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠坐骨神經氧化應激反應的比較Table 5 Comparison of oxidative stress response of sciatic nerve of rats in each group

2.6 法舒地爾對DPN大鼠坐骨神經炎癥反應的影響 與對照組相比，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、法舒地爾低劑量組、法舒地爾高劑量組大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著降低；與法舒地爾低劑量組相比，法舒地爾高劑量組大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著降低(P<0.05)。見表6。

表6 各組大鼠炎癥反應的比較Table 6 Comparison of inflammatory response in each group of rats

2.7 法舒地爾對DPN大鼠坐骨神經Nrf2/ARE和NF-κB途徑的影響 與對照組相比，模型組大鼠坐骨神經中Nrf2和HO-1蛋白水平顯著降低(P<0.05)，p-p65/p65蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、法舒地爾低劑量組、法舒地爾高劑量組大鼠坐骨神經中Nrf2和HO-1蛋白水平顯著升高(P<0.05)，p-p65/p65蛋白水平顯著降低(P<0.05)；與法舒地爾低劑量組相比，法舒地爾高劑量組大鼠坐骨神經中Nrf2和HO-1蛋白水平顯著升高(P<0.05)，p-p65/p65蛋白水平顯著降低(P<0.05)。見圖3、4和表7。

圖3 Western blot檢測大鼠坐骨神經中Nrf2和HO-1蛋白表達Figure 3 Western blot was used to detect the expression of Nrf2 and HO-1 protein in rat sciatic nerve

圖4 Western blot檢測大鼠坐骨神經中p-p65/p65蛋白表達Figure 4 Western blot was used to detect the expression of p-p65/p65 protein in rat sciatic nerve

表7 各組大鼠Nrf2、HO-1、p-p65和p65蛋白水平比較Table 7 Comparison of Nrf2，HO-1，p-p65 and p65 protein expression in each group of rats

3 討論

與糖尿病視網膜病變、糖尿病心肌病變等糖尿病并發(fā)癥相比，DPN具有起病早、發(fā)病率高的特點。DPN的典型病理表現為包括有髓神經纖維再生和脫髓鞘、軸突脫位、神經元變性和再生延遲[15]。有研究[16]表明，DPN的發(fā)生與多種機制有關，包括物質代謝紊亂、炎癥信號通路的激活、過量氧化應激和鈣穩(wěn)態(tài)紊亂等，最終導致糖尿病進展過程中的神經損傷。不斷探究新的藥物對DPN的作用及其可能的作用機制，對于開發(fā)新的DPN治療藥物具有重要意義。

目前，法舒地爾已被廣泛用于緩解一系列中樞神經系統(tǒng)疾病的癥狀，包括脊髓損傷、中風、帕金森病、實驗性自身免疫性腦脊髓炎、神經性疼痛和癲癇[17]。已有證據顯示，法舒地爾通過誘導巨噬細胞極化，改善實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎[18]。法舒地爾還可治療實驗性自身免疫性神經炎(Experimental autoimmune neuritis，EAN)。法舒地爾可明顯抑制EAN小鼠坐骨神經炎癥反應和脫髓鞘細胞數增多[19]。此外，法舒地爾還在糖尿病相關并發(fā)癥中發(fā)揮明顯的保護作用。法舒地爾通過抑制炎癥反應和抑制轉化生長因子-β1和基質金屬蛋白酶-9/基質金屬蛋白酶-1的表達，從而抑制炎癥反應和減輕糖尿病肝纖維化[20]。本研究結果顯示，雖然法舒地爾對DPN大鼠體質量和血糖無明顯影響，但是法舒地爾治療可明顯升高DPN大鼠TWL、MWT、PWT、MNCV和SNCV，改善DPN大鼠坐骨神經病理學變化，增加坐骨神經軸突數量。表明法舒地爾可在DPN中發(fā)揮保護作用。

氧化應激被認為是高血糖條件下細胞損傷的最終共同途徑。長期持續(xù)的高血糖會導致神經元葡萄糖攝取過多，糖酵解對細胞內葡萄糖的處理不足。細胞內升高的葡萄糖隨后驅動替代的多元醇途徑，導致氧化應激和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)激活，產生葡萄糖神經毒性[21]。Nrf2/ARE途徑是抗氧化應激損傷的主要反應機制。在應激狀態(tài)下，Nrf2從Keap1中解離出來，轉運到細胞核中，并上調抗氧化劑相關酶的轉錄，如血紅素加氧酶-1(Heme oxygenase-1，HO-1)、NAD(P)H醌氧化還原酶1和谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞單位，從而發(fā)揮抗氧化作用[22]。研究[23]表明，Nrf2/ARE途徑在神經炎癥中發(fā)揮重要的作用，激活Nrf2/ARE途徑可改善硝酸甘油誘導的偏頭痛大鼠神經源性炎癥，從而發(fā)揮神經保護作用。目前，已有相關研究[24]表明，法舒地爾具有較強抗氧化活性，其通過激活Nrf2通路，抑制氧化應激水平減少脂多糖誘導的星形膠質細胞損傷。本研究結果顯示，DPN大鼠坐骨神經中MDA含量明顯升高，GSH和SOD含量明顯降低，Nrf2和HO-1蛋白水平明顯降低。而法舒地爾治療可明顯降低MDA含量，升高GSH和SOD含量以及Nrf2和HO-1蛋白水平。表明法舒地爾可能通過激活Nrf2/ARE途徑在DPN中發(fā)揮保護作用。

NF-κB通路參與許多生理過程，包括先天免疫、炎癥和許多細胞過程，如細胞增殖、轉化和凋亡。NF-κB通路的異常激活可促進炎癥因子的表達，如IL-1β、IL-6和TNF-α，導致炎性級聯(lián)和大量中性粒細胞聚集，最終引發(fā)一系列病理損傷[25]。已有研究[26]表明，四味健補湯通過抑制NF-κB通路，抑制IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子的產生，從而緩解小鼠紫杉醇誘導的周圍神經病理性疼痛。同樣的，周夏慧等[27]的實驗結果表明，靶向抑制NF-κB通路可導致IL-6和TNF-α水平降低，減輕神經氧化應激損傷，從而改善DPN大鼠周圍神經損傷狀態(tài)，促進神經傳導的恢復。目前，已有研究[28]顯示，法舒地爾具有較強抗炎活性，其通過抑制NF-κB通路改善脂多糖誘導的帕金森病模型中多巴胺神經元炎癥反應。本研究結果顯示，DPN大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯升高，而法舒地爾治療可明顯降低IL-1β、IL-6和TNF-α水平以及p-p65/p65蛋白水平。表明法舒地爾可能通過抑制NF-κB途徑在DPN中發(fā)揮保護作用。

4 結論

本研究結果表明，法舒地爾可能通過激活Nrf2/ARE途徑和抑制NF-κB途徑，抑制DPN大鼠氧化應激和炎癥反應，從而在DPN中發(fā)揮保護作用，為明確法舒地爾對DPN的作用機制及開發(fā)新的DPN治療策略提供了新的科學依據。