膀胱癌中Yes相關(guān)蛋白表達與Wnt/β?catenin通路的關(guān)系及其臨床病理意義

李建軍 喻長莉

膀胱癌是一種發(fā)病率較高的泌尿系惡性腫瘤，雖然手術(shù)切除、灌注化療等治療手段取得了一定療效，但治療后容易發(fā)生復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，預(yù)后不佳、5年生存率低［1?2］。目前，膀胱癌的發(fā)病機制尚不完全清楚，臨床上也缺乏評估病情及預(yù)后的分子標(biāo)志物及靶向治療的分子靶點。Yes 相關(guān)蛋白（Yes?associated protein，YAP）參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及基因表達調(diào)控，在多種惡性腫瘤發(fā)病中起重要作用。一項膀胱癌相關(guān)的細(xì)胞實驗證實，敲低膀胱癌細(xì)胞T24 中YAP 的表達后，癌細(xì)胞的增殖活力降低且細(xì)胞中Wnt/β?連環(huán)蛋白（β?catenin）通路受到明顯抑制［3］，提示YAP 可能通過Wnt/β?catenin 通路參與膀胱癌的發(fā)病，但YAP 在膀胱癌中的作用尚缺乏臨床證據(jù)。因此，本研究將以膀胱癌患者為對象，分析膀胱癌中YAP 表達與Wnt/β?catenin 通路的關(guān)系及其臨床病理意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2017年1月至2018年12月期間在湖北省武漢市江夏區(qū)中醫(yī)醫(yī)院接受手術(shù)切除的膀胱癌患者作為研究對象，同時取癌旁距離≥5 cm 的正常組織為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①接受手術(shù)治療，術(shù)后病理診斷為膀胱癌［4］；②術(shù)前未接受過放化療或其他抗腫瘤治療；③臨床病理資料及隨訪資料完整；④取得知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往有其他惡性腫瘤病史；②合并免疫功能異常、精神類疾病等。共納入108 例患者，年齡平均（61.49±11.82）歲，男性78 例、女性30 例，病理分級Ⅰ級19 例、Ⅱ級24 例、Ⅲ級65 例。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 免疫組化染色及結(jié)果判定

取膀胱癌組織及癌旁組織，制作石蠟切片后采用SP 二步法免疫組化染色試劑盒（北京杰輝博高生物公司）對YAP、Wnt1、Wnt3a、β?catenin 進行免疫組化染色，YAP 一抗為Abcam 公司、稀釋比例1∶200，完成免疫組化染色后進行蘇木素復(fù)染，封片并在顯微鏡下觀察。根據(jù)染色強度及陽性細(xì)胞比例進行結(jié)果判定［4］。染色強度：無染色為0 分、黃色染色為1 分、棕黃色染色為2 分、棕褐色染色為3分；陽性細(xì)胞比例：無染色為0 分，1%～25%陽性為1分、26%～50%陽性為2 分、51%～75%陽性為3 分，>75%陽性為4 分。將染色強度積分與陽性細(xì)胞比例積分相乘，乘積1～4 分為低表達、5～12 分為高表達。

1.3 熒光定量PCR 檢測mRNA 表達水平

取膀胱癌組織及癌旁組織，采用RNA 提取試劑盒（北京天根生化公司）提取RNA，采用cDNA 合成試劑盒（北京天根生化公司）對RNA 進行反轉(zhuǎn)錄、合成cDNA，采用熒光定量PCR 試劑盒（北京天根生化公司）進行cDNA 樣本中YAP、Wnt1、Wnt3a、β?catenin 表達水平的檢測，分別對YAP、Wnt1、Wnt3a、及進行熒光定量PCR 擴增，得到擴增的循環(huán)曲線及循環(huán)閾值（cycle threshold，CT），以β?actin為 內(nèi)參、按照公式2?ΔΔCt計算YAP、Wnt1、Wnt3a、β?catenin的mRNA 表達水平。

1.4 預(yù)后的隨訪

采用門診復(fù)查、電話回訪等方式進行隨訪，截止時間為2021年5月31日，隨訪內(nèi)容為疾病進展情況和生存情況，計算無進展生存期和總生存期。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件和Prism6.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料以n（%）表示，行χ2檢驗，計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，無進展生存期和總生存期采用K?M 曲線描述、采用log?rank 檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌組織及癌旁組織YAP 表達水平的比較

膀胱癌組織的YAP 高表達率及mRNA 表達水平均高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖1、表1。

表1 膀胱癌組織及癌旁組織YAP 表達水平的比較［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of YAP expression level in bladder cancer tissues and adjacent tissues［n（%），（±s）］

表1 膀胱癌組織及癌旁組織YAP 表達水平的比較［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of YAP expression level in bladder cancer tissues and adjacent tissues［n（%），（±s）］

組織來源膀胱癌組織癌旁組織χ2/t 值P 值n 108 108 YAP 高表達率76(70.37)36(33.33)29.670 0.000 YAP mRNA 表達水平2.42±0.45 1.00±0.21 29.717 0.000

圖1 膀胱癌組織及癌旁組織YAP 病理圖（SP，×400）Figure 1 Immunohistochemical staining of YAP in bladder cancer tissues and adjacent tissues（SP，×400）

2.2 膀胱癌YAP 低表達與高表達患者臨床病理特征的比較

膀胱癌YAP 低表達與高表達患者性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），膀胱癌YAP 高表達患者病理分級Ⅲ級、T3?T4 期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的比例高于YAP 低表達患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 膀胱癌YAP 低表達與高表達患者臨床病理特征的比較［n（%），（±s）］Table 2 Comparison of clinicopathological features between low expression and high expression of YAP in bladder cancer［n（%），（±s）］

表2 膀胱癌YAP 低表達與高表達患者臨床病理特征的比較［n（%），（±s）］Table 2 Comparison of clinicopathological features between low expression and high expression of YAP in bladder cancer［n（%），（±s）］

臨床病理特征性別年齡病理分級T 分期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移男女<60 歲≥60 歲Ⅰ～ⅡⅢT1～T2 T3～T4否是YAP 蛋白表達高表達56（71.79）20（66.67）34（73.91）42（67.74）24（55.81）52（80.00）26（59.09）50（78.13%）39（61.90）37（82.22）低表達22（28.21）10（33.33）12（26.09）20（32.26）19（44.19）13（20.00）18（40.91）14（21.88）24（38.10）8（17.78）χ2值0.2730.601 0.4820.487 7.2610.007 4.5310.033 5.1970.023 P 值

2.3 YAP 低表達與高表達的膀胱癌組織中Wnt/β?catenin 通路的比較

YAP 高表達的膀胱癌組織中Wnt1、Wnt3a、β?catenin的mRNA 表達水平高于YAP 低表達的膀胱癌組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

表3 YAP 低表達與高表達的膀胱癌組織中Wnt1、Wnt3a、β?catenin mRNA 表達水平的比較（±s）Table 3 Comparison of mRNA expression of Wnt1，Wnt3a，β?catenin between low expression and high expression of YAP in bladder cancer tissues（±s）

表3 YAP 低表達與高表達的膀胱癌組織中Wnt1、Wnt3a、β?catenin mRNA 表達水平的比較（±s）Table 3 Comparison of mRNA expression of Wnt1，Wnt3a，β?catenin between low expression and high expression of YAP in bladder cancer tissues（±s）

YAP 蛋白表達低表達高表達t 值P 值n 32 76 Wnt1 1.67±0.31 2.09±0.32 6.285 0.000 Wnt3a 1.58±0.34 2.11±0.39 6.688 0.000 β?catenin 1.52±0.30 2.18±0.41 8.218 0.000

2.4 膀胱癌YAP 低表達與高表達患者無進展生存期及總生存期的比較

膀胱癌YAP 高表達患者隨訪過程中的累積無進展生存率及累積總生存率均低于膀胱癌YAP 低表達患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖2。

圖2 膀胱癌YAP 低表達與高表達患者無進展、總生存期的K?M 曲線Figure 2 K?M curve of progression free and overall survival in patients with low YAP expression and high expression of bladder cancer

3 討論

YAP基因是近些年受到越來越多關(guān)注的原癌基因，該基因的編碼產(chǎn)物含有WW 結(jié)構(gòu)域、是Hippo 信號通路的核心蛋白，在細(xì)胞內(nèi)對多種信號通路的激活及基因的表達具有調(diào)控作用。國內(nèi)外多項臨床研究證實，肺癌［4］、胰腺癌［5］、乳腺癌［6］等多種惡性腫瘤組織中YAP 的表達水平明顯增加，提示YAP 具有促癌作用。膀胱癌中YAP 相關(guān)的研究仍處于細(xì)胞實驗階段，國內(nèi)劉邦儉［3］、董銳［7］及Chen X［8］的細(xì)胞實驗均證實敲低YAP 顯著抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，提示YAP 可能在膀胱癌的發(fā)病中起促癌作用。本研究通過臨床樣本的收集及檢測證實：膀胱癌組織中YAP 的表達水平較癌旁組織明顯增加，結(jié)合既往其他學(xué)者在細(xì)胞實驗中證實YAP 促進膀胱癌細(xì)胞生長的生物學(xué)效應(yīng)進行分析，局部組織中高表達的YAP 可能參與膀胱癌的發(fā)病。

膀胱癌具有浸潤性生長的生物學(xué)特性，不斷浸潤的膀胱癌細(xì)胞促進了病理進展。癌細(xì)胞異常的增殖、遷移及侵襲是與膀胱癌浸潤性生長密切相關(guān)的生物學(xué)行為，YAP 已經(jīng)被證實顯著促進膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，但其與膀胱癌病理進展的關(guān)系尚不清楚。Marquard S［9］在肝癌中的研究及Li J［10］在頭頸部惡性腫瘤中的研究分別證實YAP 的高表達與兩種惡性腫瘤的病理進展有關(guān)。本研究分析了膀胱癌發(fā)病過程中YAP 與病理特征的關(guān)系。根據(jù)YAP 的免疫組化染色檢測結(jié)果將其分為高表達和低表達，與膀胱癌YAP 低表達的患者比較，YAP 高表達患者的病理分級、T 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率均更高，表明YAP 表達增加與膀胱癌的病理進展有關(guān)，進而驗證了高表達的YAP參與膀胱癌的發(fā)病。

膀胱癌相關(guān)的細(xì)胞實驗證實，YAP 的促癌作用與激活Wnt/β?catenin 通路有關(guān)［3］，這一作用也在胃癌［11］、肝癌［12］、黑色素瘤［13］、宮頸癌［14］中被證實。Wnt/β?catenin 通路是經(jīng)典的促癌通路，上游信號分子Wnt1、Wnt3a 與受體Frz、LRP5/6 結(jié)合后向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號、使β?catenin 在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集并向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位，進入細(xì)胞核的β?catenin 能調(diào)控多種原癌基因表達、促進細(xì)胞生長。Chehrazi?Raffle A 的研究證實，Wnt/β?catenin 通路的激活對膀胱癌細(xì)胞的生長具有促進作用［15］。本研究通過臨床樣本的檢測對膀胱癌發(fā)病過程中YAP 與Wnt/β?catenin 通路的關(guān)系進行了驗證，與YAP 低表達的膀胱癌比較，YAP 高表達的膀胱癌中Wnt1、Wnt3a 及β?catenin的表達均明顯增加，提示高表達的YAP 可能通過激活Wnt/β?catenin 通路參與膀胱癌的發(fā)病。

最后，本研究還對膀胱癌的預(yù)后進行了隨訪。目前關(guān)于膀胱癌預(yù)后的研究認(rèn)為，病灶浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理特征是預(yù)后的影響因素［16?18］，本研究已經(jīng)證實YAP 的高表達與T 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，進一步分析YAP 表達水平與預(yù)后的關(guān)系可知：YAP 高表達患者隨訪過程中的累積無進展生存率及累積總生存率均明顯降低，表明YAP 的高表達與膀胱癌患者預(yù)后不佳、生存時間縮短有關(guān)，由此也為深入認(rèn)識YAP 在膀胱癌發(fā)病中的作用提供了臨床隨訪證據(jù)。

綜上所述，膀胱癌中YAP 表達水平增加與Wnt/β?catenin 通路激活及病理進展、生存時間縮短有關(guān)，上述結(jié)果為今后深入研究YAP 在膀胱癌發(fā)病中的作用及機制提供了依據(jù)。