環(huán)境未培養(yǎng)微生物中新型抗生素的發(fā)掘研究進(jìn)展

杜 瑞，王夢(mèng)歌，彭金金，戢博陽(yáng)，紀(jì)曉俊，魏勇軍

(1.鄭州大學(xué) 藥學(xué)院 鄭州大學(xué)合成生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室 藥物關(guān)鍵制備技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450000；2.查爾姆斯理工大學(xué) 生物與生物工程學(xué)院，瑞典 哥德堡 SE-41296；3.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院,江蘇 南京 211800)

抗生素是臨床治療病原微生物感染的最常用藥物，但由于已有抗生素的廣泛應(yīng)用，甚至濫用導(dǎo)致微生物產(chǎn)生耐藥性，使現(xiàn)有抗生素的療效降低甚至無(wú)效；耐藥性致病菌引起的感染已成為全世界面臨的最主要健康問(wèn)題之一[1-2]?？股厥俏⑸锏拇渭?jí)代謝產(chǎn)物，篩選并表征微生物中的抗生素合成基因簇是解決致病菌抗生素耐藥性的有效途徑之一。自20世紀(jì)70年代以來(lái)，傳統(tǒng)培養(yǎng)分離微生物并篩選抗生素的方法已很久未發(fā)現(xiàn)新化學(xué)結(jié)構(gòu)的抗生素[3]。近年來(lái)，環(huán)境未培養(yǎng)微生物成為抗生素發(fā)掘和研究的重點(diǎn)關(guān)注對(duì)象，因此，本文綜述近年利用新技術(shù)發(fā)掘環(huán)境未培養(yǎng)微生物中新型抗生素的方法，以期為新型抗生素的發(fā)現(xiàn)及規(guī)模化生產(chǎn)提供參考。

1 新型抗生素有較大需求

1.1 耐藥致病菌嚴(yán)重危害人體健康

美國(guó)疾病控制中心的報(bào)告顯示美國(guó)每年約有280萬(wàn)人發(fā)生耐藥致病菌感染，約3.5萬(wàn)人死于耐藥細(xì)菌感染(https:∥www.cdc.gov/drugresistance/index.html)。若無(wú)新的治療方案，普通的細(xì)菌感染即可對(duì)人類構(gòu)成致命的威脅。據(jù)估計(jì)，全球因抗生素耐藥致病菌引起的人類感染在2050年將增加10倍，將導(dǎo)致超過(guò)1 000萬(wàn)人的死亡，抗生素耐藥菌對(duì)人類產(chǎn)生的危害將會(huì)超過(guò)癌癥[4]。

我國(guó)是抗生素的生產(chǎn)和使用大國(guó)，每年人均消耗抗生素138 g左右。耐藥性細(xì)菌在我國(guó)分布廣泛[5-6]。中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)研究報(bào)告指出，2017—2018年，我國(guó)臨床分離的表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)中，對(duì)甲氧西林有耐藥性的菌比例高達(dá)85.7%，大腸桿菌(Escherichiacoli)中超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的檢出率也達(dá)54.6%[7]。此外，其他多種病原菌的抗生素耐藥性檢出率也較高[8]。普通抗生素對(duì)耐藥性細(xì)菌的療效不明顯，患者感染后難以治療痊愈，曾被有效治療的細(xì)菌感染性疾病可能再次對(duì)人類構(gòu)成致命威脅[9]。當(dāng)前，除減少抗生素濫用并控制抗生素耐藥基因的進(jìn)化、傳播與擴(kuò)散外，還迫切需要開發(fā)新型抗生素對(duì)抗耐藥細(xì)菌[10]。

1.2 可培養(yǎng)微生物已難以發(fā)現(xiàn)新型抗生素

抗生素主要分為聚酮類化合物和非核糖體多肽類化合物[11]，其中，聚酮類化合物(polyketides)通常由酰基輔酶A活化的底物之間的重復(fù)脫羧縮合合成[12]；而非核糖體多肽類化合物(non-ribosomal peptide，NRP)是由非核糖體多肽酶催化相應(yīng)的單體氨基酸合成。聚酮化合物的骨架合成元件包括聚酮合成酶(polyketide synthase, PKS)、?；D(zhuǎn)移酶、?；d體蛋白及脫水酶、烯醇還原酶、糖基轉(zhuǎn)移酶等修飾元件[13]；非核糖體肽類化合物的骨架合成元件包括非核糖體肽合酶(non-ribosomal peptide synthase, NRPS)、肽?；d體蛋白、氨基酸腺苷化結(jié)構(gòu)域、縮合結(jié)構(gòu)域以及硫酯酶等修飾元件[14-15]。這些抗生素合成基因通常成簇存在，長(zhǎng)度可達(dá)上百kb，由多個(gè)相似性較高的抗生素骨架合成基因及糖基化、甲基化等修飾基因組成[12,14]。

現(xiàn)有抗生素主要來(lái)源于可分離培養(yǎng)的細(xì)菌，其中一半以上的臨床應(yīng)用抗生素來(lái)源于放線菌門(Actinobacteria)鏈霉菌屬(Streptomyces)的微生物[2, 13]。目前放線菌門中的抗生素資源已被深度挖掘，所以利用可培養(yǎng)微生物發(fā)酵篩選到的抗生素通常與已知活性的抗生素相同或相似，因此科研人員已難以從可培養(yǎng)微生物中篩選到新型抗生素[11]。自20世紀(jì)80年代以來(lái)，已近40年沒有新型結(jié)構(gòu)或作用機(jī)制的新型抗生素上市。目前，耐藥細(xì)菌對(duì)被化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾得到的抗菌藥物敏感度不強(qiáng)，所以難以利用結(jié)構(gòu)修飾從已知結(jié)構(gòu)的抗生素中篩選到滿足臨床使用的新型抗生素[2]。由于抗生素特別是源于放線菌中針對(duì)革蘭氏陰性菌類的抗生素被“過(guò)度”挖掘，同時(shí)難以從化合物庫(kù)中篩選到新型抗菌物質(zhì)，所以亟須開拓其他新的抗生素發(fā)掘策略。

2 微生物組學(xué)在新型抗生素發(fā)掘中的應(yīng)用

分子微生物學(xué)研究表明，環(huán)境中可能存在著數(shù)百萬(wàn)種微生物，但培養(yǎng)分離技術(shù)手段有限，大部分的微生物是未培養(yǎng)的[16]，這是難以從可培養(yǎng)微生物中篩選到新型抗生素的根本原因。各種環(huán)境中蘊(yùn)藏的獨(dú)特的、未挖掘的、多樣性豐富的微生物及其天然產(chǎn)物，是新型抗生素的潛在來(lái)源[17]?？股刈鳛槲⑸锎渭?jí)代謝產(chǎn)物，其合成受到環(huán)境等因素的嚴(yán)格調(diào)控，在環(huán)境中抗生素合成基因通常不表達(dá)或低表達(dá)，導(dǎo)致很難直接從環(huán)境微生物特別是未培養(yǎng)微生物中篩選到新型抗生素[18]。因此，挖掘并表征環(huán)境未培養(yǎng)微生物中抗生素合成基因簇是發(fā)掘新型抗生素的重要途徑。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)[19]的發(fā)展，不依賴于培養(yǎng)的微生物組學(xué)技術(shù)，尤其是宏基因組學(xué)技術(shù)[20]逐漸完善并被廣泛應(yīng)用。宏基因組學(xué)是以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對(duì)象，利用測(cè)序分析和功能基因篩選為研究手段，闡明微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系為研究目的的微生物學(xué)研究方法[21]。通過(guò)宏基因組學(xué)研究，能夠有效精準(zhǔn)地鑒定出不同微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的差異，利用多個(gè)抗生素合成基因/元件/模塊組合分析預(yù)測(cè)抗生素結(jié)構(gòu)和功能的多樣性和新穎性，有目的篩選抗生素合成基因簇。此外，還可以通過(guò)對(duì)Cosmid等基因文庫(kù)的篩選，獲得抗生素合成基因簇，進(jìn)而獲得新型抗生素[22](圖1)。如，通過(guò)對(duì)環(huán)境中未培養(yǎng)微生物進(jìn)行高通量篩選，發(fā)現(xiàn)了破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的抗生素——Teixobactin[23]。

圖1 宏基因組學(xué)等技術(shù)及其在抗生素合成基因簇發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用[22]

2.1 微生物多樣性與抗生素合成基因多樣性的解析

各種環(huán)境中的未培養(yǎng)微生物是挖掘新型抗生素的重要來(lái)源。目前，已有多位學(xué)者對(duì)源自土壤、海洋及人體等的微生物組中的抗生素合成基因簇進(jìn)行了解析[24-26]。

土壤是多數(shù)抗生素的主要環(huán)境來(lái)源[27]?，F(xiàn)階段分離可培養(yǎng)微生物得到的抗生素均為已知的[28]，利用適用于未知物種、未知基因檢測(cè)的非培養(yǎng)依賴的微生物組學(xué)方法揭示環(huán)境微生物及其天然產(chǎn)物合成基因，挖掘出大量未知的新型天然產(chǎn)物合成基因簇，為新型抗生素的發(fā)現(xiàn)提供基礎(chǔ)[17, 29]。Brady團(tuán)隊(duì)的Hover等[30]采用宏基因組測(cè)序結(jié)合細(xì)菌人工染色(BAC)文庫(kù)篩選策略，從近2 000個(gè)土壤樣本中發(fā)現(xiàn)了1種未知抗生素合成基因簇，并利用該基因簇合成了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等多藥耐藥致病菌的新型抗生素Malacidins。Charlop-Powers等[31]研究發(fā)現(xiàn)，在美國(guó)紐約等都市區(qū)的土壤中存在著多種新穎的抗生素合成基因簇，且與其他自然環(huán)境中的天然產(chǎn)物合成基因/基因簇明顯不同。Crits-Christoph等[17]對(duì)美國(guó)加州的草地土壤大規(guī)模宏基因組學(xué)測(cè)序發(fā)現(xiàn)了1 159個(gè)新穎的天然產(chǎn)物合成基因簇；這些基因簇不僅來(lái)自已知的傳統(tǒng)產(chǎn)抗菌如放線菌門和變形菌門(Proteobacteria)，還有一半以上來(lái)源于酸桿菌門(Acidobacteria)(來(lái)源最多)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、Rokubacteria和Gemmatimonadetes，其中，對(duì)酸桿菌門微生物測(cè)序后發(fā)現(xiàn)的天然產(chǎn)物合成基因簇是之前從未發(fā)現(xiàn)過(guò)的，這為發(fā)現(xiàn)新抗生素提供了基礎(chǔ)。

海洋微生物中也分布著豐富的抗生素合成基因簇[26]。深海的環(huán)境惡劣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給匱乏，深海環(huán)境中的微生物有可能通過(guò)產(chǎn)生特定的次級(jí)代謝產(chǎn)物抑制周邊微生物的生長(zhǎng)，以爭(zhēng)奪對(duì)自身有利的生存空間[32]。受到這一化學(xué)生態(tài)學(xué)原理的啟發(fā)，同時(shí)海洋環(huán)境微生物的研究相對(duì)較少，近期科研人員將發(fā)掘新型抗生素的目光轉(zhuǎn)向海洋。Jackson等[33]研究發(fā)現(xiàn)，海洋微生物中含有豐富的編碼聚酮類化合物、非核糖體多肽、細(xì)菌素(Bacteriocins)、蘭蒂肽(Lassopeptides)和拉索普肽(Lantipeptides)等代謝產(chǎn)物的合成基因簇，其中深海微生物編碼非核糖體多肽的基因簇多樣性較高。Zhang等[34]利用微生物組學(xué)方法篩選海鞘(Pyrosomellaverticilliata)的微生物組后得到具有強(qiáng)抗菌活性的天然產(chǎn)物Turbinmicin。海綿(Porifera)是一種底棲濾食動(dòng)物，大量的微生物寄存于其獨(dú)特的濾食系統(tǒng)中，在淺水和深海海綿體內(nèi)中分離出的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)多種臨床相關(guān)病菌和酵母菌均表現(xiàn)出獨(dú)特的抗菌活性[35]。Jackson等[33]通過(guò)宏基因組學(xué)測(cè)序研究4個(gè)不同進(jìn)化方向的深海海綿衍生鏈霉菌屬的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，海綿中含有豐富多樣且高度新穎的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇。Wei等[36]對(duì)黃海海底沉積物的研究發(fā)現(xiàn)，海洋中的大量抗生素合成基因簇與已知的抗生素合成基因簇同源性在50%以下；通過(guò)序列篩選，從構(gòu)建的Fosmid克隆文庫(kù)中獲得10個(gè)新的抗生素合成基因簇。此外，Uzair等[37]從海藻微生物群落中分離到對(duì)耐藥菌有抑制作用的潛在的新型抗生素。鞠建華研究團(tuán)隊(duì)的Zhu等[38]從深海微生物群落中提取出對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和厭氧性革蘭氏陰性菌具有高效抑制效果的含有氨基己糖結(jié)構(gòu)的核苷類抗生素A201A。Ma等[39]從深海放線菌中提取分離出具有明顯抑制結(jié)核分枝桿菌活性的結(jié)構(gòu)新穎的抗生素怡萊霉素(Ilamycin C)。這些研究還發(fā)現(xiàn)，即使是相鄰海域的微生物，其種類和抗生素合成基因簇也顯著不同，這增加了從海洋環(huán)境中發(fā)現(xiàn)新型抗生素的可能性。

人體內(nèi)具有豐富多樣的微生物群落[40]。每個(gè)人體內(nèi)的微生物種類高達(dá)上千種，而且不同個(gè)體之間、同一人的不同部位之間的微生物群落均有差異[41]。人體胃腸道微生物菌群一直是抗生素研究的關(guān)注重點(diǎn)，宏基因組研究表明在全球各地人類腸道中存在著豐富多樣的未培養(yǎng)菌種[42]。人體內(nèi)同樣蘊(yùn)藏著豐富的抗生素合成基因簇，是發(fā)現(xiàn)新型抗生素的重要來(lái)源。Pasolli等[43]利用宏基因組學(xué)方法從一些未知的微生物種群中識(shí)別出數(shù)千個(gè)微生物基因組，豐富了人體相關(guān)微生物的基因組，為從人體微生物群落中發(fā)現(xiàn)新型抗生素拓展了來(lái)源。Zipperer等[44]在人體鼻腔微生物中發(fā)現(xiàn)了能夠抑制耐藥金黃色葡萄球菌的抗生素Lugdunin。Sugimoto等[45]利用MetaBGC策略對(duì)人體微生物組中的抗生素合成基因簇進(jìn)行發(fā)掘后發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)和不同菌株的微生物具有不同的抗生素合成基因簇，且其中包含多個(gè)聚酮化合物。Imai等[18]對(duì)動(dòng)物線蟲體內(nèi)腸道菌Photorhabdus中天然產(chǎn)物合成基因簇的解析及異源表達(dá)，獲得了新型抗生素達(dá)羅布汀(Darobactin)；經(jīng)測(cè)試發(fā)現(xiàn)，達(dá)羅布汀對(duì)抗耐藥性革蘭氏陰性菌具有較強(qiáng)的抑菌活力。除序列篩選外，利用功能基因篩選的方法也能從環(huán)境微生物組中獲得大量新型的抗生素合成基因簇，但是該方法較難發(fā)現(xiàn)完整的基因簇且工作量大，目前已較少使用[41]。

由此可見，在土壤、海洋、人和動(dòng)物體等環(huán)境中蘊(yùn)含著豐富的新穎抗生素合成基因簇，是新型抗生素的重要環(huán)境來(lái)源。但多數(shù)抗生素合成基因簇表達(dá)水平較低或是不表達(dá)，需開發(fā)新的抗生素合成基因簇表征方法。微生物組學(xué)的發(fā)展為發(fā)現(xiàn)新型抗生素合成基因簇提供了基礎(chǔ)，通過(guò)開發(fā)新方法，鑒定表征以“喚醒”這些“沉默狀態(tài)”的抗生素合成基因簇，有望發(fā)掘出應(yīng)用于臨床的新型抗生素[46-47]。

2.2 生物信息學(xué)及多學(xué)科交叉為新型抗生素的發(fā)現(xiàn)奠定基礎(chǔ)

微生物組學(xué)的發(fā)展已產(chǎn)生了海量的數(shù)據(jù)，為抗生素合成基因簇的鑒定表征奠定了基礎(chǔ)。為了從海量的數(shù)據(jù)中快速發(fā)掘新型抗生素合成基因簇，目前科學(xué)家已開發(fā)出多個(gè)抗生素(天然產(chǎn)物)合成基因簇?cái)?shù)據(jù)庫(kù)，建立并改進(jìn)了抗生素合成基因簇的預(yù)測(cè)方法。Helfrich等[48]開發(fā)出預(yù)測(cè)反式乙酰轉(zhuǎn)移酶聚酮化合物的重要工具TansATor，并利用該技術(shù)挖掘到數(shù)個(gè)新穎的抗生素合成基因簇。Blin等[49]開發(fā)了預(yù)測(cè)抗生素和次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇可能合成產(chǎn)物的工具antiSMASH。Navarro-Muoz等[50]基于生物信息學(xué)手段構(gòu)建了一種新計(jì)算工具BiG-SCAPE，該工具可以對(duì)微生物群落進(jìn)行分析并快速挖掘其中的生物合成基因簇。這些研究為科研人員開發(fā)可用抗菌化合物打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，同時(shí)生物信息學(xué)在基因片段的功能開發(fā)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、藥物結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、新藥研發(fā)及合成中起著至關(guān)重要的作用，可加速新型抗生素研發(fā)進(jìn)程[51-52]。

目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的用于合成非核糖體多肽的稀有氨基酸種類多達(dá)300個(gè)，種類繁多的稀有氨基酸使得這類代謝產(chǎn)物豐富多樣。同時(shí)，固相肽技術(shù)的迅猛發(fā)展加快了多肽合成技術(shù)的進(jìn)步，降低了多肽合成的成本?；诖耍珻hu等[53]開發(fā)出了合成-生物信息天然產(chǎn)物(syn-BNPs)的方法，該方法首先利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)天然產(chǎn)物合成基因簇合成的多肽類化合物，然后運(yùn)用化學(xué)方法合成預(yù)測(cè)的多肽，并在體外驗(yàn)證其活性，以此獲得了新型抗生素Humimycins。Fritz 等[54]利用研發(fā)的新型生物信息學(xué)工具NRPPUR成功從人腸道菌的基因組篩選到89組新型的抗生素合成基因簇。加拿大科學(xué)家Culp等[55]通過(guò)解析土壤細(xì)菌的生物合成基因和抗性決定簇，預(yù)測(cè)出1個(gè)糖肽家族生物合成基因簇，以此獲得一種具有新功能機(jī)制的潛力抗菌化合物——Corbomycin。由此可見，生物信息學(xué)結(jié)合化學(xué)合成是新型抗生素發(fā)現(xiàn)的重要途徑[51]。從環(huán)境中篩選出合適的抗生素合成基因簇，然后預(yù)測(cè)它們可能合成的抗菌化合物；選擇新穎的、有臨床使用價(jià)值的抗生素進(jìn)行化學(xué)合成，并進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)等功能驗(yàn)證；在此基礎(chǔ)上，將有功能的抗生素合成基因簇在模式微生物中進(jìn)行異源表達(dá)，有望大量合成并獲得新型抗生素(圖2)。

圖2 基于基因挖掘生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的新型抗生素挖掘與合成方法

人工智能和深度學(xué)習(xí)技術(shù)也被嘗試應(yīng)用于新型抗生素的挖掘[56-57]。Collins團(tuán)隊(duì)的Stokes等[56]利用人工智能和深度學(xué)習(xí)訓(xùn)練的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法篩選到廣譜新型的超級(jí)抗生素Halicin。Modongo等[58]通過(guò)人工智能和丁胺卡那霉素(Amikacin)暴露來(lái)計(jì)算耐藥菌的耐受濃度，以此推斷多重耐藥結(jié)核桿菌病患者的藥物治療效果，以提高患者的存活率。但是，目前的人工智能等方法還無(wú)法大規(guī)模篩選環(huán)境未培養(yǎng)微生物并對(duì)其抗生素合成基因簇進(jìn)行表征，也無(wú)法準(zhǔn)確預(yù)測(cè)抗生素的側(cè)鏈修飾效應(yīng)。此外，在化學(xué)合成時(shí)，對(duì)抗生素的側(cè)鏈進(jìn)行糖基化、甲基化等功能化修飾很難精確控制。因此，針對(duì)復(fù)雜未知的抗生素合成基因簇，仍須進(jìn)行詳細(xì)表征，并對(duì)合成產(chǎn)物的體內(nèi)/體外抗菌活性和安全性等進(jìn)行評(píng)價(jià)。

3 合成生物學(xué)在新型抗生素發(fā)掘中的應(yīng)用

合成生物學(xué)是近年新興起的研究領(lǐng)域，是一門綜合性交叉學(xué)科，主要是以工程學(xué)思想為骨架，融合標(biāo)準(zhǔn)化表征的生物學(xué)模塊，以理性設(shè)計(jì)為指引，進(jìn)行模塊整合或者從頭合成有潛力的、具有目標(biāo)功能的人造生命的新系統(tǒng)知識(shí)和獨(dú)特理論框架以及特定的功能技術(shù)與工程平臺(tái)[59]。合成生物學(xué)已被運(yùn)用于多個(gè)生物制造領(lǐng)域[60]，在抗生素的生物合成方面也有著明顯的優(yōu)勢(shì)[61]。抗生素分子結(jié)構(gòu)多樣而繁雜，雖然采用化學(xué)方法能夠合成少量化合物[53]，但是大規(guī)模合成仍需在微生物中表達(dá)生產(chǎn)(圖2)。選擇合適的宿主，精準(zhǔn)調(diào)控抗生素合成基因簇，激活“沉默”抗生素合成基因簇等方法能夠有效表征大量新穎的抗生素合成基因簇，用于獲得大量新型抗生素[47]。

選擇合適的宿主是成功表征抗生素合成基因簇的關(guān)鍵。鏈霉菌是抗生素的主要來(lái)源，也是一種最常用的抗生素合成基因簇表達(dá)宿主[46]。目前，臨床使用的大多數(shù)抗菌化合物由鏈霉菌合成，如鏈霉素(Streptomycin)、四環(huán)素(Tetracycline)、卡那霉素(Kanamycin)和萬(wàn)古霉素(Vancomycin)等[27]。除已篩選出的抗生素外，鏈霉菌基因組中還分布著種類豐富的“沉默”天然產(chǎn)物合成基因簇。Fu等[62]利用開發(fā)的基于全長(zhǎng)RecE的線性-線性同源重組(LLHR)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了直接克隆DNA 并在異源宿主中表達(dá)，獲得抗生素Luminmycin。表1總結(jié)了部分合成生物技術(shù)在抗生素合成基因簇表征中的應(yīng)用實(shí)例。

表1 合成生物學(xué)技術(shù)在抗生素合成基因簇表征中的部分應(yīng)用

CRISPR/Cas9技術(shù)的開發(fā)及應(yīng)用克服了部分天然產(chǎn)物合成基因簇在鏈霉菌中不表達(dá)或表達(dá)水平較低的問(wèn)題，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)鏈霉菌等模式宿主工程改造后，顯著提升了其表達(dá)抗生素合成基因簇的效率[63-65,75]。目前研究人員已研發(fā)出多個(gè)高效、迅速和可調(diào)控的基于CRISPR/Cas9的工具包，用于編輯天藍(lán)色鏈霉菌，表征抗生素合成基因簇[76]。如，武漢大學(xué)孫宇輝團(tuán)隊(duì)的Tao等[75]、分子植物卓越中心的姜衛(wèi)紅團(tuán)隊(duì)的Li等[77-78]和上海師范大學(xué)的蘆銀華團(tuán)隊(duì)的Zhao等[79]開發(fā)了基于CRISPR-Cpf1的基因組輔助改造工具，該工具能夠精準(zhǔn)敲除天藍(lán)色鏈霉菌中單基因或雙基因，效率可達(dá)75%～95%，還可提高鏈霉菌中基因模塊編輯和轉(zhuǎn)錄抑制的效率，有效加快了鏈霉菌以及其他放線菌中新穎天然產(chǎn)物合成基因簇的表征以及菌株改造。婁春波團(tuán)隊(duì)的Jiang等[80]開發(fā)出利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)一步克隆大基因簇技術(shù)(CATCH)，并成功將其用在大片段抗生素合成基因簇如金霉素(Chlorotetracycline)、杰多霉素(Jadomycin)等在鏈霉菌中的克隆和表達(dá)合成。麥克馬斯特大學(xué)的Culp等[81]以CRISPR/Cas9系統(tǒng)為基礎(chǔ)，以啟動(dòng)子工程和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)控制為手段，搭建了一個(gè)改造鏈霉菌生產(chǎn)常用抗生素基本組件的底盤細(xì)胞平臺(tái)，能夠表征大量的抗生素合成基因簇。Zhao等[67]開發(fā)的編輯器dCas9-CDA-ULstr可對(duì)鏈霉菌進(jìn)行有效的多重基因組編輯，促進(jìn)了鏈霉菌菌株的功能基因組和代謝工程研究。Myronovskyi等[68]利用基于BAC庫(kù)的Red/ET同源重組系統(tǒng)，敲除白色鏈霉菌中的所有15個(gè)抗生素合成基因簇，為新型抗生素合成基因簇的表征提供了合適的宿主。

釀酒酵母是研究最多的模式真菌微生物，其遺傳背景明晰、抗菌類次級(jí)代謝產(chǎn)物種類少、與外源目的基因競(jìng)爭(zhēng)表達(dá)性小、同源重組能力強(qiáng)，十分有利于抗生素的研發(fā)和生產(chǎn)[69]。Awan等[69]通過(guò)遺傳改造，在釀酒酵母中實(shí)現(xiàn)了青霉素的合成。Brady團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)釀酒酵母進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)控制元件(如啟動(dòng)子)的工程改造，利用釀酒酵母實(shí)現(xiàn)了“沉默”抗生素合成基因簇的表達(dá)及新型抗生素的合成[70-71]。其他的酵母和絲狀真菌也被嘗試用于抗生素合成基因簇的表達(dá)，但研究進(jìn)展相對(duì)較少[82]。

抗生素合成過(guò)程受代謝宿主微生物的嚴(yán)格調(diào)控[83]。利用最新的合成生物學(xué)技術(shù)，可以對(duì)細(xì)菌和真菌表達(dá)的抗生素合成基因簇進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控，提高目標(biāo)抗生素的產(chǎn)量，為大規(guī)模的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)。伊利諾伊大學(xué)的Wang等[72]組裝了轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)物，用在鏈霉菌中，精確控制抑制子從“沉默”基因中脫離，進(jìn)而成功“喚醒”8個(gè)大型抗生素合成基因簇，為鏈霉菌中天然化合物的發(fā)現(xiàn)及生物合成提供了新的思路。Akhter等[84]利用壓力介導(dǎo)技術(shù)激活了海洋鏈霉菌菌株NA-ZhouS1中“沉默”的抗生素合成基因簇，從而分離得到新的環(huán)霉素抗生素。Lim等[73]使用CRISPR/Cas9技術(shù)將基因轉(zhuǎn)錄激活子——kasO*啟動(dòng)子插入玫瑰孢鏈霉菌(Streptomycesroseosporus)基因組中，激活了原本“沉默”的抗生素合成基因簇，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)了強(qiáng)效抗生素——極光霉素(Auroramycin)。CATCH和LLHR等技術(shù)可直接從放線菌染色體DNA中捕獲大型抗生素合成基因簇，加快了新型抗生素異源生產(chǎn)的進(jìn)程[75, 85]。Chen等[86]通過(guò)對(duì)鏈霉菌中的2個(gè)調(diào)控基因進(jìn)行過(guò)表達(dá)，提高了恩拉霉素(Enramycin)的產(chǎn)量。張立新團(tuán)隊(duì)的Wang等[74]發(fā)現(xiàn)，鏈霉菌中的甘油三酯(TAG)水平與抗生素的合成密切相關(guān)，以此構(gòu)建了TAG動(dòng)態(tài)降解工程策略，通過(guò)精準(zhǔn)動(dòng)態(tài)調(diào)控鏈霉菌內(nèi)甘油三酯水平，實(shí)現(xiàn)了多種聚酮化合物在鏈霉菌中的高效合成。此外，精準(zhǔn)調(diào)控解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)中TAG的降解，也能夠有效提高解脂耶氏酵母生產(chǎn)聚酮類代謝產(chǎn)物的能力[87]。隨著基因編輯、微生物細(xì)胞工廠構(gòu)建和優(yōu)化等合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，在鏈霉菌和釀酒酵母等宿主中異源表達(dá)抗生素合成基因簇，并通過(guò)設(shè)計(jì)—構(gòu)建—測(cè)試—學(xué)習(xí)的循環(huán)對(duì)產(chǎn)物的產(chǎn)量、速率、得率等進(jìn)行優(yōu)化，有望使新型抗生素的規(guī)模化合成成為可能[70-71](圖3)。

圖3 合成生物學(xué)設(shè)計(jì)—構(gòu)建—測(cè)試—學(xué)習(xí)循環(huán)方法表征抗生素合成基因簇

4 結(jié)論與展望

傳統(tǒng)的依賴于可培養(yǎng)微生物發(fā)酵的方法已經(jīng)難以發(fā)現(xiàn)新型抗生素。宏基因組等微生物組學(xué)技術(shù)提供了在大量未培養(yǎng)環(huán)境微生物中發(fā)掘新型抗生素的新策略。我們可以充分利用已有的微生物組學(xué)技術(shù)手段對(duì)環(huán)境和人體微生物群落進(jìn)行解析，結(jié)合微生物代謝特征，運(yùn)用培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)分離未知微生物，為拓展傳統(tǒng)可培養(yǎng)微生物發(fā)掘新型抗生素提供可能。同時(shí)，針對(duì)多種人體和環(huán)境微生物群落，開發(fā)高效的生物信息學(xué)和人工智能挖掘方法，篩選出合適的抗生素合成基因簇并表征，建立天然產(chǎn)物合成基因元件庫(kù)。運(yùn)用合成生物學(xué)方法和理念，表達(dá)和調(diào)控相關(guān)抗生素合成基因或者利用基因編輯手段“喚醒”沉默基因；在此基礎(chǔ)上，利用功能基因元件組裝新的抗生素合成基因簇，在鏈霉菌、釀酒酵母等模式宿主中表達(dá)合成相關(guān)新型抗生素，并進(jìn)行抗菌活性和安全性評(píng)價(jià)，有望獲得具有臨床使用價(jià)值的新型抗生素。