超高效液相色譜法快速檢測(cè)稻米中的維生素B1

李滑滑，楊 靜，沈 娜，洪 玲，曾奎杰，張曉燕，梅 廣，黃 力

（湖南省糧油產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心/稻谷及副產(chǎn)物深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410201）

維生素B1在人體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中扮演著重要的角色，不僅以輔酶的形式參與糖的分解代謝，還能起到保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)的作用[1-3]。隨著《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝食品營(yíng)養(yǎng)標(biāo)簽通則》的實(shí)施[4]，維生素B1成為了評(píng)價(jià)稻米營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。日本、美國(guó)等國(guó)家都非常重視稻米中維生素的含量，并相繼研究開發(fā)出許多高維生素含量的稻米食品[5-6]。

當(dāng)前，稻米中維生素B1常采用的檢測(cè)手段是普通的高效液相色譜法[7-9]，但隨著液相色譜系統(tǒng)顆粒度的不斷降低，色譜分離度不斷提高，近年建立的填料粒徑＜2 μm的超高效液相色譜系統(tǒng)，因其超高分離度、超快速度、超高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，得到研究者的廣泛關(guān)注[10-12]。本研究擬對(duì)GB 5009.84—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中維生素B1的測(cè)定》[13]第一法高效液相色譜法前處理過(guò)程中的水解及中和條件進(jìn)行優(yōu)化，采用超高效液相色譜快速測(cè)定稻米中維生素B1的含量，以期為基層實(shí)驗(yàn)室大批量稻米樣品中維生素B1檢測(cè)提供高效快速準(zhǔn)確的測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Acquity uplc 超高效液相色譜儀：沃特世公司；BL-75G型立式壓力蒸汽滅菌器：致微（廈門）儀器有限公司；202-2AB型電熱恒溫干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；鹽酸硫胺素（C12H17ClN4OS·HCl）（純度≥97.0%）：北京索萊寶科技有限公司；稻谷：某糧庫(kù)扦??；大米：市場(chǎng)采購(gòu)；木瓜蛋白酶（酶活力≥800 U/mg） ：北京百奧萊博科技有限公司；淀粉酶（酶活力≥3 700 U/mg） ：上海聯(lián)邁生物工程有限公司；正丁醇(優(yōu)級(jí)純) ：廣州市錦旺化工有限公司；鐵氰化鉀（優(yōu)級(jí)純）： 藝康化工（湖北）有限公司。

1.2 維生素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取鹽酸硫胺素標(biāo)準(zhǔn)品57.8 mg，相當(dāng)于50 mg硫胺素，用0.01 mol/L鹽酸溶液溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，配制成500 μg/mL的維生素B1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于0～4 ℃冰箱保存。臨用前，用水稀釋，得維生素B1質(zhì)量濃度分別為0.02、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.00 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BHC C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）和0.05 mol/L乙酸鈉水溶液（B）；等度洗脫條件：35% A和65% B；流量：0.2 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；激發(fā)波長(zhǎng)：375 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：435 nm；運(yùn)行4 min。

1.4 樣品加標(biāo)

取稻谷樣品用礱谷機(jī)脫殼制成糙米，經(jīng)精米機(jī)脫糠粉制成精米（達(dá)三級(jí)大米以上），用高速旋轉(zhuǎn)粉碎機(jī)粉碎后，制得均勻一致的粉末，稱取5.00 g樣品分別放入100 mL錐形瓶中，添加一定量的維生素B1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，使其樣品中維生素B1的實(shí)際添加含量分別為0.20、0.80、1.40 mg/100 g，避光，室溫過(guò)夜。

1.5 樣品提取與衍生化

1.5.1 樣品提取

稱取5.00 g樣品（試樣制備參照1.4）置于100 mL錐形瓶中，加入60 mL 0.1 mol/L 鹽酸溶液，充分搖勻，塞上軟質(zhì)塞子，在恒溫干燥箱中于121 ℃保持30 min，水解結(jié)束冷卻至40 ℃以下取出，輕搖，加入7 mL 2.0 mol/L乙酸鈉溶液，加入3.0 mL混合酶溶液（稱取3.52 g木瓜蛋白酶，2.54 g淀粉酶，加水定容至100 mL，搖勻，使其呈混懸狀液體），搖勻后，置于培養(yǎng)箱中37 ℃過(guò)夜，將酶解液全部轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，過(guò)濾，取上清液備用。

1.5.2 樣品衍生化

準(zhǔn)確移取上述上清液2.0 mL于10 mL試管中，加入1.0 mL堿性鐵氰化鉀溶液，渦旋混勻后，準(zhǔn)確加入2.0 mL正丁醇，再次渦旋混勻，離心（轉(zhuǎn)速4 000 r/min，5 min），待充分分層后，吸取正丁醇相(上層)經(jīng)0.45 μm有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾，供超高效液相色譜分析用。

另取2.0 mL標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，與試液同步進(jìn)行衍生化。

2 結(jié)果與討論

2.1 水解及中和條件的優(yōu)化

本研究選取2個(gè)不同梯度的樣品（1號(hào)大米樣品、1號(hào)糙米樣品），同一種樣品6份，3份一組做平行試驗(yàn)，分別考察在高壓滅菌鍋和恒溫烘箱中（121 ℃保持30 min ）進(jìn)行水解，測(cè)定維生素B1的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。由表可知，利用恒溫烘箱水解測(cè)得的稻米中維生素B1含量與高壓滅菌鍋水解法的基本一致。

表1 2種水解方法測(cè)得的樣品中維生素B1含量（n=3） mg/100 g

GB 5009.84—2016中指出：“用pH計(jì)指示，用2.0 mol/L 乙酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH至4.0左右”。本研究通過(guò)前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一次性加入7 mL 2.0 mol/L乙酸鈉溶液均可達(dá)到相應(yīng)的效果。通過(guò)對(duì)水解及中和條件的優(yōu)化，避免了高壓滅菌鍋必須由專人操作而帶來(lái)的不便，一次性加入乙酸鈉溶液中和酸液有效地縮短了前處理時(shí)間，可以實(shí)現(xiàn)批量檢測(cè)，大大提高檢測(cè)效率。

2.2 方法的線性范圍、檢出限和定量限

按照優(yōu)化后的色譜條件，在維生素B1標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.020～1.000 μg/mL）范圍內(nèi)取7個(gè)點(diǎn)，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。試驗(yàn)結(jié)果表明，維生素B1含量在0.020～1.000 μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為Y=2.76E+007X-4.55E+005，相關(guān)系數(shù)大于0.999。并以S/N=3、S/N=10分別計(jì)算維生素B1的檢出限和定量限，求得其檢出限為0.4 μg/100 g，定量限為1.3 μg/100 g，能滿足稻米中維生素B1含量的測(cè)定要求。

2.3 方法的回收率與精密度

以1號(hào)大米樣品（0.11 mg/100 g）為基體，添加維生素B1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，按1.4、1.5樣品前處理方法及1.3色譜條件進(jìn)行回收率試驗(yàn)，每個(gè)添加水平做6次平行，考察方法的回收率和精密度，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，添加水平在0.20、0.80、1.40 mg/100 g時(shí)，平均回收率為85.0%～98.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～4.6%，表明該方法準(zhǔn)確性良好。

表2 方法的回收率和精密度（n=6）

2.4 超高效液相色譜與高效液相色譜的比較

利用改進(jìn)的樣品前處理方法，通過(guò)超高效液相色譜儀快速測(cè)定稻米中維生素B1含量，獲得1號(hào)大米樣品與1號(hào)糙米樣品色譜圖如圖1所示。

由圖1可知，在1.3的色譜條件下，超高效液相色譜能快速地將稻米中維生素B1檢測(cè)出來(lái)，其保留時(shí)間在0.85 min左右。而GB 5009.84—2016中的高效液相色譜法在其相應(yīng)的色譜條件下，保留時(shí)間約4 min，并且室溫條件下衍生產(chǎn)物在4 h內(nèi)穩(wěn)定，這都不利于日常的批量檢測(cè)。因此，采用超高效液相色譜測(cè)定稻米中維生素B1更快且更適合批量樣品檢測(cè)。

圖1 超高效液相色譜測(cè)定稻米中維生素B1的色譜圖

此外，對(duì)比圖1中大米與糙米樣品色譜圖發(fā)現(xiàn)測(cè)得的維生素B1保留時(shí)間穩(wěn)定且峰形良好，超高效液相色譜可以很好地對(duì)稻米中維生素B1進(jìn)行定量分析。

2.5 大米與糙米樣品的比較

為更好地了解維生素B1在稻谷籽粒中的分布情況，從糧庫(kù)中扦取5份稻谷樣（樣品編號(hào)：1～5號(hào)大米樣品、1～5號(hào)糙米樣品），市場(chǎng)購(gòu)買5份不同品牌的大米樣（樣品編號(hào)：6～10號(hào)大米樣品），每份樣品進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，稻谷在加工過(guò)程中維生素B1會(huì)有較大的損失。稻谷通過(guò)精米機(jī)脫糠粉制得大米，大米中的維生素B1含量只占糙米中的30.8%～42.9%。大米經(jīng)拋光等加工工藝處理后其維生素B1含量會(huì)進(jìn)一步減少。由此可見(jiàn)，稻米中維生素B1含量主要存在于糠粉層中，這與相關(guān)研究文獻(xiàn)[5-7]的結(jié)果一致。

表3 大米與糙米樣品中維生素B1含量及兩者百分比（n=3）

3 結(jié) 論

本研究利用恒溫烘箱水解法代替高壓滅菌鍋水解法，測(cè)得的維生素B1含量與國(guó)標(biāo)方法無(wú)顯著性差異；一次性加入乙酸鈉溶液簡(jiǎn)化了酸堿的中和步驟；采用超高效液相色譜測(cè)定稻米中維生素B1，其保留時(shí)間穩(wěn)定且峰形良好，可以很好地對(duì)稻米中維生素B1進(jìn)行快速定量分析，在0.02～1.00 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.999，檢出限為0.4 μg/100 g，定量限為1.3 μg/100 g，回收率為85.0%～98.6%，精密度均小于5%。該法能有效地縮短檢測(cè)時(shí)間，實(shí)現(xiàn)批量檢測(cè)，提高了檢測(cè)效率，可滿足基層實(shí)驗(yàn)室大批量稻米樣品中維生素B1快速準(zhǔn)確測(cè)定的需求。另外，稻米中維生素B1主要存在于糠粉層中，隨著稻米加工精度的提高，稻米中維生素B1含量顯著下降，因此后續(xù)應(yīng)對(duì)如何保存稻米中維生素B1開展研究。