柑桔碎葉病毒侵染對“紐荷爾”臍橙光合作用及酶活性的影響

陳 波，陳毅群，黃愛軍，易 龍

(1 贛南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西贛州，341000；2 贛南師范大學(xué)地理與環(huán)境工程學(xué)院，江西贛州，341000)

柑桔碎葉病是柑桔生產(chǎn)中的一種重要病毒性病害，由柑桔碎葉病毒(Citrustatterleafvirus，CTLV)引起，導(dǎo)致患病植株出現(xiàn)矮化，葉片黃化、縮小、邊緣破碎等癥狀，近年在我國湖北、江西、四川和湖南等多個重點(diǎn)柑桔產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，呈現(xiàn)蔓延趨勢，對我國柑桔產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅[1]。江西贛南是我國臍橙主產(chǎn)區(qū)，目前的臍橙種植面積達(dá)11.67 萬hm2(175 萬畝)?！摆M南臍橙”多年來一直位居初級農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志區(qū)域品牌價值榜首，在助力貧困山區(qū)農(nóng)民脫貧致富中發(fā)揮了重要作用。據(jù)研究報道，2017年9月至2018年5月在江西贛南3個果園采集的59份疑似感病的“紐荷爾”臍橙樣品，CTLV檢出率達(dá)23.7%[2]，表明贛南臍橙產(chǎn)業(yè)存在CTLV為害的威脅，在生產(chǎn)中應(yīng)加強(qiáng)防控。

植物受病毒侵染后，植株會表現(xiàn)出一系列的病理變化。如：薇甘菊被薇甘菊萎蔫病毒(Mikaniamicranthawiltvirus，MMWV)侵染后，葉片光合作用的效率降低，表現(xiàn)為葉綠素含量、葉綠素a/b值、凈光合速率和光飽和點(diǎn)均降低，超氧化物岐化酶(SOD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性出現(xiàn)顯著的變化[3]；墨西哥來檬感染柑桔衰退病毒后，葉片光合能力顯著降低，體內(nèi)丙二醛(MDA)含量和POD活性提升[4]；“贛南早”臍橙被柑桔衰退病毒侵染后，葉片葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素總含量和凈光合速率降低，MDA含量和胞間CO2濃度提升，葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)生畸變[5]。目前，關(guān)于CTLV的致病機(jī)理尚不清晰。本研究通過分析CTLV侵染對“紐荷爾”臍橙光合作用和酶活性變化的影響，可為深入研究CTLV的致病機(jī)理和開展抗病育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)苗為1年生枳砧“紐荷爾”臍橙無病苗，由國家臍橙工程技術(shù)研究中心種質(zhì)資源圃提供。嫁接接種CTLV后置于25 ℃左右的隔離網(wǎng)中培養(yǎng)。共25株，接種18個月后 RT-PCR確認(rèn)植株都感染了CTLV。所有供試葉片均為植株頂部向下數(shù)第3—4枚完全展開葉。

1.2 葉片氣孔形態(tài)和葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察

參考易龍等[6]的方法進(jìn)行處理。切取供試植株葉片中央葉脈兩側(cè)約1 cm ×1 cm大小的葉片組織，噴金處理后利用FEI-450型掃描電鏡觀察并拍攝葉片氣孔形態(tài)圖。切取主脈兩側(cè)大小1 mm×1 mm的小片，按照參考文獻(xiàn)[5]的方法處理后，利用透射電鏡 FEI Tecnai G2 20 TWIN對葉綠體超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。

1.3 葉片光合參數(shù)、MDA含量及酶活性測定

利用TU-1901雙光束型紫外可見分光光度計(jì)，參照李合生等[7-10]的方法測定供試植株葉片的光合色素和MDA含量，以及CAT、SOD和POD活性。同時，利用LI-6400型便攜式光合儀，參照于力等[11]的方法測定葉片凈光合速率(Pn)和胞間CO2濃度(Ci)。上述試驗(yàn)均重復(fù)3次，采用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片氣孔形態(tài)及葉綠體超微結(jié)構(gòu)

從電鏡掃描結(jié)果可看出，健康“紐荷爾”臍橙葉片的氣孔狀態(tài)正常，氣孔周圍組織飽滿、平展；感染CTLV的“紐荷爾”臍橙葉片氣孔周圍組織皺縮、凹凸不平，氣孔萎縮(見圖1)。

與健康植株葉綠體相比較，CTLV侵染導(dǎo)致“紐荷爾”臍橙植株葉片葉綠體發(fā)生病變，呈現(xiàn)為葉綠體形態(tài)結(jié)構(gòu)畸變，外膜出現(xiàn)褶皺、邊緣不清晰，淀粉粒變小(見圖1)

圖1 感染CTLV的“紐荷爾”臍橙葉片氣孔形態(tài)和葉綠體超微結(jié)構(gòu)(掃描電鏡)

2.2 葉片光合參數(shù)、MDA含量及酶活性

測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康植株相比，患病“紐荷爾”臍橙葉綠素a、b和葉綠素總含量分別下降了14.2%、12.1%和17.5%，Pn下降10.8%，Ci上升8.7%，MDA含量增加了12.9%，CAT、POD和SOD活性分別提升了11.3%、27.6%和16.3%，差異均達(dá)顯著水平(見表1)。

表1 “紐荷爾”臍橙健康與感染CTLV植株葉片的光合參數(shù)、MDA含量及酶活性

3 討論與結(jié)論

目前對CTLV的研究多集中在檢測技術(shù)和病毒分子特性方面[1，12-13]，未見其致病機(jī)理相關(guān)研究報道。本研究對贛南主栽臍橙品種“紐荷爾”接種感染CTLV后，與對照健康植株相比，發(fā)現(xiàn)感病“紐荷爾”臍橙葉片細(xì)胞間CO2濃度(Ci)增加，葉綠素總含量、葉綠素a含量、葉綠素b含量及凈光合速率(Pn)明顯降低，表明CTLV侵染導(dǎo)致“紐荷爾”臍橙的光合作用減弱，植株生理功能受到影響。同時，患病植株葉片MDA含量增加了12.9%，加大了對寄主細(xì)胞的致傷程度。通過電鏡對葉片葉綠體超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)CTLV侵染還導(dǎo)致葉綠體發(fā)生病變，呈現(xiàn)為形態(tài)結(jié)構(gòu)畸變，外膜出現(xiàn)褶皺、邊緣不清晰，葉綠體內(nèi)淀粉粒變小。這暗示寄主體內(nèi)代謝強(qiáng)度發(fā)生了異常，淀粉?？赡鼙淮x為能量從而提升寄主抗病能力。本研究結(jié)果可為今后進(jìn)一步研究CTLV的致病機(jī)制提供參考。