CRISPR 技術應用于山羊和綿羊育種的研究進展

史玉潔，李芳，王昕

（西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西楊凌 712100）

基因編輯技術是對靶基因進行特異編輯，如突變、敲除或基因的定點整合等，最終達到改變或修飾基因功能的目的，進而影響細胞、器官甚至個體生理性狀的一種基因工程技術?；蚓庉嫾夹g操作簡單且通用性強，主要經(jīng)歷了鋅指核酸酶 （Zinc-Finger Nucleases，ZFN） 技術、轉錄激活樣效應因子核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nucleases，TALEN）技術和規(guī)律成簇間隔短回文重復序列（Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeat，CRISPR）及其相關蛋白（Cas）技術等幾代的發(fā)展歷程，它們的出現(xiàn)使得對任意物種和細胞基因的精準編輯成為可能。其中CRISPR 技術的操作方式和編輯效率明顯優(yōu)于其他早些傳統(tǒng)的基因編輯技術，一經(jīng)出現(xiàn)便被廣泛應用于多個領域，尤其在動植物基因編輯以及改良動物生產(chǎn)性能方面得到成功應用。

羊作為重要的經(jīng)濟動物之一，提供奶、毛、絨、肉、皮等多種動物產(chǎn)品，同時也是重要的實驗動物。利用基因編輯技術提高羊的絨、毛、肉產(chǎn)量、“人源化”羊乳以及作為生物反應器生產(chǎn)藥用蛋白等具有重要意義。本文概述了CRISPR/Cas 系統(tǒng)的發(fā)展歷程、組成及分類、作用方式和原理，總結了CRISPR/Cas 系統(tǒng)近年來在提升山羊和綿羊生產(chǎn)性能方面的應用，并對該技術的發(fā)展前景作了簡要闡述，為我國畜禽種業(yè)的快速、健康和持續(xù)發(fā)展提供參考。

1 CRISPR 系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)與分類

CRISPR 系統(tǒng)是原核生物的一種抵抗外源基因入侵的獲得性免疫系統(tǒng)，也是繼ZFN 和TALEN 后第三代被廣泛應用于基因組精準編輯的人工核酸酶技術。

1.1 CRISPR 系統(tǒng)的研究歷史 1987 年，日本學家Ishino等首次在大腸桿菌的基因中發(fā)現(xiàn)特殊的串聯(lián)間隔重復序列。之后對原核生物的基因組進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，這種重復序列存在于50% 的細菌和95% 的古細菌中。直至2002 年，該基因家族被正式命名為CRISPR，并提出用Cas 來命名相關核酸酶。2008 年，Marraffini 等研究發(fā)現(xiàn)對應的Cas 蛋白主要作用于DNA 序列，CRISPR 可以破壞轉染的外源質粒。2010 年，Garneau 等研究發(fā)現(xiàn)Cas9 是Cas 蛋白中獨特的基因簇，可以由酶介導對目標DNA 進行精準切割。2013年，Le 等優(yōu)化了CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，建立了一個由CRISPR，tracrRNA 和Cas9 組成的基因調控系統(tǒng)，并和Mali 等首次利用CRISPR/Cas 系統(tǒng)介導小鼠和人類的細胞進行基因編輯，成功定點修飾了哺乳動物基因組。這對CRISPR 系統(tǒng)來說具有里程碑式意義，為該技術在基因編輯領域的應用奠定了基礎。此后，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)逐漸成為國內外研究人員青睞的工具，在生命科學各個領域的相關研究迅速增加。

1.2 CRISPR 系統(tǒng)的結構與類型 CRISPR/Cas 系統(tǒng)是細菌為抵抗噬菌體而形成的一種免疫機制，它可以特異識別入侵的病毒序列并對外源入侵DNA 進行切割和降解。CRISPR 是一種特殊的DNA 重復序列，主要包括前導序列、CRISPR 序列和Cas 相關蛋白（圖1）。

圖1 CRISPR/Cas9 位點特征[12]

CRISPR 序列由重復序列（Repeats）和間隔序列（Spacer）相互交替排列組成，重復序列-間隔序列的單元個數(shù)多變，在不同物種甚至同一物種中都可能不同。重復序列高度保守，間隔區(qū)間的回文序列可以形成發(fā)卡結構。間隔序列是被細菌俘獲的外源DNA 序列，主要來自質粒和病毒。相鄰的地方有一段保守序列，被稱作原間隔序列臨近基序（Protospacer Adjacent Motif，PAM），該序列一般由NGG 3個堿基組成（N代表任意堿基），在CRISPR/Cas 系統(tǒng)中起到識別外源DNA 的重要作用。

Cas 基因家族的種類繁多，編碼的蛋白質具有與核苷酸結合的功能以及與核酸酶、聚合酶、解旋酶等多種酶類結合的活性，其編碼的蛋白都可以與CRISPR序列區(qū)域共同發(fā)生作用。

根據(jù)CRISPR RNA（crRNA）成熟的方式及Cas蛋白的種類和功能的差異，可將CRISPR 系統(tǒng)分為兩大類，進而分為6 種亞型（圖2）。第一類為多種效應蛋白復合物組成的干擾靶基因的系統(tǒng)，包含I、III 和IV 型；第二類為單一效應蛋白組成的干擾靶基因的系統(tǒng)，包括II、V 和VI 型。II 型是最為典型、研究最為廣泛的含有Cas9 基因的系統(tǒng)類型。其中Cas9 蛋白具有核酸酶活性，并且在基因附近有一段幫助crRNAs 成熟的反式激活RNA（Trans-activating crRNA，tracrRNA）。Cas9 與crRNA 和tracrRNA 結合，通過構象的變化暴露其核酸酶結構域，結合并切割靶序列，因此產(chǎn)生的雙鏈斷裂通常由同源導向修復（HDR）和非同源末端連接（NHEJ）進行修復。此外還有V 型CRISPR/Cas12a（Cpf1）和VI 型靶向RNA 的CRISPR/Cas13等其他種類的Cas 蛋白也逐漸被發(fā)現(xiàn)，進一步豐富了CRISPR/Cas 系統(tǒng)。

圖2 CRISPR/Cas 系統(tǒng)分類[24-25]

2 CRISPR/Cas9 技術在羊育種研究中的應用

CRISPR/Cas 系統(tǒng)自發(fā)現(xiàn)以來，在基因治療、制作抗體藥物、構建模式動物等方面得到廣泛應用，同時在提升羊的生產(chǎn)性能方面也展開了大量研究，為羊的精準育種提供基礎。

2.1 CRISPR/Cas9 技術在提升羊肉品質研究中的應用已有研究表明肌肉生長抑制素（Myostatin，）是一類能夠對骨骼肌的生長起負調控作用的基因，抑制哺乳動物中的基因可有效促進骨骼肌的生長分化，引起雙肌表型。

2014 年，有研究將CRISPR/Cas9 系統(tǒng)應用于編輯和共4個羊成纖維細胞基因，并利用體細胞核移植（Somatic Cell Nuclear Transp lantation，SCNT）方法成功產(chǎn)生了3 只基因敲除山 羊。2015 年，Crispo 等利 用CRISPR/Cas9 技術和受精卵顯微注射技術高效生產(chǎn)了基因敲除綿羊，新生22 只羔羊中有10 只羊的基因突變，并表現(xiàn)出雙肌表型和體重顯著增加的現(xiàn)象。這些研究為進一步在小反芻動物上應用CRISPR/Cas9 技術提供了有效參考。2016 年，Wang 等通過注射單個sgRNA 至單個細胞階段的羊胚胎中，精確靶向敲除了、-（）和（）基因，且未檢測到脫靶效應，證明了CRISPR/Cas9介導基因組編輯的多重性，以及改善綿羊不同基因決定不同性狀的可能性。直至2019 年，Zhang 等利用CRISPR/Cas9 技術研究了乙酰CoA 酰基轉移酶2（ACCAA2）在綿羊前體脂肪細胞分化過程中的重要作用，為闡述羊肉品質的形成機制奠定基礎。2020 年，Ding 等利用CRISPR/Cas9 技術精確刪除了灘羊的基因的長基因組片段，得到的MSTN 敲除羊體重較野生型羊顯著增加，這為接下來動物模型的構建和基因大片段的刪除或插入的功能研究提供了重要參考。同時，他們還發(fā)現(xiàn)了雙sgRNA 定向CRISPR/Cas9 系統(tǒng)可以高效敲除哺乳動物基因組。

2.2 CRISPR/Cas9 技術在改良羊毛品質研究中的應用羊毛纖維長度和平均纖維直徑是綿羊的重要經(jīng)濟性狀，它與羊毛的產(chǎn)量和質量密切相關。

成纖維細胞生長因子FGFs 家族成員基因被證明在毛發(fā)生長過程中對毛發(fā)生長期有抑制作用，突變基因可以促進毛發(fā)生長并延長毛囊的生長期，進而改善羊毛品質。Wang 等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)將和基因的Cas9 mRNA 和sgRNA顯微注射至山羊胚胎中，成功獲得和FGF5 雙基因修飾的山羊，所得羊只的羊絨產(chǎn)量和生長速度均顯著提高。Li 等利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)編輯中國美利奴細毛羊的基因，獲得了16 只目標位點突變的細毛羊，12 只1 歲基因編輯羊的毛叢自然長度和拉伸長度均顯著長于野生型對照。Zhang 等通過CRISPR/Cas9 干擾基因的表達，出生的6 只美利奴羔羊中有5 只羊的基因位點缺失，羔羊表現(xiàn)出多種毛色圖案，進一步研究發(fā)現(xiàn)，修飾發(fā)生在1個或2個以上的基因拷貝中，在靶向修飾位點前第2 外顯子的9 bp 和5 bp 缺失的額外自發(fā)突變可能涉及被毛顏色的形成。Hao 等設計了2個相反的sgRNA 在絨山羊中成功定位了外膜異常酶受體（）基因，并與編碼Cas9 的質粒共轉染羊成纖維細胞，測序結果顯示變異率達69.7%。胸腺素4（T4）是一個小分子蛋白，包含43個氨基酸殘基，可用于激活毛囊干細胞的遷移和分化。Li 等利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)并結合SCNT技術，以肌源性衛(wèi)星細胞作為核供體獲得了絨山羊基因在CCR5（趨化因子受體5）上的作用軌跡，敲入T4 基因的山羊產(chǎn)絨量增加74.5%。

2.3 CRISPR/Cas9 技術在改造羊乳研究中的應用 羊乳與人乳成分接近，是重要的牛乳補充替代品，尤其適合對牛乳過敏體質的人群，但羊乳含有-乳球蛋白（-lactoglobulin，BLG）等致敏原，能引起人體過敏反應，因此在保證羊乳營養(yǎng)成分的同時去除其中的致敏成分成為提升羊乳品質的重要研究內容。

Zhou 等成功利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)生產(chǎn)了基因敲除的山羊，在靶向敲除基因的山羊乳腺組織中發(fā)現(xiàn)BLG 表達量顯著降低，相關乳蛋白編碼基因也顯著降低，羊奶中BLG 蛋白也不表達。周文君等首次使用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在山羊的基因位點定點敲入人乳鐵蛋白（hLF）的cDNA 序列，在保證羊乳營養(yǎng)價值的同時又減少了羊乳的過敏原性，還發(fā)現(xiàn)10 μmol/L 的RAD51 蛋白激活劑（RS-1）可以顯著提升Cas9 引導的敲入效率。此外，Teng 等利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)結合顯微注射技術成功開發(fā)了一種可以生產(chǎn)富含褪黑素羊奶的綿羊生物反應器，這些基因編輯羊可能成為褪黑激素的良好來源。Huang 等成功使用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)獲得miR-145 敲除的山羊乳腺上皮細胞，miR-145 敲除降低了TAG（Total Cellular Triacylglycerol）和膽固醇含量，并通過降低與脂肪酸合成相關的幾個關鍵基因的表達進而影響脂肪酸組成。

3 CRISPR/Cas9 技術在其他動物育種研究中的應用

CRISPR/Cas 系統(tǒng)已經(jīng)成功在豬上實現(xiàn)了多基因編輯、相關性狀的遺傳改良等，主要是作為模式動物進行相關研究并為人類疾病的研究提供了試驗依據(jù)。Wang 等利用CRISPR/Cas9 和SCNT 有機結合獲得了SIX1-/-和SIX1-/-/SIX4-/-的豬胚胎，其中SIX1-/-/SIX4-/-型豬胚胎表現(xiàn)嚴重的腎臟發(fā)育遲緩。Xie 等利用CRISPR/Cas9 介導敲入靶向pRSAD2 基因質粒，成功獲得豬的pRSAD2-KI 細胞；體外病毒激發(fā)試驗顯示，pRSAD2-KI 細胞能夠有效地降低豬瘟病毒和偽狂犬病病毒的感染；此外還利用SCNT 技術成功生產(chǎn)了1只pRSAD2-KI 豬。

牛的基因編輯技術較其他物種發(fā)展較晚，迄今已開始在基礎疾病相關基因功能研究、改善遺傳特性、提升肉品質及生產(chǎn)藥物蛋白等領域得到廣泛應用。Zhou 等利用截短的CRISPR/Cas9 gRNAs（1、2、3和5 bp）對牛胎兒成纖維細胞的基因進行敲除，發(fā)現(xiàn)截短3 bp 的gRNA 的CRISPR/Cas9-17 質粒能有效降低脫靶效率且不降低?；虼虬行?，豐富了CRISPR/Cas9 技術的編輯策略。Jeong 等利用CRISPR/Cas9 和SCNT 技術結合將基因導入牛成纖維細胞-基因的內含子并獲得了轉（Human Fibroblast Growth Factor 2）基因的囊胚，在細胞水平及胚胎水平成功檢測到了基因的表達。

禽類由于受精卵結構特殊，無法像哺乳動物那樣直接通過核移植獲得基因編輯個體，所以基因編輯技術在禽類上發(fā)展較為緩慢。Lee 等使用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)和雜交技術成功獲得了Z 染色體敲除雞，Z染色體編輯的雞可以在胚胎發(fā)育過程中通過檢測熒光進行性別鑒定。

4 存在問題及發(fā)展前景

CRISPR/Cas9 作為當下最有效、最便捷的基因組編輯技術，已被應用于不同細胞及物種基因組的高精度改造和修飾，在建立動物模型和生物醫(yī)學等方面有巨大潛力。但目前CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的脫靶效應和PAM 序列的局限性仍然是主要缺陷，所以未來的主要發(fā)展方向仍然是降低脫靶效率，提升其特異性、精準性和穩(wěn)定性。

此前有研究發(fā)現(xiàn)，縮短sgRNA 互補區(qū)域長度和增加PAM 序列的長度均可以在保證目標基因組的編輯效率下顯著降低脫靶率。此外，Kim 等發(fā)現(xiàn)給sgRNA5' 端添加2個鳥嘌呤也可顯著增加其識別特異性并降低脫靶率。還有研究將腺相關病毒(Adeno-Associated Virus，AAV) 應用于CRISPR/Cas9系統(tǒng)，可顯著促進其靶向能力并提高編輯效率。Timin 等研究報道了由可降解聚合物微粒并經(jīng)硅殼修飾的微載體可用于CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的傳遞，其轉染效率還明顯高于脂質體。如今的基因編輯技術已經(jīng)進入精準編輯時代，脫靶效應和外源基因的定點插入效率等問題仍需要深入探索。此外，人們也在不斷的優(yōu)化和開發(fā)新的基因編輯技術以期應用于家畜育種、構建動物疾病模型和疾病治療等各個領域。

綜上所述，CRISPR/Cas 系統(tǒng)具有巨大的發(fā)展空間和優(yōu)化潛能，它的編輯效率高、構建簡單、特異性強等的優(yōu)勢將有助于解決畜禽種業(yè)的瓶頸問題，使我國的種業(yè)得到快速、健康和持續(xù)發(fā)展。隨著研究的逐步深入，CRISPR/Cas 系統(tǒng)仍將不斷完善和優(yōu)化，爭取在更多的領域獲得成果。