產(chǎn)殼聚糖酶微生物菌株選育研究進展

許炎芬，賈子民，段先莉，龍 同，李文靜，趙錦芳

（1.湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點實驗室，武漢 430068；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物農(nóng)藥工程研究中心，武漢 430064；3.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華中作物有害生物綜合治理重點實驗室，武漢 430064）

殼聚糖俗稱為甲殼胺，是甲殼素脫去部分N-乙酰基的產(chǎn)物，是地球上存量僅次于纖維素的天然高分子聚合物［1］。殼聚糖酶（Chitosanase）是水解殼聚糖生產(chǎn)高活性殼寡糖（Chitooligosaccharides，COSs）所需的關(guān)鍵酶。殼寡糖具有獨特的生理活性和功能，可提高機體免疫力、抑制腫瘤細(xì)胞生長、在人體腸道內(nèi)可活化增殖雙歧桿菌、降低血壓，同時還具有抗菌防腐、保水保濕等性能，在食品和生物醫(yī)藥行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景［2］。

制備殼寡糖的方法主要有物理法、化學(xué)法和酶解法。與傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法相比，酶解法制備殼寡糖具有明顯優(yōu)勢。1973 年，Monaghan 等［3］研究了來源于微生物的殼聚糖酶，能夠降解接合菌Zygomycete 的細(xì)胞壁，隨后，大量細(xì)菌和真菌被發(fā)現(xiàn)產(chǎn)殼聚糖酶。在一些植物組織和病毒中也存在殼聚糖酶，主要以內(nèi)切方式催化水解部分乙?；瘹ぞ厶侵械摩?1，4-氨基葡萄糖苷鍵，得到特異分子量范圍的殼寡糖。其專一性較強，來源不同，酶學(xué)性質(zhì)也不相同。

天然菌種的產(chǎn)酶能力較低，研究人員通過篩選高產(chǎn)菌株、基因工程改造等方法獲得高產(chǎn)突變株，優(yōu)化微生物的發(fā)酵條件，提高產(chǎn)酶能力和酶活。

1 殼聚糖酶來源及其性質(zhì)

1.1 細(xì)菌來源

產(chǎn)殼聚糖酶細(xì)菌研究較多，主要種類為芽孢桿菌屬（Bacillus）、沙雷氏菌屬（Serratia）、紫色桿菌屬（Janthinobacterium）、多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和微桿菌屬（Microbacterium）［4］。細(xì)菌來源殼聚糖酶及其部分酶學(xué)性質(zhì)見表1。

表1 產(chǎn)殼聚糖酶細(xì)菌及其部分酶學(xué)性質(zhì)

殼聚糖酶是一種差異較大的糖苷水解酶，微生物產(chǎn)生的殼聚糖酶可以分為2 種類型——組成型和誘導(dǎo)型。絕大多數(shù)細(xì)菌來源的殼聚糖酶為誘導(dǎo)型，其分子質(zhì)量一般較小，在20～75 kDa。大多數(shù)殼聚糖酶的較適pH 小于6.5，偏酸性的環(huán)境有利于保持殼聚糖酶的活性。殼聚糖酶的較適反應(yīng)溫度范圍在30～60 ℃，溫度過高，引起酶變性失活；溫度過低，酶反應(yīng)速率低。不同菌屬來源的殼聚糖酶受金屬離子的影響不同，金屬離子Fe3+、Cu2+一般會抑制殼聚糖酶活性，Ca2+、Mn2+是殼聚糖酶的促進劑。此外EDTA 也被證實會抑制該酶的活性，而SDS、還原劑等對提高酶活有一定的促進作用。

1.2 放線菌來源

產(chǎn)殼聚糖酶的放線菌有鏈霉菌屬（Streptomyces）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）和擬無枝菌屬（Amycolatopsis）。鏈霉菌屬研究較多，主要集中于殼聚糖酶基因的克隆、定點突變及異源表達(dá)。Ding等［19］通過密碼子優(yōu)化技術(shù)獲得了Streptomycessp.N174 GH46 家族殼聚糖酶基因的突變株，將野生株和突變株的Csn46 分別在畢赤酵母Pichia pastorisGS115 中表達(dá)，經(jīng)5 L 發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵，野生株殼聚糖酶活為50 000 U/mg，突變株酶活為30 784 U/mg，比野生菌株酶活性降低了40%。野生菌株和突變株殼聚糖酶最適pH 是均為6.0，最適溫度為50 ℃。王劍等［20］對淺玫瑰色鏈霉菌Streptomyces roseolusDH 殼聚糖酶發(fā)酵工藝進行研究，接種量3%，攪拌轉(zhuǎn)速250 r/min，通氣比vvm 2.0 m3/（m3·min），經(jīng)52 h 發(fā)酵，酶活達(dá)到最大，為35.2 U/mL。采用補料工藝發(fā)酵，酶活在60 h 達(dá)到最大，為46.4 U/mL。Wang 等［21］表達(dá)海洋鏈霉菌Streptomyces hygroscopicusR1 殼聚糖酶基因ShCsn46，得到的重組菌株殼聚糖酶最大活性為2 250 U/mL，總蛋白濃度為3.98 g/L。純化后的ShCsn46 的最佳pH 為5.5 ℃，最佳溫度為55 ℃。純化后的ShCsn46能被Mn2+活化，被Cu2+、Fe2+和Al3+抑制。

Akihiro 等［22］通過反向遺傳技術(shù)克隆了擬無枝酸菌屬Amycolatopsissp.CsO-2 的殼聚糖酶基因ctoA，其分子質(zhì)量為27 kDa，并成功在大腸桿菌Escherichia coli中表達(dá)。CtoA 對米根霉（Rhizopus oryzae）具有抗菌活性。

1.3 真菌來源

真菌產(chǎn)生的殼聚糖酶有組成型酶和誘導(dǎo)型酶，其中誘導(dǎo)型酶占主導(dǎo)。組成型殼聚糖酶主要來源于植物病原真菌Fusarium solani，在培養(yǎng)基中不添加殼聚糖也能分泌殼聚糖酶。真菌殼聚糖酶按作用方式分有內(nèi)切酶和外切酶2 種。內(nèi)切酶即殼聚糖酶（E.C.3.2.1.132），屬于GH75 家族，水解殼聚糖生成殼寡糖，外切酶指外切-β-1，4-D-氨基葡糖苷酶（E.C.3.2.1.165），屬于GH2 家族，外切產(chǎn)物為氨基葡萄糖［23］。來源于真菌的殼聚糖酶有白僵菌屬（Beauve-ria）、綠僵菌屬（Metarhizium）、曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）、木霉屬（trichoderma）、鐮刀菌屬（Fusarium）、毛霉屬（Mucor）、紫孢菌屬（Micromonospora）、接合菌屬（Gongronella）等。

1.3.1 白僵菌屬 方祥年等［24］以球孢白僵菌Beauveria bassiana1316 為出發(fā)菌，通過紫外誘變篩選出5 株高產(chǎn)殼聚糖酶的菌株，最高酶活為2.32 U/mL，為原始菌株的16 倍。Liu 等［25］成功克隆了球孢白僵菌的殼聚糖酶基因BbCSN-1，并在畢赤酵母中進行了表達(dá)。經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后，酵母發(fā)酵液中BbCSN-1的含量在6 d 達(dá)到最大值，為398 μg/mL。純化后的BbCSN-1在pH 5.0 和30 ℃時活性表現(xiàn)最佳。金屬離子Mn2+能顯著提高該酶的活性，而Co2+和Cu2+則能顯著抑制其活性。

1.3.2 綠僵菌屬 劉樺等［26］等利用正交試驗得到金龜子綠僵菌Metarhizium anisopliaeAS3.4606 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶的最佳條件為起始pH 5.0、27 ℃下培養(yǎng)120 h，C/N 為1∶4、固液比為1.0∶1.4，綠僵菌發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶最大酶活為35.08 U/g 干培養(yǎng)基。楊俐等［27］研究貴州綠僵菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶，經(jīng)120 h 發(fā)酵后，酶活達(dá)到83.09 U/g 干培養(yǎng)基，利用交聯(lián)殼聚糖樹脂親和層析、Cu2＋洗脫和分子篩分離的方法得到電泳純的殼聚糖酶，酶活回收率為43.52%。

1.3.3 曲霉屬 曲霉殼聚糖酶的研究主要集中在2個方面，一方面通過傳統(tǒng)方法進行高產(chǎn)菌株的篩選及發(fā)酵條件的優(yōu)化，另一方面是克隆曲霉殼聚糖酶基因并進行高效表達(dá)。

閻賀靜等［28］對煙曲霉Aspergillus fumigatusWHSW-01 產(chǎn)殼聚糖酶的條件進行優(yōu)化，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（基礎(chǔ)碳源為1%的葡萄糖）發(fā)酵至12 h 時，添加占發(fā)酵液總體積40%的殼聚糖水解液，產(chǎn)酶量最高為6.78 U/mL，與前期煙曲霉WHSW-01 基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下最高酶活3.7 U/mL，提高了83.24%章曄敏等［29］采用響應(yīng)面法對鹿皮曲霉Aspergillus cervinus ZJOU-AC1 產(chǎn)殼聚糖酶的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。得到最佳發(fā)酵條件為膠體殼聚糖1.5%、（NH4）2SO40.4%、KH2PO40.2%、MgSO40.05%、麩皮2%、Tween-80 0.06%，發(fā)酵溫度30 ℃，初始pH 5.9，接種量為3%。經(jīng)96 h 發(fā)酵，殼聚糖酶酶活為8.26 U/mL，是優(yōu)化前的4.03 倍。

Eom 等［30］采用離子交換色譜和凝膠過濾色譜分離純化了煙曲霉Aspergillus fumigatusKB-1 產(chǎn)生的2種殼聚糖酶。殼聚糖酶I 的分子質(zhì)量為111.23 kDa，最適pH 為6.5，適宜溫度為60 ℃；殼聚糖酶Ⅱ的分子質(zhì)量為23.38 kDa，最適pH 為5.5，適宜溫度為70 ℃。

陳小娥等［31］分離純化了曲霉Aspergillussp.CJ22-326 內(nèi)切殼聚糖酶ChiB，并對其性質(zhì)進行研究，該酶最適溫度為65 ℃，最適pH 為6.0，1 mmol/L Mn2+對ChiB 有強烈激活作用，2 mmol/L Cu2+、Ag+、Hg2+、Cd2+、Fe3+有強烈抑制作用。ChiB 作用的最適底物為脫乙酰度95%的膠體殼聚糖。李松林等［32］采用RACE 方法擴增出曲霉菌CJ22-326 內(nèi)切型殼聚糖酶基因，在大腸桿菌中表達(dá)，利用Ni2+-NTA 柱純化得到融合蛋白，SDS-PAGE 檢測蛋白酶相對分子量為29 kDa。純化后的酶在37 ℃，pH 為6.0 時，酶活達(dá)到1.18 U/mL。

Chen 等［33］克隆了煙曲霉Aspergillus fumigatus耐熱型殼聚糖內(nèi)切酶基因，在畢赤酵母GS115 中能高效表達(dá)。在14 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵，產(chǎn)率為3 mg/mL，酶活達(dá)25 000 U/mL。

1.3.4 青霉屬 趙有璽等［34］探討了接種量、裝液量、搖瓶轉(zhuǎn)速等對突變菌株淡紫擬青霉BJ2-3 產(chǎn)殼聚糖酶的影響，表明接種量8%、裝液量125 mL（500 mL 三角瓶）、搖瓶轉(zhuǎn)速180 r/min 最利于產(chǎn)酶。Aktuganov 等［35］研究青霉菌Penicilliumsp.IB-37-2A，以殼聚糖為主要碳源，主要產(chǎn)生胞外殼聚糖酶，有明顯的抗真菌活性，從發(fā)酵濾液中純化得到外切殼聚糖酶，該外切酶分子質(zhì)量為41 kDa，最優(yōu)pH 為4.0，最優(yōu)溫度為50～55 ℃，Hg2+和Ag+對酶活性有較強的抑制作用。Cao 等［36］從草酸青霉Penicillium oxalicumM2 發(fā)酵液中分離純化了新型胞外殼聚糖酶，該酶分子質(zhì)量為42 kDa，純化后的最大酶活為60.45 U/mg。最優(yōu)pH 為5.5，最佳溫度為60 ℃，Ca2+、Mn2+、非離子表面活性劑（Tween 20/40/60/80 和Trition X-100）和部分常見還原劑（二硫蘇糖醇、DTT 和β-巰基乙醇）對該酶具有顯著的促進作用。

1.3.5 木 霉 屬 劉 萍 等［37］從trichoderma virideXW01 發(fā)酵液中分離到一種殼聚糖酶，該殼聚糖酶的分子質(zhì)量為45 kDa，最適作用溫度為60 ℃，最適pH 為5.0，脫乙酰度對其催化速率影響顯著，Mn2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+對該酶有明顯的促進作用，F(xiàn)e3+、Cu2+和Hg2+對該酶有強烈的抑制作用，該酶以內(nèi)切方式作用于殼聚糖，主要水解產(chǎn)物是四糖以上的殼寡糖。李淑瑞等［38］利用響應(yīng)面方法優(yōu)化綠色木霉液體發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶的培養(yǎng)基，獲得了最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基為Avicel 2.56%、玉米芯1.03%、麩皮0.5%、棉子餅粉4.79%、KH2PO40.2%、（NH4）2SO40.2%、CaCl20.03%、MgSO40.03%，最終發(fā)酵殼聚糖酶活為2.00 IU/mL。

Luis 等［39］研 究 哈 茨 木 霉（Trichoderma harzianum）、柯寧木霉（Trichoderma koningii）、綠色木霉（Trichoderma viride）和多孢木霉（Trichoderma polysporum）在固態(tài)發(fā)酵條件下產(chǎn)殼聚糖酶的能力，評價pH 和溫度對酶活性的影響。結(jié)果表明，pH 對所有供試菌株的酶活性均有顯著影響。當(dāng)pH 為5.0 時，哈茨木霉殼和綠色木霉聚糖酶活性較高，當(dāng)pH 為5.5 時，柯寧木霉聚糖酶和多孢木霉殼聚糖酶活性最高。酶活較適宜的溫度為40～50 ℃。多孢木霉產(chǎn)殼聚糖酶的潛力大，酶活可達(dá)1.4 IU/gds，其后為綠色木霉（1.2 IU/gds）和T 哈茨木霉（1.06 IU/gds）。

1.3.6 鐮刀菌屬 劉懷偉等［40］采用RT-PCR 技術(shù)克隆Fusarium solani的殼聚糖酶基因，在大腸桿菌DE3 菌株中進行融合表達(dá)，純化的殼聚糖酶比活性為2.5 U/mg。該酶在50 ℃時活性最大。將該基因與Kluyveromyces marxianus的INU1A 信號序列融合，在釀酒酵母中實現(xiàn)表達(dá)，殼聚糖酶酶活達(dá)到50.2 mU/mL。

1.3.7 毛霉屬 何灝彥［41］對卷枝毛霉發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶的條件進行優(yōu)化，確定其最佳產(chǎn)酶條件為殼聚糖濃度0.8 g/L、培養(yǎng)溫度40 ℃、培養(yǎng)基pH 5.5、培養(yǎng)時間84 h、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min。

1.3.8 紫霉屬 張馨月等［42］采用單因素和響應(yīng)面設(shè)計法確定了淡紫紫孢菌Purpureocillium lilacinumM7a產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)溫度為33 ℃，初始pH 為6.0。

1.3.9 接合菌屬 Zhou 等［43］研究Gongronellasp.JG，該菌發(fā)酵72 h殼聚糖酶活達(dá)到800 mmol/（min·L），得到的殼聚糖酶分子質(zhì)量為90 kDa，比活性為82 mmol/（min·mg），Mn2+促進酶活，純化出的28 kDa 殼聚糖酶Csn2 屬于GH-75 殼聚糖酶，最佳pH 為5.6，最適溫度為55～60 ℃，Mn2+、Ca2+和Sr2+促進酶活性，較高濃度的Cu2+（10 mmol/L）、ETDA 抑制其活性。用海藻酸鈣和氯化鈣固定化Gongronellasp.JG 細(xì)胞，當(dāng)海藻酸鈉20 g/L、氯化鈣0.1 mol/L、接種量為10 mL 膠珠/100 mL 培養(yǎng)基、膠珠為2.7 mm，初始pH為5.5，溫度為30 ℃時，殼聚糖酶的產(chǎn)量最大，產(chǎn)率為2 429 U/L，比游離細(xì)胞提高了60%［44，45］。

2 殼聚糖酶誘變菌株選育

殼聚糖酶產(chǎn)生菌株的篩選一般方法是以粉末殼聚糖為惟一碳源，用透明圈法平皿法初篩，用搖瓶發(fā)酵法復(fù)篩。自然界中的菌株，殼聚糖酶活性不高，主要通過誘變選育高產(chǎn)菌株，誘變方法有紫外誘變（UV）、亞硝基胍（NTG）誘變、Co60-γ 射線誘變、等離子體誘變、微波誘變及采用多種方法的復(fù)合誘變。

屠潔等［2］以Aspergillus fumigatusCX01 為出 發(fā)菌株，用紫外誘變選育出殼聚糖酶高產(chǎn)菌株4 株，最高酶活為0.955 7 U/mL，比出發(fā)菌株提高50.25%。王艷等［46］以假單胞菌Y8.0為出發(fā)菌株，用亞硝基胍（NTG）、Co60、UV誘變獲突變菌株Y8，酶活達(dá)3.0 U/mL，提高6 倍，并有較好的遺傳穩(wěn)定性。胡遠(yuǎn)亮［47］以Mitsuariasp.141 為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線和Co60-γ 射線誘變，選育到遺傳穩(wěn)定的菌株，酶活提高30.01%。熊妍妍等［48］以Aspergillus cervinusZJOU-AC1 為出發(fā)菌種，用冷源等離子體誘變，最佳誘變時間90 s，獲得1 株穩(wěn)定遺傳的突變菌株，酶活提高50.7%。王俊芳等［8］以Bacillus subtilisG10 為出發(fā)菌，用紫外和微波復(fù)合誘變，選育出一株突變株，酶活為11.82 U/mL，是出發(fā)菌株的6.9 倍。

3 展望

殼聚糖酶可用于制備具有生物活性的殼寡糖和真菌原生質(zhì)體，也可用于植物病原菌病的防治。隨著對殼聚糖酶分子結(jié)構(gòu)、作用機理研究的深入，應(yīng)用更廣泛。篩選出低成本、活性高、不同微生物來源的產(chǎn)殼聚糖酶菌株十分關(guān)鍵。殼聚糖酶菌株選育的研究仍將集中在4 個方面，一是復(fù)合誘變選育酶活性高、熱穩(wěn)定性好的菌株；二是采用基因工程方法構(gòu)建殼聚糖酶高效表達(dá)工程菌；三是發(fā)酵條件優(yōu)化和發(fā)酵工藝改進；四是深入解析殼聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)，研究分離純化相關(guān)技術(shù)，獲得有工業(yè)化生產(chǎn)潛力的菌株。