環(huán)境因子對(duì)中華雙扇蕨孢子萌發(fā)的影響

歐陽(yáng)康婷, 龐金輝, 余小玲, 許展慧, 任海*, 王發(fā)國(guó)*,馬國(guó)華, 劉宗君, 胡明鋒, 張亞堅(jiān), 譚廣文

環(huán)境因子對(duì)中華雙扇蕨孢子萌發(fā)的影響

歐陽(yáng)康婷1,2, 龐金輝1,2, 余小玲3, 許展慧1,2, 任海1,2*, 王發(fā)國(guó)1,2*,馬國(guó)華1, 劉宗君4, 胡明鋒4, 張亞堅(jiān)4, 譚廣文5

(1. 中國(guó)科學(xué)院華南植物園，廣東省應(yīng)用植物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510650；2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣州 510650；4. 廣東南嶺國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局，廣東 韶關(guān) 512727；5. 廣州普邦園林股份有限公司, 廣州 510650)

為了解珍稀瀕危植物中華雙扇蕨()瀕危原因，研究了溫度和濕度對(duì)其孢子萌發(fā)的影響。結(jié)果表明，中華雙扇蕨孢子萌發(fā)能力較強(qiáng)，萌發(fā)方式為型，配子體萌發(fā)為型。中華雙扇蕨孢子繁殖不受溫度影響，而濕度顯著影響孢子繁殖過(guò)程，濕潤(rùn)環(huán)境中孢子正常萌發(fā)，并形成心形配子體，順利長(zhǎng)出幼孢子體；而干旱環(huán)境下孢子難以萌發(fā),配子體形態(tài)不規(guī)則發(fā)育，褶皺增加。中華雙扇蕨在不適環(huán)境下孢子繁殖存在障礙，可能是導(dǎo)致其野生種群及數(shù)量下降的原因之一，對(duì)這類珍稀瀕危植物的就地和遷地保護(hù)需要注意營(yíng)造濕潤(rùn)的生境。

中華雙扇蕨；環(huán)境因子；組織培養(yǎng)；配子體；形態(tài)發(fā)育

許多蕨類植物由于自然和人為干擾而處于珍稀瀕危狀態(tài)，急需開(kāi)展繁殖過(guò)程研究，為保護(hù)和利用提供支撐。蕨類植物是具有兩個(gè)能獨(dú)立生活的植物體，即孢子體和配子體[1]。孢子體和配子體的生活策略并不相同。在野外難以發(fā)現(xiàn)蕨類配子體，而孢子繁殖研究有助于揭示蕨類孢子-配子體-孢子體的發(fā)育過(guò)程。目前，我國(guó)報(bào)道了孢子繁殖研究的僅有34科80屬157種蕨類植物，占全國(guó)蕨類植物總數(shù)的5%[2]，需要對(duì)更多的、尤其是珍稀瀕危蕨類的孢子繁殖進(jìn)行研究。

雙扇蕨科(Dipteridaceae)屬于真蕨綱薄囊蕨亞綱，起源于2.5億年前的中生代早期，有7屬百余種在中生代遍布全球，物種非常豐富，但至今僅存1屬8種，分布在熱帶-亞熱帶地區(qū)，為孑遺植物[1,3]。從一個(gè)地質(zhì)歷史上分布很廣泛的類群成為現(xiàn)在的孑遺類群，這可能與雙扇蕨科植物的繁殖特征和適應(yīng)能力有一定聯(lián)系。中華雙扇蕨()是雙扇蕨科雙扇蕨屬植物，小型或中型草本，陸生或石縫生[4]。中華雙扇蕨具有重要的觀賞、藥用和科研價(jià)值, 被列為珍稀瀕危物種[5]，也是廣東和湖南省重點(diǎn)保護(hù)的野生植物，主要零星分布在中國(guó)廣東、廣西、重慶、貴州、云南、湖南，中南半島和緬甸北部[1]。

目前，關(guān)于中華雙扇蕨的研究主要有分類修正[6]、系統(tǒng)進(jìn)化史評(píng)估[7]、形態(tài)學(xué)[8]和化合物提取及應(yīng)用[9]，對(duì)雙扇蕨()[10]和喜馬拉雅雙扇蕨()[11]的配子體發(fā)育過(guò)程和生長(zhǎng)素與生根關(guān)系的研究已有報(bào)道。Ouyang等[12]在南嶺國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的中華雙扇蕨群落調(diào)查中發(fā)現(xiàn)幼苗數(shù)量少，種群結(jié)構(gòu)衰退，孢子實(shí)生苗極其少見(jiàn)。然而，中華雙扇蕨孢子體積很小，通過(guò)風(fēng)可進(jìn)行遠(yuǎn)距離散播[13]，遇適宜的生境便會(huì)萌發(fā)，推測(cè)中華雙扇蕨孢子繁殖和配子體適應(yīng)能力可能是導(dǎo)致該類群數(shù)量少且物種單一的原因。而配子體形態(tài)對(duì)蕨類演化和發(fā)育以及生態(tài)適應(yīng)具有重要的意義[14]。本研究通過(guò)采集成熟孢子，設(shè)置不同溫度和濕度的培養(yǎng)環(huán)境，探討孢子萌發(fā)率和配子體形態(tài)特征的變化，為中華雙扇蕨的保護(hù)和利用提供科學(xué)參考。

1 材料和方法

1.1 孢子材料

2020年12月初，在南嶺國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)(24° 42′～24°47′ N, 112°51′～112°57′ E)的中華雙扇蕨種群中剪取3株中華雙扇蕨成熟植株的1/2葉片(有成熟孢子囊)，放進(jìn)硫酸紙折成的簡(jiǎn)易信封中帶回實(shí)驗(yàn)室，豎直放置在自然干燥、無(wú)風(fēng)、避光環(huán)境下，約7 d后孢子囊因自然干燥開(kāi)裂，孢子彈射在硫酸紙上, 用1 mL離心管將孢子收集，放入-4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 孢子培育和觀察

取出裝有孢子的離心管，加入1 mL 5% NaClO溶液，不間斷振蕩消毒10 min后，10 000×離心2 min，無(wú)菌水洗滌離心重復(fù)3次，倒出廢液后, 制成孢子懸濁液。用已消毒滅菌的鑷子沾取孢子均勻接種在1/2MS培養(yǎng)基中，設(shè)置自然溫度(10℃,孢子成熟期的均溫)、25℃、不加水和加2 mL水共4組處理，置于人工培養(yǎng)箱(RXZ-1000B型，寧波江南儀器廠)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度10℃/25℃, 濕度78%～80%，光照14 h/d，黑暗10 h/d，光照強(qiáng)度約90mol/(m2·s)。以出現(xiàn)假根為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算萌發(fā)率[15]。統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率后將其轉(zhuǎn)到濕潤(rùn)和干旱泥炭土培養(yǎng)盒中繼續(xù)培養(yǎng)，將2等份已處理的泥炭土用無(wú)菌水充分潤(rùn)濕后，將培養(yǎng)基中片狀體均勻地移入培養(yǎng)盒中并蓋好，相同的水分控制，濕潤(rùn)培養(yǎng)盒3～5 d加水1次，培養(yǎng)條件相同。以上操作均在超凈臺(tái)完成。

接種15 d后開(kāi)始觀察，在孢子開(kāi)始萌發(fā)及配子體發(fā)育時(shí)期，選取典型材料制成臨時(shí)裝片，放置在電鏡(JSM-6360LV, JEOL, Japan)和光學(xué)顯微鏡下(Olympus-BH2, Japan)，并用ECLIPSE-E600相機(jī)(Nikon, Japan)觀察記錄，保持同倍數(shù)鏡頭隨機(jī)選擇5個(gè)視野，拍照計(jì)數(shù)20個(gè)孢子，以平均值為最終結(jié)果[16]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將所有數(shù)據(jù)錄入Microsoft Excel 2013，采用R 3.6.3進(jìn)行單因素方差分析，以<0.01表示差異顯著，使用Adobe Photoshop CC 2019處理圖片。

2 結(jié)果和分析

2.1 孢子囊和孢子形態(tài)

中華雙扇蕨孢子囊近圓形、細(xì)小，橙黃色，肉眼無(wú)法觀察(圖1: A)，具有縱生環(huán)帶，中部開(kāi)裂彈射孢子。成熟孢子為透明色或淺黃綠色，極面觀為橢圓形，兩端稍平鈍；赤道面觀為豆形, 但近極面較平；孢子大小約為20.1m×40.0m; 孢子為單列縫，幾乎長(zhǎng)達(dá)孢子赤道線(圖1: B, C)。還觀察到極個(gè)別孢子為3裂縫(圖1: D)。孢子外壁厚約1.0m (圖1: E)，沒(méi)有明顯的分層現(xiàn)象，附有一層薄薄的外膜，表面光滑，未見(jiàn)清晰的紋飾(圖1: F)。

圖1 中華雙扇蕨孢子囊和孢子。A: 孢子囊; B, C: 單裂縫孢子; D: 三裂縫孢子; E: 孢子壁; F: 孢子紋飾; As: 環(huán)帶; Mi: 單裂縫; Ti: 三裂縫; Sd: 孢子壁; Me: 薄膜。

2.2 孢子萌發(fā)

孢子播種20～25 d體積開(kāi)始稍微變大(圖2: A)，隨后孢子內(nèi)原生質(zhì)逐漸收縮，同時(shí)產(chǎn)生若干個(gè)大小不一的葉綠體細(xì)胞(圖2: B)。35 d后，孢子壁從裂縫處伸出1條假根，似圓狀，無(wú)色透明，有一層薄膜(圖2: C)，隨著假根伸長(zhǎng)，可以清楚地觀察到根部的綠色顆粒物質(zhì)(圖2: D)。初生假根一般垂直于近極面，首端不發(fā)生彎曲，極少數(shù)微微彎曲，向下生長(zhǎng)(圖2: E)。繼續(xù)培養(yǎng)根部顆粒物逐漸消失，慢慢形成枝干形態(tài)(圖2: F)。

圖2 中華雙扇蕨孢子萌發(fā)。A: 孢子變大; B: 初生假根(Pr); C: 假根內(nèi)葉綠體; D: 初生假根基部膨大; E～F: 長(zhǎng)假根。

2.3 片狀體

繼續(xù)發(fā)育至片狀體階段時(shí)，中華雙扇蕨片狀體形態(tài)變化多樣，主要有片形片狀體和立體片狀體。中華雙扇蕨的片狀體有條形、圓形、方形、或者不規(guī)則形(圖3: A～F)，隨著片狀體細(xì)胞不斷分化生長(zhǎng)，其底部假根的數(shù)量也在增加。片狀體的生長(zhǎng)點(diǎn)兩側(cè)細(xì)胞分裂速率快慢，決定了后期原葉體的形狀。隨著片狀體細(xì)胞不斷分裂和發(fā)育，逐漸長(zhǎng)出原葉體(配子體)，但后期也會(huì)出現(xiàn)特殊形狀的片狀體(圖3: F)。

2.4 原葉體

原葉體也稱配子體，正常發(fā)育成熟的原葉體呈對(duì)稱的心形(圖4: A, B)，原葉體邊緣較平滑，假根在腹面兩側(cè)均有生長(zhǎng)(圖4: B)，顏色也逐漸變成淺褐色(圖4: B)。毛狀體會(huì)在配子體時(shí)期出現(xiàn)，為乳突毛狀體，散亂地分布在配子體上(圖4: C)。性器官雜亂地出現(xiàn)在原葉體的腹部假根叢中，或者附著在邊緣細(xì)胞的表面(圖4: C, D)。中華雙扇蕨的頸卵器，與大多數(shù)蕨類植物的頸卵器有著相同的特征,屬于包埋型(圖4: C)。頸卵器發(fā)生在配子體的表面細(xì)胞，其頸部由4列5層細(xì)胞構(gòu)成。成熟的中華雙扇蕨配子體腹面、中肋和邊緣都分布著許多頸卵器, 待發(fā)育成熟后，頂端開(kāi)裂；而精子器散生在原葉體邊側(cè)或背部，圓球形，與水龍骨科(Polypodiaceae)和紫萁科(Osmundaceae)植物精子器相似，均屬于突出型(圖4: D)。在有水環(huán)境下，精子器發(fā)育成熟釋放大量的精子，精子進(jìn)入頸卵器, 與卵結(jié)合進(jìn)而發(fā)育成胚,最終形成幼孢子體(圖4: E, F)。幼孢子體從成熟的原葉體腹面假根中長(zhǎng)出，而原葉體逐漸變透明。一般幼孢子體為兩側(cè)對(duì)稱的心形狀，可以清晰看見(jiàn)孢子葉上有葉脈(圖4: F)。

圖3 中華雙扇蕨的片狀體。A: 條形; B: 圓形; C: 方形; D～E: 不規(guī)則形; F: 特殊形狀片狀體后期。

圖4 中華雙扇蕨原葉體。A, B: 心形原葉體; C: 頸卵器; D: 精子器; E: 幼孢子體; F: 心形幼孢子體; Mt: 乳突毛狀體; Ap: 生長(zhǎng)點(diǎn); Rh: 假根; Ga: 配子體; Ve: 葉脈。

2.5 干旱培養(yǎng)條件下配子體形態(tài)特征

在干旱環(huán)境下培養(yǎng)，原葉體停止發(fā)育或呈不規(guī)則形狀(圖5: A～D)。背部和底部涌現(xiàn)大量假根(圖5: A)，假根由褐色逐漸加深，配子體的褶皺增加(圖5: B～D)，配子體的生長(zhǎng)點(diǎn)附近保持綠色并緩慢生長(zhǎng)，其余部分變?yōu)闇\褐色。

2.6 孢子萌發(fā)率

由圖6可見(jiàn)，在自然溫度(10 ℃)和25 ℃下培養(yǎng)，除第26天自然溫度的萌發(fā)率略低于25 ℃的外，兩者的孢子萌發(fā)率沒(méi)有顯著差異。環(huán)境濕潤(rùn)程度對(duì)孢子的萌發(fā)率有顯著影響(<0.01)，與濕潤(rùn)環(huán)境相比，干旱條件下的孢子萌發(fā)率極低，僅在第50天才觀察到極個(gè)別孢子有萌發(fā)跡象。

3 結(jié)論和討論

3.1 孢子萌發(fā)過(guò)程

中華雙扇蕨孢子繁殖周期約4個(gè)月左右，經(jīng)歷5個(gè)階段，分別是孢子萌發(fā)及初生假根期、絲狀體期、片狀體期、原葉體期和幼孢子體期。首先單裂縫處伸出一條假根，透明伴有葉綠體，在發(fā)育過(guò)程中垂直于單裂縫方向伸長(zhǎng)，偶見(jiàn)假根基部膨大或末端彎曲現(xiàn)象，這在蕨類孢子萌發(fā)中屬常見(jiàn)現(xiàn)象[17]; 絲狀體留存時(shí)間短，片狀體一般為匙狀，配子體多為雌雄同體，頸卵器為四面體，成熟精子器為圓球形。相比于不規(guī)則型的配子體來(lái)說(shuō)，心型配子體更富有活力，較易觀察到幼孢子體的產(chǎn)生，一般從配子體腹部長(zhǎng)出，隨著幼孢子體的生長(zhǎng)，配子體逐漸凋零。

圖5 干旱環(huán)境下中華雙扇蕨的不規(guī)則型配子體(A～D)。Fo: 褶皺; Rh: 假根。

圖6 溫度和濕度對(duì)中華雙扇蕨孢子萌發(fā)率的影響。**: P<0.01。

雙扇蕨屬萌發(fā)方式均為型[10–11]，發(fā)育過(guò)程大致相似，但也存在些許差異。電鏡觀察表明，與雙扇蕨孢子不同，中華雙扇蕨孢子中有透明孢子和黃綠色孢子，數(shù)量相當(dāng)，這在之前的研究中未見(jiàn)報(bào)道。黃綠色的孢子內(nèi)部可能含有葉綠體，即綠色孢子，這種類型的孢子僅存在幾個(gè)相互無(wú)關(guān)聯(lián)的科和屬中，或者部分孢子外殼為黃綠色。有人認(rèn)為綠色孢子相較于非綠色孢子的壽命更短，萌發(fā)更快, 就像不耐干燥和貯藏的頑拗性種子[18–19]。Sandip-kuamr[11]報(bào)道喜馬拉雅雙扇蕨孢子在保存45 d后喪失萌發(fā)活力，而新鮮孢子萌發(fā)能力則很強(qiáng)，中華雙扇蕨孢子的表現(xiàn)與之相同。最近的研究指出綠色孢子也具有干燥耐性，節(jié)節(jié)草()[20]、沼生木賊()[21]、歐紫萁()和莢果蕨()[22]的孢子在合適的儲(chǔ)存方式下能延長(zhǎng)孢子壽命。

在不利的環(huán)境下，與其同屬蕨類不同的是，中華雙扇蕨配子體會(huì)涌現(xiàn)乳突毛狀體，而乳突毛狀體被認(rèn)為具有增強(qiáng)反光、抗旱、抵御昆蟲(chóng)啃食的能力[1]，但現(xiàn)今未有毛狀體作用機(jī)制的相關(guān)解釋。另外，不利環(huán)境抑制了雌雄同體的配子體形成，其中，雙扇蕨會(huì)產(chǎn)生許多精子器，并且有細(xì)長(zhǎng)頸卵器，其頸部由7～9層細(xì)胞組成[10]，而中華雙扇蕨偏向產(chǎn)生更多的頸卵器，兩者的頸卵器發(fā)育均與薄囊蕨類相同[1]。中華雙扇蕨萌發(fā)趨于原始類型，以板塊或團(tuán)塊狀萌發(fā)，與紫萁科、里白科(Gleicheniaceae)相似[23–24]。然而，與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上最近的水龍骨科的萌發(fā)方式不同，水龍骨科發(fā)育方式有型和型[25]。這表明中華雙扇蕨孢子萌發(fā)方式雖表現(xiàn)為原始類型，但黃綠色的孢子，乳突毛狀體等現(xiàn)象的發(fā)生，說(shuō)明中華雙扇蕨處于較進(jìn)化的位置,其配子體應(yīng)具有一定的抗逆性。

3.2 濕度影響中華雙扇蕨孢子萌發(fā)

中華雙扇蕨孢子萌發(fā)類型屬于型。在無(wú)菌培養(yǎng)中約20～25 d開(kāi)始萌發(fā)，在不含任何營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的無(wú)菌水中也可萌發(fā)，說(shuō)明中華雙扇蕨孢子萌發(fā)要求不高，萌發(fā)能力強(qiáng)，不存在任何休眠期，因此，中華雙扇蕨孢子的萌發(fā)特性不會(huì)導(dǎo)致其野外種群更新困難。而在不同溫度、濕度和凋落物濃度培養(yǎng)條件下，溫度對(duì)中華雙扇蕨孢子萌發(fā)并沒(méi)有影響，然而，濕度對(duì)孢子萌發(fā)有顯著影響。首先，干旱環(huán)境下孢子不能順利完成吸脹吸水過(guò)程。而中華雙扇蕨恰巧在旱季(9月至次年1月份)產(chǎn)生孢子，降雨少，土壤極干，向下挖掘30 cm也不見(jiàn)潮濕的土壤，這可能是中華雙扇蕨野生孢子實(shí)生苗少的原因之一。其次，中華雙扇蕨的孢子遭遇長(zhǎng)時(shí)間缺水可能引起其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變異、損壞，而無(wú)法開(kāi)始萌發(fā)。

蕨類孢子的萌發(fā)機(jī)制遵循與種子相同的原理[26]。大多數(shù)蕨類孢子吸水后體積變大，內(nèi)部親水物質(zhì)吸引水分子，代謝活動(dòng)增強(qiáng)，啟動(dòng)一系列生理反應(yīng)。然而，有研究表明僅10%的蕨類物種具有較好的耐干旱性[27]。蕨類孢子在遭遇干旱時(shí)，孢子細(xì)胞體積減小[28]，細(xì)胞原生質(zhì)或脂質(zhì)體從流體結(jié)構(gòu)變成固體結(jié)構(gòu)[29]，Walters[30]認(rèn)為細(xì)胞在干燥環(huán)境中容易處于不穩(wěn)定狀態(tài)，極易超過(guò)細(xì)胞體積的最小閾值。相關(guān)研究也表明，固體結(jié)構(gòu)中因分子的聚集阻礙了分子遷移速率，細(xì)胞基質(zhì)可能喪失生存活力[31–33]。

3.3 干旱環(huán)境下中華雙扇蕨配子體褶皺增加

中華雙扇蕨配子體在適宜環(huán)境下可以順利發(fā)育出性器官并完成受精，干旱條件下的中華雙扇蕨配子體的體型變大，形狀不規(guī)則化，假根增生，性器官數(shù)量比例分配不均。據(jù)此，我們猜測(cè)中華雙扇蕨的配子體具有一定耐旱性，其復(fù)雜的形態(tài)可短暫地抵抗干旱。不同于種子植物通過(guò)增厚葉片，改變?nèi)~片角度等方式來(lái)減少水分蒸發(fā)，抗旱能力較強(qiáng)的蕨類配子體通常具有復(fù)雜的形態(tài)[34]。Watkins[35]研究發(fā)現(xiàn)蕨類配子體復(fù)雜多變的褶皺可能在干燥生境中對(duì)物種的生存起著重要作用。水龍骨科、骨碎補(bǔ)科(Davalliaceae)、條蕨科(Oleandraceae)等蕨類種群多達(dá)60%～70%為附生或干旱陸生物種，大多數(shù)配子體形態(tài)復(fù)雜多變，褶皺重疊彎曲[35]，從而形成微小空間的高濕空氣，延長(zhǎng)并保持了濕潤(rùn)和光合作用的時(shí)間[36]。Pittermann等[37]報(bào)道短葉風(fēng)鈴草()復(fù)雜形態(tài)配子體的干燥速度遠(yuǎn)慢于具有簡(jiǎn)單形態(tài)的陸生植物糠秕藻()。因此, 我們推測(cè)中華雙扇蕨配子體在遭遇干旱或缺乏自由水的情況下，通過(guò)豐富其配子體形態(tài)變化和生理活動(dòng)調(diào)節(jié)來(lái)獲得存活和完成受精的機(jī)會(huì)，還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)觀察證據(jù)。

中華雙扇蕨的瀕危原因包括生境脅迫、孢子萌發(fā)受阻和配子體發(fā)育畸形3個(gè)方面。歷史時(shí)期中華雙扇蕨由于古氣候的重大變化和地質(zhì)活動(dòng)使得該蕨生境面積狹窄，呈零星分布；而在惡劣(干旱)的環(huán)境下，孢子難以萌發(fā)或配子體形態(tài)畸變導(dǎo)致其生存與擴(kuò)繁的機(jī)會(huì)渺茫，種群數(shù)量不易增加，種群更新困難。孢子繁殖對(duì)于蕨類種群擴(kuò)張和更新是極其重要的途徑。因此，對(duì)中華雙扇蕨實(shí)施就地保護(hù)過(guò)程中，可以在孢子萌發(fā)季節(jié)通過(guò)噴灌改善其萌發(fā)條件。在遷地保護(hù)時(shí)，營(yíng)造濕潤(rùn)的生境很重要。當(dāng)然，還可結(jié)合人工分株繁殖和人工孢子繁殖方法幫助育苗用于園林綠化。而針對(duì)瀕危蕨類物種，應(yīng)對(duì)其生境特點(diǎn)、孢子特性、配子體發(fā)育規(guī)律和繁殖生物學(xué)等進(jìn)行系統(tǒng)研究來(lái)制定科學(xué)高效的保護(hù)措施。

致謝 感謝黃耀、周婉敏同學(xué)在野外采樣工作中的幫助；感謝中國(guó)科學(xué)院華南植物園公共實(shí)驗(yàn)室胡曉穎老師在電鏡觀察實(shí)驗(yàn)中的悉心教學(xué)；感謝哈爾濱師范大學(xué)劉保東教授提供的幫助。

[1] LU S G, ZHANG G F, SU W H, et al. Pteridology [M]. Beijing: Higher Education Press, 2007: 12.

陸樹(shù)剛, 張光飛, 蘇文華, 等. 蕨類植物學(xué)[M]. 北京: 高等教育出版社, 2007: 12.

[2] YAN Y H, LIU H M, WANG F G. Fern garden in China’s main Botanical Gardens [J]. Landscape Archit, 2014(3): 16–21. doi: 10.3969/ j.issn.1000-0283.2014.03.003.

嚴(yán)岳鴻, 劉紅梅, 王發(fā)國(guó). 中國(guó)主要植物園中的蕨園[J]. 園林, 2014(3): 16–21. doi: 10.3969/j.issn.1000-0283.2014.03.003.

[3] SKOG J E. Biogeography of Mesozoic leptosporangiate ferns related to extant ferns [J]. Brittonia, 2001, 53: 236–269. doi: 10.1007/BF02 812701.

[4] WANG R J. The Key Protected Plants of Guangdong [M]. Guangzhou: Guangdong Science and Technology Press, 2019: 81.

王瑞江. 廣東重點(diǎn)保護(hù)野生植物[M]. 廣州: 廣東科技出版社, 2019: 81.

[5] TAN H N, YANG Y, DONG S Y, et al. Threatened species list of China’s higher plants [J]. Biodiv Sci, 2017, 25(7): 696–744. doi: 10. 17520/biods.2017144.

覃海寧, 楊永, 董仕勇, 等. 中國(guó)高等植物受威脅物種名錄[J]. 生物多樣性, 2017, 25(7): 696–744. doi: 10.17520/biods.2017144.

[6] LU S G, TIAN Z J. A taxonomic revision of the Dipteridaceae from Yunnan, China [J]. Plant Sci J, 2011, 29(4): 432–434. doi: 10.3724/SP. J.1142.2011.40432.

陸樹(shù)剛, 田治蛟. 云南雙扇蕨科植物的分類訂正研究[J]. 植物科學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 29(4): 432–434. doi: 10.3724/SP.J.1142.2011.40432.

[7] CHOO T Y S, ESCAPA I H. Assessing the evolutionary history of the fern family Dipteridaceae (Gleicheniales) by incorporating both extant and extinct members in a combined phylogenetic study [J]. Amer J Bot, 2018, 105(8): 1315–1328. doi: 10.1002/ajb2.1121.

[8] CHANDRA S, KAUR S. Vasculature of the rhizome in the fern genus dipteris[J]. Amer Fern J, 1993, 83(2): 71–72. doi: 10.2307/1547571.

[9] WANG K. Chemical constituents of 6 species, such as,, et al. [D]. Kunming: Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, 2010.

王扣. 蘇鐵蕨、纖枝金絲桃等六種植物的化學(xué)成分[D]. 昆明: 中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所, 2010.

[10] STOKEY A G. The gametophyte of[J]. Int J Plant Sci, 1945, 106(4): 402–411. doi: 10.1086/335312.

[11] BEHERA S K, RAWAT V K, SINGH A P, et al. Studies on the spore germination, developmental pattern and sexuality of gametophytes in(R. Br. ex Hook. et Grev.) T. Moore [J]. Ind Fern J, 2011, 28(1/2): 172–178.

[12] OUYANG K T, REN H, XU Z H, et al. Habitat characteristics and population structure of, a relict plant in China [J]. Appl Ecol Environ Res, 2021, 19(3): 1939–1951. doi: 10.15666/aeer/ 1903_19391951.

[13] NOBLIN X, ROJAS N O, WESTBROOK J, et al. The fern sporran- gium: A unique catapult [J]. Science, 2012, 335(6074): 1322. doi: 10. 1126/science.1215985.

[14] GUO Y D, CAO J G, DAI X L, et al. Gametophyte development and apogamy of the fern[J]. Bull Bot Res, 2014, 34 (3): 322–327. doi: 10.7525/j.iissn.1673–5102.2014.03.006.

郭嚴(yán)冬, 曹建國(guó), 戴錫玲, 等. 舟山碎米蕨配子體發(fā)育及無(wú)配子生殖[J]. 植物研究, 2014, 34(3): 322–327. doi: 10.7525/j.iissn.1673– 5102.2014.03.006.

[15] NAYAR B K, KAUR S. Gametophytes of homosporous ferns [J]. Bot Rev, 1971, 37(3): 295. doi: 10.1007/BF02859157.

[16] SHEN J, LI X G, DAI X L, et al. The effect of temperature and spore sterilization on the gametophyte development ofHoltt [J]. J Shanghai Norm Univ (Nat Sci), 2009, 38(3): 293–296. doi: 10.3969/j.issn.1000-5137.2009.03.012.

沈建, 李新國(guó), 戴錫玲, 等. 溫度及孢子消毒對(duì)黃腺羽蕨配子體發(fā)育的影響 [J]. 上海師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2009, 38(3): 293– 296. doi: 10.3969/j.issn.1000-5137.2009.03.012.

[17] WEI X P, ZHANG X C. Distributional patterns of the monolete and trilete ferns in China [J]. Biodiv Sci, 2016, 24(10): 1129–1134. doi: 10. 17520/biods.2016219.

魏雪蘋(píng), 張憲春. 蕨類植物不同孢子裂縫類型在中國(guó)的分布格局 [J]. 生物多樣性, 2016, 24(10): 1129–1134. doi: 10.17520/biods.2016219.

[18] LLOYD R M, KLEKOWSKI J R E J. Spore germination and viability in pteridophyta: Evolutionary significance of chlorophyllous spores [J]. Biotropica, 1970, 2(2): 129–137. doi: 10.2307/2989770.

[19] DYER A F. The Experimental Biology of Ferns [M]. London: Aca- demic Press, 1979: 253–305.

[20] BALLESTEROS D, ESTRELLES E, WALTERS C, et al. Effect of storage temperature on green spore longevity for the fernsand[J]. Cryo Lett, 2011, 32(2): 89–98.

[21] MAGRINI S, SCOPPOLA A. First results from conservation studies of chlorophyllous spores of the Royal fern (, Osmun- daceae) [J]. Cryobiology, 2012, 64(1): 65–69. doi: 10.1016/j.cryobiol. 2011.10.001.

[22] LóPEZ-POZO M, BALLESTEROS D, LAZA J M, et al. Desiccation tolerance in chlorophyllous fern spores: Are ecophysiological features related to environmental conditions? [J]. Front Plant Sci, 2019, 10: 1130. doi: 10.3389/fpls.2019.01130.

[23] ZHANG Y H, SHI Q, AI J G, et al. Tissue culture and rapid propa- gation of(Thunb.) Ching [J]. Plant Physiol Commun, 2010, 46(5): 473–474. doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2010.05.007.

張延恒, 施瓊, 哀建國(guó), 等. 里白的組織培養(yǎng)與快速繁殖 [J]. 植物生理學(xué)通訊, 2010, 46(5): 473–474. doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2010.05.007.

[24] DAI X L, ZHOU J, CAO J G. The analysis of the primitive features offrom gametophyte [J]. Bull Biol J, 2019, 54(11): 3– 4. doi: 10.3969/j.issn.0006-3193.2019.11.002.

戴錫玲, 周潔, 曹建國(guó). 從配子體世代再談紫萁的原始特征[J]. 生物學(xué)通報(bào), 2019, 54(11): 3–4. doi: 10.3969/j.issn.0006-3193.2019.11.002.

[25] JIANG N. Phylogeny of the Polypodiaceae in China [D]. Shanghai: Shanghai Normal University, 2011: 48–49. doi: 10.7666/d.y1868256.

姜楠. 中國(guó)水龍骨科植物的系統(tǒng)演化研究 [D]. 上海: 上海師范大學(xué), 2011: 48–49. doi: 10.7666/d.y1868256.

[26] BANKS J A. Gametophyte development in ferns [J]. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 1999, 50: 163–186. doi: 10.1146/annurev.ar plant.50.1.163.

[27] LóPEZ-POZO M, FERNáNDEZ-MARíN B, GARCíA-PLAZAOLA J I, et al. Desiccation tolerance in ferns: From the unicellular spore to the multi-tissular sporophyte [M]// FERNáNDEZ H. Current Advances in Fern Research. Cham: Springer, 2018: 401–426. doi: 10.1007/978- 3-319-75103-0_19.

[28] SHAMBLIN S L, TANG X L, CHANG L Q, et al. Characterization of the time scales of molecular motion in pharmaceutically important glasses [J]. J Phys Chem B, 1999, 103(20): 4113–4121. doi: 10.1021/jp 983964+.

[29] BALLESTEROS D, HILL L M, WALTERS C. Variation of desiccation tolerance and longevity in fern spores [J]. J Plant Physiol, 2017, 211: 53–62. doi: 10.1016/j.jplph.2017.01.003.

[30] WALTERS C. Orthodoxy, recalcitrance and in-between: Describing variation in seed storage characteristics using threshold responses to water loss [J]. Planta, 2015, 242(2): 397–406. doi: 10.1007/s00425- 015-2312-6.

[31] BUITINK J, LEPRINCE O, HEMMINGA M A, et al. Molecular mobility in the cytoplasm: An approach to describe and predict lifespan of dry germplasm [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(5): 2385– 2390. doi: 10.1073/pnas.040554797.

[32] ROUSSENOVA M, MURITH M, ALAM A, et al. Plasticization, antiplasticization, and molecular packing in amorphous carbohydrate- glycerol matrices [J]. Biomacromolecules, 2010, 11(12): 3237–3247. doi: 10.1021/bm1005068.

[33] FUNDO J F, QUINTAS M A C, SILVA C L M. Molecular dynamics and structure in physical properties and stability of food systems [J]. Food Eng Rev, 2015, 7(4): 384–392. doi: 10.1007/s12393-015-9109-z.

[34] WATKINS JR J E, CARDELúS C L. Ferns in an angiosperm world: Cretaceous radiation into the epiphytic niche and diversification on the forest floor [J]. Int J Plant Sci, 2012, 173(6): 695–710. doi: 10.1086/ 665974.

[35] WATKINS JR J E, MACK M C, SINCLAIR T R, et al. Ecological and evolutionary consequences of desiccation tolerance in tropical fern gametophytes [J]. New Phytol, 2007, 176(3): 708–717. doi: 10.1111/j. 1469-8137.2007.02194.x.

[36] DASSLER C L, FARRAR D R. Significance of gametophyte form in long-distance colonization by tropical, epiphytic ferns [J]. Brittonia, 2001, 53(2): 352–369. doi: 10.1007/BF02812705.

[37] PITTERMANN J, BRODERSEN C, WATKINS JR J E. The physio- logical resilience of fern sporophytes and gametophytes: Advances in water relations offer new insights into an old lineage [J]. Front Plant Sci, 2013, 4: 285. doi: 10.3389/fpls.2013.00285.

Effects of Environmental Factors on Spore Germination of

OUYANG Kangting1,2, PANG Jinhui2, YU Xiaoling3, XU Zhanhui1,2, REN Hai1,2*, WANG Faguo1,2*, MA Guohua1, LIU Zongjun4, HU Mingfeng4, ZHANG Yajian4, TAN Guangwen5

(1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Applied Botany, South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences,Guangzhou 510650, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049, China; 3. Zhongkai University of Agriculture and Engineering,Guangzhou 510650, China; 4. Guangdong Nanling National Nature Reserve Administration,Shaoguan 512727, Guangdong, China; 5. Pubang Landscape Architecture Co., Ltd,Guangzhou 510600, China)

To understand the endangered reasons of, a rare and endangered plant, the effects of temperature and humidity on spore germination was studied. The results showed that the spore germination ability was strong, with-type germination mode and-type gametophyte germination. The spore propagation ofwas not affected by temperature, while significantly influenced by humidity. The spores germinated normally in humid condition, forming heart-type gametophytes, and producing young sporophytes successfully. However, spores could not germinate under drought condition, gametophytes were inclined to irregularly development and folds increased. Therefore, the obstacles in spore reproduction ofunder unsuitable environment might be one of the reasons leading to the decline of wild population, so thatandconservation of these rare and endangered plants should pay attention to creating moist habitats.

; Environmental factor; Tissue culture; Gametophyte; Morphological development

10.11926/jtsb.4422

2021-04-08

2021-07-05

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2019B121202006); 廣東省野生動(dòng)植物保護(hù)管理項(xiàng)目資助

This work was supported by the Project for Science and Technology in Guangdong (Grant No. 2019B121202006), andthe Project for Wildlife Protection and Management in Guangdong.

歐陽(yáng)康婷，女，碩士研究生，主要從事園林種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)與利用研究。E-mail: 865970586@qq.com

. E-mail: renhai@scbg.ac.cn, wangfg@scbg.ac.cn