基于小RNA測(cè)序的甜櫻桃病毒種類檢測(cè)及鑒定

趙志惠，李豐，朱天生*，高瑞，孫玉剛

(1.塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院/南疆農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/南疆特色果樹高效優(yōu)質(zhì)栽培與深加工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300；2.山東省果樹研究所，山東泰安 271000)

櫻桃病毒病是威脅甜櫻桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要病害，感病后其產(chǎn)量和品質(zhì)顯著下降，嚴(yán)重阻礙了櫻桃產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。目前，已報(bào)道侵染核果類果樹的病毒至少有29種[1]，其中，李屬壞死環(huán)斑病毒(Prunusnecroticringspotvirus， PNRSV)[2-4]、李矮縮病毒(Prunusdwarfvirus， PDV)[4-6]、蘋果褪綠葉斑病毒(Applechloroticleafspotvirus， ACLSV)[6]、櫻桃銼葉病毒(Cherryraspleafvirus， CRLV)[7]、櫻桃病毒 A(CherryvirusA， CVA)[8]、櫻桃綠環(huán)斑駁病毒(Cherrygreenringmottlevirus， CGRMV)[9]和櫻桃小果病毒2(Littlecherryvirus2， LChV2)[10]等是甜櫻桃上發(fā)生最普遍、危害較為嚴(yán)重的病毒。

常規(guī)植物病毒病害的檢測(cè)方法主要有指示植物法、電子顯微鏡技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和分子生物學(xué)技術(shù)等。阮小鳳等利用酶聯(lián)免疫吸附法在甜櫻桃上檢測(cè)到了李屬壞死環(huán)斑病毒、李矮縮病毒、蘋果褪綠葉斑病毒及蘋果花葉病毒等病毒[6]。王文文等通過分子生物學(xué)技術(shù)首次在環(huán)渤海灣地區(qū)檢測(cè)出櫻桃小果病2和櫻桃病毒病A復(fù)合侵染，復(fù)合檢測(cè)率為37.3%[11]。周攀登等通過多重RT-PCR方法檢測(cè)到櫻桃病毒的復(fù)合侵染[12]。這些方法在已知病毒引起的病毒病害檢測(cè)上針對(duì)性強(qiáng)，但對(duì)于新病毒的發(fā)現(xiàn)較為困難，而高通量測(cè)序技術(shù)則是對(duì)小RNA進(jìn)行測(cè)序，并組裝和注釋來檢測(cè)病毒和發(fā)現(xiàn)新病毒，用于病毒病害鑒定具有巨大優(yōu)勢(shì)，不易出現(xiàn)漏檢和錯(cuò)檢現(xiàn)象[13]。利用高通量測(cè)序技術(shù)賴丁王等首次在南繁區(qū)水稻樣品中檢測(cè)到水稻黃矮病毒[14]；辛敏等在河南開封西瓜病毒病樣品中檢測(cè)出3種未知RNA病毒[15]；洪怡等發(fā)現(xiàn)納雍地區(qū)瑪瑙紅櫻桃病毒病主要是櫻桃小果病2[13]。

土耳其研究者早在2008年發(fā)現(xiàn)啤酒花矮化類病毒(Hopstuntviroid，HSVd)侵染甜櫻桃和酸櫻桃，國內(nèi)2017 年首次報(bào)道在表現(xiàn)斑果病(Dapple fruit)癥狀的紅燈甜櫻桃中檢測(cè)到了啤酒花矮化類病毒，并發(fā)現(xiàn)在山東、遼寧和山西等甜櫻桃產(chǎn)區(qū)普遍存在。甜櫻桃斑果病在果實(shí)上的癥狀與“花臉”癥狀相似，雖然檢測(cè)到了啤酒花矮化類病毒的存在[16]，但未明確表現(xiàn)該癥狀果實(shí)中病毒的種類。筆者通過對(duì)2個(gè)表現(xiàn)“花臉”癥狀的甜櫻桃樣品進(jìn)行小RNA測(cè)序，明確了甜櫻桃“花臉”病的主要病毒種類，為甜櫻桃病毒病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

表現(xiàn)“花臉”癥狀的2個(gè)甜櫻桃采自山東省煙臺(tái)市福山區(qū)，品種均為美早。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及檢測(cè) 將采集的2個(gè)“花臉”癥狀甜櫻桃樣品分別編號(hào)YT-1和YT-2，取適量樣品加入液氮研磨至粉末狀，并按照植物總RNA提取試劑盒TRIzol說明書提取總RNA。將提取到的RNA進(jìn)行質(zhì)量、濃度、純度及完整性檢驗(yàn)。

1.2.2 小RNA測(cè)序 選擇質(zhì)量合格的總RNA送至北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行小RNA深度測(cè)序。使用Small RNA Sample Pre Kit構(gòu)建文庫，直接在小RNA兩端加上接頭，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PAGE膠電泳分離目標(biāo)DNA片段，切膠回收得到cDNA文庫。使用Agilent對(duì)得到的cDNA文庫進(jìn)行insert size檢測(cè)，符合預(yù)期后使用q-PCR對(duì)文庫有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量。文庫檢測(cè)合格后，上機(jī)進(jìn)行HiSeq/MiSeq測(cè)序。

1.2.3 數(shù)據(jù)過濾及18～26 nt的小RNA篩選 將測(cè)序得到的raw reads進(jìn)行處理和過濾，并富集長(zhǎng)度主要是21 nt，22 nt和24 nt的siRNAs。對(duì)過濾得到的clean reads，篩選長(zhǎng)度18～26 nt的小RNA來進(jìn)行分析。

1.2.4 病毒種類篩選 利用Velet對(duì)獲取的小RNA進(jìn)行組裝，并與寄主基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，除去寄主基因組序列。將去除寄主基因序列后的contigs用blastx與核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，尋找與contigs高度同源的序列。未比對(duì)到的則與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，尋找部分同源序列。將尋找到的高度同源序列和部分同源序列分別與病毒核苷酸數(shù)據(jù)庫和蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，篩選出與病毒序列同源的contigs，評(píng)估為候選病毒。

2 結(jié)果與分析

2.1 癥狀表現(xiàn)

2株感病的甜櫻桃葉片無明顯癥狀表現(xiàn)，果實(shí)表現(xiàn)為著色不均勻，表面不平滑，表現(xiàn)為“花臉”癥狀(圖1)。

圖1 感病植株果實(shí)表現(xiàn)癥狀

2.2 小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

測(cè)序數(shù)據(jù)表明，YT-1和YT-2兩個(gè)文庫測(cè)序結(jié)果分別獲得原始讀數(shù)(raw reads)14 190 241條和14 954 849條，過濾掉低質(zhì)量、污染讀數(shù)后，獲得clean reads分別為13 485 830條和14 408 784條，其clean reads與raw reads的比例均95%以上，符合后續(xù)數(shù)據(jù)分析要求(表1)。

表1 小RNA高通量測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計(jì)

2.3 18～26 nt長(zhǎng)度的小RNA條數(shù)

YT-1 和YT-2樣品獲得小RNA長(zhǎng)度在18～26 nt分布有7966 682條和11 123 054條(表2)。小RNA長(zhǎng)度主要集中在20～24 nt，YT-1樣品以22 nt和24 nt占比較高，22 nt小RNA占篩選總數(shù)的12.77%，24 nt小RNA占篩選總數(shù)的32.95%；YT-2樣品以20 nt和24 nt占比較高，20 nt小RNA占篩選總數(shù)的17.29%，24 nt小RNA占篩選總數(shù)的30.66%(圖2)。

表2 18～26 nt小RNA的條數(shù)

圖2 小RNA序列長(zhǎng)度分布

2.4 小RNA的拼接與注釋

對(duì)篩選所獲得的18～26 nt小RNA進(jìn)行拼接，YT-1和YT-2分別獲得3 202條和2 430條contigs。YT-1樣品在病毒核酸數(shù)據(jù)庫和病毒蛋白數(shù)據(jù)庫分別注釋到91條和147條contigs；YT-2樣品在病毒核酸數(shù)據(jù)庫和病毒蛋白數(shù)據(jù)庫分別注釋到54條和84條contigs(表3)。

表3 感病甜櫻桃小RNA在數(shù)據(jù)庫的contig注釋數(shù)量

2.5 候選病毒

YT-1樣品中鑒定到6種候選病毒，其中與櫻桃小果病毒2(LChV2)同源的contigs最多，為52 539條，占總候選病毒的55.12%；其次是李屬壞死環(huán)斑病毒(PNRSV)，為21 185條，占總候選病毒22.23%；與櫻桃病毒A(CVA)同源的contigs有12 759條，占總候選病毒的13.39%；與李樹皮壞死莖紋孔伴隨病毒(Plumbarknecrosisstempitting-associatedvirus， PBNSPaV)同源的contigs為7 133條，占7.48%；與櫻桃綠環(huán)斑駁病毒(CGRMV)同源的contigs為1 618條，占1.70%；啤酒花矮化類病毒(HSVd)有82條，占0.08%。

YT-2樣品中鑒定到4種候選病毒，其中李屬壞死環(huán)斑病毒(PNRSV)同源的contigs最多，為70 781條，占總候選病毒的59.05%；其次是櫻桃病毒A(CVA)，為37 636條，占總候選病毒31.40%；與李樹皮壞死莖紋孔伴隨病毒(PBNSPaV)同源的contigs有7 371條，占總候選病毒的6.15%；與櫻桃綠環(huán)斑駁病毒(CGRMV)同源的contigs為4 083條，占3.40%(表4)。

表4 感病甜櫻桃病毒種類鑒定

3 小結(jié)與討論

本研究通過對(duì)2個(gè)表現(xiàn)“花臉”癥狀的甜櫻桃樣品進(jìn)行高通量測(cè)序，結(jié)果表明，樣品YT-1檢測(cè)到了LChV2、PNRSV、CVA、PBNSPaV、CGRMV及HSVd等6種病毒的復(fù)合侵染，而樣品YT-2檢測(cè)到了PNRSV、CVA、PBNSPaV及CGRMV等4種病毒的復(fù)合侵染。

甜櫻桃病毒病發(fā)生嚴(yán)重且多以復(fù)合侵染為主，如PNRSV常與PDV或蘋果花葉病毒(Applemosaicvirus，ApMV)一起發(fā)生，造成果園減產(chǎn)[6,17]；CVA與LChV 2的病毒復(fù)合侵染使果實(shí)產(chǎn)量與品質(zhì)明顯下降[11,18]。2018年曹欣然等對(duì)山東省甜櫻桃病毒病進(jìn)行調(diào)查及鑒定，發(fā)現(xiàn)山東省甜櫻桃病毒病發(fā)生嚴(yán)重，病毒檢測(cè)率高達(dá)84.5%，其中主要以復(fù)合侵染為主，病毒復(fù)合侵染率為96.6%[19]。王文文等和劉聰利等研究表明，復(fù)合侵染病毒種類不同，癥狀表現(xiàn)也不同，且癥狀與病毒種類之間無明顯關(guān)系[20,21]。在甜櫻桃上，同時(shí)感染PNRSV、PDV、CVA、CGRMV及LChV 2表現(xiàn)為褪綠斑駁和黃綠相間帶紋兩種不同癥狀[19]；PNRSV、PDV、CVA病毒復(fù)合侵染表現(xiàn)為葉片細(xì)長(zhǎng)、濃綠或葉片褪綠斑駁兩種癥狀[21]；同時(shí)感染PNRSV、CGRMV、CVA病毒或PNRSV、PDV、CGRMV、CVA病毒葉片均表現(xiàn)出壞死環(huán)斑癥狀[21]。在本研究中，兩個(gè)樣品均表現(xiàn)“花臉”癥狀，但檢測(cè)到復(fù)合侵染病毒種類不同，僅在YT-1樣品種檢測(cè)到類病毒HSVd。“花臉”癥狀與類病毒HSVd 在紅燈甜櫻桃上引起的“Dapple fruit”癥狀相似，因此需進(jìn)一步研究在甜櫻桃上HSVd的侵染和癥狀表現(xiàn)的關(guān)系，為甜櫻桃病毒病的防控提供參考。