西里伯斯青鳉tyr和slc24a5的克隆及表達(dá)分析

馬 元 仲 穎 郭 婧 李名友

(1. 上海海洋大學(xué)國家海洋生物科學(xué)國際聯(lián)合研究中心, 上海 201306; 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306)

體表的顏色是脊椎動(dòng)物的重要表型, 具有物種識(shí)別、社會(huì)交流、光保護(hù)、擇偶和對(duì)捕食者的警告和威脅等作用[1,2]。體色的形成和維持需要一系列細(xì)胞因子、基因和生理因子的調(diào)控[3]。黑色素作為一種生物色素, 在體色形成中發(fā)揮重要作用。黑色素由黑色素細(xì)胞合成, 黑色素合成途徑非常保守且黑色素生物合成的分子機(jī)制已被廣泛研究[4]。體色基因在線網(wǎng)站中(www.espcr.org/micemut/)共記錄了378個(gè)體色相關(guān)候選基因, 其中171個(gè)基因已經(jīng)被克隆。酪氨酸酶(tyr)[5]、酪氨酸相關(guān)蛋白-1(tyrp-1)[6]、溶質(zhì)載體24家族成員5(slc24a5)[7]、溶質(zhì)載體7家族成員11 (slc7a11)[8]、黑色素皮質(zhì)激素受體1(mc1r)[9]和刺鼠蛋白(asip)[10]等體色調(diào)控相關(guān)基因可誘導(dǎo)不同物種色素模式的突變。

Tyr又稱單酚加氧酶, 廣泛分布于不同的生物體內(nèi),tyr是黑色素合成過程中關(guān)鍵的限速酶。tyr主要調(diào)節(jié)黑色素合成的前兩個(gè)步驟: 前體酪氨酸在tyr的催化下生成3,4-二羥基苯丙氨酸(多巴,DOPA), 多巴進(jìn)一步被tyr氧化形成多巴醌(DQ)[11]。多巴醌經(jīng)過一系列復(fù)雜的調(diào)控形成真黑色素和褐色色素, 真黑色素產(chǎn)生黑色和棕色表型, 褐色色素產(chǎn)生黃色和紅色表型。研究發(fā)現(xiàn), 體內(nèi)tyr活性的缺失會(huì)導(dǎo)致黑色素產(chǎn)生減弱或消失, 最終導(dǎo)致脊椎動(dòng)物表現(xiàn)出不同程度的白化表型。在黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)中,tyr在正常和白化黃顙魚組織中的表達(dá)水平具有顯著差異[6]。在虹鱒(Oncorhynchus mykiss)中通過Morpholio抑制tyr的表達(dá),在孵化后25d和35d時(shí)視網(wǎng)膜和皮膚的色素沉著明顯減少[12]。通過CRISPR/Cas9技術(shù)單靶點(diǎn)敲除日本青鳉(Oryzias latipes)tyr基因, 日本青鳉眼部色素明顯缺失[13]。值得注意的是, 當(dāng)去除tyr啟動(dòng)子區(qū)域的Tol2轉(zhuǎn)座子后, 白化病表型的日本青鳉轉(zhuǎn)化為野生型著色的青鳉[5]。此外, 有研究表明, miR-330-5p是tyr強(qiáng)有力的負(fù)調(diào)控因子, 持續(xù)過表達(dá)miR-330-5p可導(dǎo)致色素沉著的消失[14]。

Slc24a5是溶質(zhì)載體24家族的第5個(gè)成員, 是人類(Homo sapiens)重要的色素沉著基因,slc24a5在南亞人色素沉著多樣性中起著非常重要的作用[15,16]。Slc24a5基因編碼的蛋白為NCKX5, NCKX5被證實(shí)定位在黑色素細(xì)胞的線粒體和高爾基體反面網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)上, 而不是黑色素細(xì)胞的細(xì)胞膜上。線粒體中NCKX5的缺失削弱了黑素體中Ca2+的富集, 從而影響了黑素體的成熟和黑色素的產(chǎn)生[17],slc24a5的表達(dá)模式與黑素團(tuán)標(biāo)記物基因(tyrp2)相似, 均在視網(wǎng)膜色素上皮和黑素團(tuán)中表達(dá)[7]。在黑色綿羊(Ovis aries)的皮膚中slc24a5的相對(duì)表達(dá)量是白色綿羊的20.53倍[18]。在雞(Gallus gallus domesticus)中,siRNA被證明可以有效抑制slc24a5的表達(dá),slc24a5表達(dá)的減少導(dǎo)致黑色素合成也相應(yīng)減少[19]。魚類上, 在金色斑馬魚(Danio rerio)中首次克隆研究了slc24a5, 并證明了slc24a5在色素沉著中起重要作用, 金色斑馬魚與野生型斑馬魚相比, 黑色素沉著明顯延遲和減少, 將野生型的全長slc24a5轉(zhuǎn)錄本注射到純合金色斑馬魚胚胎中, 黑色素沉著可在一定程度上恢復(fù)[20]。

西里伯斯青鳉(Oryzias celebensis)是青鳉屬的一種淡水魚, 原產(chǎn)于印度尼西亞蘇拉威西島, 很可能在蘇拉威西島孤立的生活了超過2900萬年[21]。西里伯斯青鳉具有生長周期短、胚胎透明、繁殖快、雌雄表型差異顯著等優(yōu)點(diǎn)。在本研究中, 我們克隆了西里伯斯青鳉黑色素合成相關(guān)基因Octyr和Ocslc24a5, 通過熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)了這兩個(gè)基因在不同組織和不同胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá),整體原位雜交(WISH)分析了這兩個(gè)基因在胚胎中的時(shí)空表達(dá)。本研究從分子生物學(xué)水平為解析tyr和slc24a5在西里伯斯青鳉黑色素沉積中的作用奠定基礎(chǔ), 為西里伯斯青鳉體色研究提供重要資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用的野生型西里伯斯青鳉飼養(yǎng)在上海海洋大學(xué)青鳉魚房的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中, 溫度維持在28—29℃, pH維持在6.8—7.0, 保持14h的光照和10h黑暗的光周期。成年雌性西里伯斯青鳉每天可產(chǎn)約30枚卵, 胚胎發(fā)育階段根據(jù)文獻(xiàn)所述確定[22]。

1.2 西里伯斯青鳉tyr和slc24a5 cDNA的克隆

我們利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和Ensembl(https://asia.ensembl.org/index.html)在線網(wǎng)站收集并整理其他物種tyr和slc24a5基因的序列信息。通過對(duì)其他物種核酸和氨基酸序列的比對(duì),在保守區(qū)域設(shè)計(jì)了這兩個(gè)基因的簡(jiǎn)并引物(表 1)。PCR擴(kuò)增得到Octyr和Ocslc24a5 cDNA的部分序列,然后根據(jù)得到的cDNA部分序列設(shè)計(jì)基因特異性引物(表 1)。使用SMART?RACEs試劑盒(Clontech)合成5′-RACE和3′-RACE的 cDNA第一條鏈, 用合成的第一條鏈為模板, 通過PCR擴(kuò)增得到兩端的序列。將RACEs擴(kuò)增到的片段和普通PCR得到的cDNA部分片段進(jìn)行組裝, 然后利用NCBI提供的BLAST工具確定組裝序列是否正確。在正確序列的5′和3′端設(shè)計(jì)引物, 合成全長cDNA進(jìn)行PCR驗(yàn)證。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%或2%瓊脂糖凝膠電泳確定大小, 利用膠回收試劑盒(TaKaRa)對(duì)正確的片段進(jìn)行回收。然后將回收產(chǎn)物連接到pGEM-T Easy載體(Promega)中, 再轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α菌株中。最后將陽性菌株送往上海邁普生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 西里伯斯青鳉tyr和slc24a5基因組DNA的克隆

采用飽和Nacl法提取基因組DNA。剪取西里伯斯青鳉尾巴置于1.5 mL EP管中, 在管中加入STE緩沖液(10 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)、1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、0.1 mmol/L氯化鈉(NaCl)、pH 8.0)、10%十二烷基硫酸鈉(SDS)和蛋白酶K, 56℃水浴鍋中消化過夜。將飽和NaCl加入上述管中, 輕輕搖勻, 加入氯仿混勻, 離心。取上清, 并在上清中加入異丙醇沉淀基因組DNA,用75%的酒精洗滌兩次。將基因組DNA溶解于1/1000 RNase溶液中, 置于–40℃供進(jìn)一步分析使用。我們通過在線網(wǎng)站Ensembl搜索并整理了小鼠、人類、斑馬魚和青鳉的基因組序列, 根據(jù)已公布的其他物種基因組序列和獲得的CDS(Coding sequence)序列, 設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增tyr和slc24a5基因組DNA序列(表 1)。

表1 tyr 和 slc24a5 基因克隆和表達(dá)所用引物序列Tab. 1 Primers for cloning and expression analysis of tyr and slc24a5

1.4 序列分析

使用DNAMAN和Vector NTI對(duì)tyr和slc24a5的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì), 利用在線網(wǎng)站SignalP 5.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè), 利用在線網(wǎng)站TMHMM2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)對(duì)蛋白的跨膜區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè), 利用ProtParam工具(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)PI的預(yù)測(cè), NetNGlyc1.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/Net NGlyc)預(yù)測(cè)N端糖基化位點(diǎn)。此外, 利用Mega 7.0軟件采用相鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 熒光定量PCR

利用TRIzol法提取西里伯斯青鳉不同胚胎發(fā)育時(shí)期(2-細(xì)胞期、囊胚期、原腸胚、神經(jīng)胚、3d、7d和剛孵出的小魚)和8個(gè)成年組織(腦、眼、腸、腎、肝、皮膚、卵巢和精巢)的總RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000檢測(cè)提取到的總RNA的質(zhì)量。每個(gè)發(fā)育階段的胚胎各收集45顆, 每15顆作為一個(gè)重復(fù)。對(duì)三雌三雄成年西里伯斯青鳉進(jìn)行組織取樣, 每條魚的相同組織作為一個(gè)重復(fù)。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。β-actin作為內(nèi)參基因, 與Octyr、Ocslc24a5進(jìn)行平行擴(kuò)增。qRT-PCR在Bio-Rad CFX Manager熒光定量PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系為SYBR Premix ExTaq(2×)10 μL, 正向和反向引物各1 μL, cDNA 2 μL, ddH2O 定容至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)? 95℃ 30s, 95℃ 5s, 56℃ 20s, 72℃ 15s, 共40個(gè)循環(huán)。程序結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析, 若溶解曲線呈現(xiàn)單峰則定量準(zhǔn)確, 并進(jìn)行分析。對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行三次擴(kuò)增, 并做三個(gè)樣本重復(fù)。每對(duì)引物設(shè)置一個(gè)陰性對(duì)照(用ddH2O代替模板)。所有引物均是使用Primer6.0軟件設(shè)計(jì)(表 1)。使用2–ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量, 利用GraphPad 5.0軟件進(jìn)行作圖。

1.6 整體原位雜交

利用整體原位雜交檢測(cè)Octyr和Ocslc24a5mRNA在不同胚胎發(fā)育時(shí)期的時(shí)空定位[23]。利用全長CDS引物(Octyr-cDNA-F & R和Ocslc24a5-cDNA-F & R)擴(kuò)增Octyr和Ocslc24a5的CDS序列,將得到的正確片段連接到T-easy載體中, 分別命名為ptOctyr和ptOcslc24a5。使用XbaⅠ或XhoⅠ酶切質(zhì)粒使質(zhì)粒線性化, 然后使用地高辛(DIG)標(biāo)記試劑盒(Roche)將線性化的質(zhì)粒反轉(zhuǎn)錄合成正義和反義探針。因?yàn)槿毡厩圜毢谏刈钤绯霈F(xiàn)在第22階段(8—9個(gè)體節(jié)期)的卵黃囊上[22], 所以當(dāng)胚胎發(fā)育到第20階段或更早期時(shí)我們使用0.25 mmol/L苯基硫脲(PTU)處理胚胎以抑制胚胎中黑色素沉積。整體原位雜交具體步驟如文獻(xiàn)[24]所述。每隔1—1.5h在顯微鏡下觀察胚胎顏色, 倒置體視鏡(Nikon,SMZ25)進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果

2.1 Octyr和Ocslc24a5的克隆和序列分析

Octyr全長cDNA 2249 bp, 包含126 bp 5′非編碼區(qū)、488 bp 3′非編碼區(qū)和1635 bp編碼區(qū), 編碼545個(gè)氨基酸(GenBank登錄號(hào): MW199762)。Oc-Tyr蛋白的預(yù)測(cè)分子量為61.9 kD, 等電點(diǎn)為6.17。用SignalP 5.0在線網(wǎng)站在Octyr的N端預(yù)測(cè)到18個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽。在Octyr氨基酸序列的C端預(yù)測(cè)到位于474—496 aa的跨膜結(jié)構(gòu)域。在Octyr氨基酸序列中包含兩個(gè)銅離子結(jié)合位點(diǎn), CuA和 CuB,與其他脊椎動(dòng)物相比該結(jié)構(gòu)高度保守。同時(shí), 我們通過對(duì)OcTyr與其他脊椎動(dòng)物的Tyr進(jìn)行多重氨基酸比對(duì), 共發(fā)現(xiàn)14個(gè)保守的半胱氨酸殘基。六個(gè)假定N-糖基化位點(diǎn)也相對(duì)保守。

Ocslc24a5的全長cDNA序列包含160 bp 5′ 非編碼區(qū)、363 bp 3′ 非編碼區(qū)以及1542 bp的編碼區(qū),該編碼區(qū)編碼一個(gè)含有514個(gè)氨基酸殘基, 3′ 非編碼區(qū)中具有典型的AATAAA聚腺苷酸化信號(hào), 提示該cDNA包含了Ocslc24a5的完整編碼序列(Gen-Bank登錄號(hào): MW199763)。OcSlc24a5預(yù)測(cè)分子量為56.6 kD, 等電點(diǎn)為5.29。OcSlc24a5氨基酸序列包含12個(gè)跨膜區(qū)域, 分別位于15—37、79—98、122—144、151—173、183—202、207—226、319—336、349—371、381—403、416—438 、451—473和 180—502 aa。

2.2 OcTyr和OcSlc24a5氨基酸序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將OcTyr氨基酸序列與日本青鳉(O. latipes)、斑馬擬麗魚(Maylandia zebra)、羅非魚(Oreochromis niloticus)、鯉(Cyprinus carpio)、斑馬魚(D.rerio)、小鼠(Mus musculus)、人類(H.sapiens)的Tyr氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示, 在比對(duì)的這8個(gè)物種中, OcTyr與日本青鳉的同源性最高為93.7% 。與斑馬擬麗魚和羅非魚的同源性次之, 均為79.7%, 與鯉的同源性為63.7%, 與斑馬魚的同源性為61.7%。與小鼠和人類的同源性依次為57.5%和56.2%。將OcSlc24a5氨基酸序列和其他脊椎動(dòng)物的Slc24a5氨基酸序列進(jìn)行比對(duì), OcSlc24a5與魚類中的日本青鳉(O. latipes)、羅非魚(O. niloticus)、眼斑雙鋸魚(Amphiprion ocellaris)和貝氏隆頭魚(Labrus bergylta)、斑馬魚(D. rerio)有著較高同源性, 分別為97.2%、91.1%、90.8%、85.8%和82.8%, 與小鼠(M. musculus)和人類(H. sapien)的同源性較低均為69.5%。

系統(tǒng)發(fā)育樹顯示, OcTyr和日本青鳉(O. latipes)Tyr聚成一個(gè)小分支, 與其他魚類聚成一個(gè)大分支,這與預(yù)期的一致(圖 1)。此外, 兩棲類、鳥類和哺乳動(dòng)物的Tyr聚在另一個(gè)大分支。同時(shí), 根據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹, 我們發(fā)現(xiàn)OcSlc24a5與羅非魚(O.niloticus)、眼斑雙鋸魚(A. ocellaris)、玻璃魚(Parambassis ranga)和日本青鳉(O. latipes)親緣關(guān)系較為親近, 聚在一個(gè)小分支上, 與貝氏隆頭魚(L. bergylta)、齒鯡(Denticeps clupeodies)和斑馬魚(D. rerio)聚為一個(gè)大分支。最后兩棲類、鳥類和哺乳動(dòng)物的Slc24a5聚在另一個(gè)大分支(圖 1)。這些結(jié)果表明, OcTyr和OcSlc24a5的氨基酸序列在進(jìn)化上是保守的。

圖1 Tyr和Slc24a5氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of Tyr and Slc24a5 amino acid sequences

2.3 Octyr和Ocslc24a5基因組DNA序列結(jié)構(gòu)分析

通過PCR克隆并拼接得到Octyr和Ocslc24a5的基因組DNA序列。拼接得到6.3 kb的Octyr基因組序列(GenBank登錄號(hào): MW240440), 開放閱讀框跨越5個(gè)外顯子, 與斑馬魚、人和小鼠的外顯子數(shù)量相同。斑馬魚、人類和小鼠的tyr基因組長度是Oc-tyr基因組長度的3.2—18.9倍(圖 2)。Ocslc24a5的基因組長度為6.08 kb(GenBank登錄號(hào): MW200252)。值得注意的是, 通過比較研究斑馬魚、人類和小鼠的基因組DNA結(jié)構(gòu), 我們發(fā)現(xiàn)Ocslc24a5的基因組有8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子, 而斑馬魚、人類和小鼠有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子。斑馬魚、小鼠和人類的基因組長度分別是西里伯斯青鳉slc24a5基因的2.5倍、3.5倍和3.7倍(圖 2)。

圖2 Octyr和Ocslc24a5基因組結(jié)構(gòu)分析Fig. 2 Genomic organization of Octyr and Ocslc24a5

2.4 Octyr和Ocslc24a5在成體組織和不同胚胎發(fā)育時(shí)期均有分布

采用qRT-PCR檢測(cè)了Octyr和Ocslc24a5在不同組織中的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示,Octyr和Ocslc24a5在腦、眼、腎、肝、腸、皮膚、卵巢和精巢等組織中均有表達(dá)(圖 3A和圖 3B)。在檢測(cè)的8個(gè)組織中,Octyr在精巢中表達(dá)量最高, 其次是眼睛、腦和皮膚, 在腸中表達(dá)量最低,Octyr在精巢中表達(dá)量是眼睛的6倍, 大腦的17倍;Ocslc24a5在精巢、腦和眼睛高表達(dá), 其中在精巢中表達(dá)量最高,且卵巢中的表達(dá)量大于皮膚中的表達(dá)量, 精巢中的Ocslc24a5表達(dá)量大約是眼睛的2倍, 腦的8倍, 腸的1300倍。

同樣, 采用qRT-PCR檢測(cè)了Octyr和Ocslc24a5在西里伯斯青鳉不同胚胎發(fā)育時(shí)期(2-細(xì)胞期、囊胚期、原腸胚、神經(jīng)胚、3d、7d和剛孵出的小魚)的相對(duì)表達(dá)水平。孵化前,Octyr和Ocslc24a5的表達(dá)均隨著胚胎的發(fā)育逐漸增加; 孵化后, 基因表達(dá)水平均降低。Octyr在神經(jīng)胚表達(dá)水平最低,Ocslc24a5在囊胚期表達(dá)水平最低。當(dāng)胚胎發(fā)育到第7天時(shí), 兩個(gè)基因的表達(dá)均達(dá)到最高(圖 3C和圖 3D)。

圖3 Octyr和Ocslc24a5在不同組織和不同胚胎發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)水平Fig. 3 The relative expression of Octyr and Ocslc24a5 in different tissues and different embryo stagesA—B. 西里伯斯青鳉不同組織中Ocslc24a5和Octyr的相對(duì)表達(dá)水平; C—D. 西里伯斯青鳉不同胚胎發(fā)育時(shí)期Octyr和Ocslc24a5的相對(duì)表達(dá)水平A—B. Real-time fluorescent quantitative PCR analysis of Octyr and Ocslc24a5 in different tissues of O. celebensis. C—D. Realtime fluorescent quantitative PCR analysis of Octyr and Ocslc24a5 in different embryo stages of O. celebensis

2.5 Octyr和Ocsl24a5 在胚胎中的時(shí)空表達(dá)

為了研究Octyr和Ocslc24a5在胚胎發(fā)育過程中的時(shí)空表達(dá), 我們進(jìn)行了整體原位雜交實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,Octyr和Ocslc24a5的時(shí)空表達(dá)模式非常相似。在囊胚期的所有細(xì)胞中均檢測(cè)到了Octyr和Ocslc24a5信號(hào)(圖 4A和圖 5A)。在神經(jīng)胚和6體節(jié)期, 我們發(fā)現(xiàn)Octyr和Ocslc24a5在背部和卵黃膜上表達(dá)(圖 4B和4C和圖 5B和5C)。在24體節(jié)期和體節(jié)完成期, 這2個(gè)基因的信號(hào)在眼睛、中腦、間腦、后腦和側(cè)背皮膚中都被檢測(cè)到(圖 4D和4E、圖 5D和5E)。Octyr和Ocslc24a5的表達(dá)域逐漸從背部向全身擴(kuò)散, 且表達(dá)水平隨著發(fā)育而升高。在體節(jié)完成期使用正義探針作為陰性對(duì)照, 結(jié)果顯示,正義探針未檢測(cè)到信號(hào)(圖 4F和圖 5F)。

圖4 Octyr在胚胎中的時(shí)空表達(dá)Fig. 4 Spatial and temporal expression of Octyr during embryogenesisA. 11期, 囊胚晚期; B. 17期, 神經(jīng)胚早期; C. 21期, 6體節(jié)期; D. 27期, 24體節(jié)期; E. 32期, 體節(jié)完成期; F. 32期, 陰性對(duì)照; ey. 眼睛; di.間腦; mb. 中腦; hb. 后腦; sc. 脊髓; tb. 尾芽A. Stage 11, late blastula stage; B. Stage 17, early neurula stage; C. Stage 21, 6 somite stage; D. Stage 27, 24 somite stage; E. Stage 32,somite completion stage; F. Stage 32, negative control; ey. eye; di. diencephalon; mb. midbrain; hb. hindbrain; sc. spinal cord; tb. tail bud

圖5 Ocslc24a5在胚胎中的時(shí)空表達(dá)Fig. 5 Spatial and temporal expression of Ocslc24a5 during embryogenesisA. 11期, 囊胚晚期; B. 17期, 神經(jīng)胚早期; C. 21期, 6體節(jié)期; D. 27期, 24體節(jié)期; E. 32階, 體節(jié)完成期; F. 32期, 陰性對(duì)照; ey. 眼睛; di.間腦; mb. 中腦; hb. 后腦; sc. 脊髓; tb. 尾芽A. Stage 11, late blastula stage; B. Stage 17, early neurula stage; C. Stage 21, 6 somite stage; D. Stage 27, 24 somite stage; E. Stage 32,somite completion stage; F. Stage 32, negative control; ey. eye; di. diencephalon; mb. midbrain; hb. hindbrain; sc. spinal cord; tb. tail bud

3 討論

3.1 Octyr和Ocslc24a5生物信息學(xué)分析

黑色素在動(dòng)物體內(nèi)分布廣泛, 是體色形成和維持的重要因素之一。許多研究表明,tyr和slc24a5在脊椎動(dòng)物黑色素的合成中起著至關(guān)重要的作用。Octyr的序列長度、蛋白分子量、等電點(diǎn)等與其他脊椎動(dòng)物, 如小鼠[25]、人[26]和雞[27]相近。此外, 我們預(yù)測(cè)到Octyr有7個(gè)保守功能結(jié)構(gòu)域, 這與其他脊椎動(dòng)物的tyr蛋白功能結(jié)構(gòu)域一致[6,28]。例如, 兩個(gè)銅離子結(jié)合區(qū)域、位于N端的信號(hào)肽和五個(gè)糖基化位點(diǎn)等。有研究表明, 少于兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn)的tyr突變體不與鈣合蛋白相互作用,tyr酶活性完全消失[29]。位于N端的信號(hào)肽由18個(gè)氨基酸組成, 負(fù)責(zé)將新合成的肽鏈運(yùn)輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行加工。經(jīng)過糖基化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理, 序列最終被運(yùn)輸?shù)胶谒匦◇w[30]。兩個(gè)保守的銅離子結(jié)合位點(diǎn)(CuA和CuB)含有6個(gè)保守的組氨酸殘基, 它們?cè)趖yr的催化活性中發(fā)揮重要作用[31]。Ocslc24a5編碼514個(gè)氨基酸, 包含12個(gè)跨膜區(qū)域, 這些區(qū)域具有氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)的功能[32]。此外, 多重氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示,Octyr和Ocslc24a5的氨基酸序列在進(jìn)化關(guān)系上與日本青鳉最為接近。因此, 我們推測(cè)Octyr和Ocslc24a5基因的功能可能與日本青鳉相似。Octyr的開放閱讀框有5個(gè)外顯子, 與小鼠、人類和斑馬魚的外顯子相同。值得注意的是, 我們發(fā)現(xiàn)Ocslc24a5基因組有8個(gè)外顯子, 而小鼠、人類和斑馬魚基因組有9個(gè)外顯子。綜上,Octyr和Ocslc24a5在進(jìn)化上是保守的。

3.2 Octyr和Ocslc24a5的組織和不同胚胎發(fā)育時(shí)期表達(dá)分析

tyr和slc24a5在成體組織和胚胎中的分布已在不同物種中得到廣泛研究[33,34]。在本研究中,Octyr在檢測(cè)的所有成體組織中均有表達(dá), 其中精巢中表達(dá)水平最高。然而, 在一些脊椎動(dòng)物中,tyr基因在某些成體組織中不表達(dá), 如文昌魚的精巢和腸道[35],及泥鰍的腹肌和心臟[36]中均未檢測(cè)到tyr。在哺乳動(dòng)物中, 不同毛色的山羊tyr表達(dá)水平不同, 深灰色山羊tyr的相對(duì)表達(dá)量是淺灰色個(gè)體的19.29倍[37]。類似的,Ocslc24a5在所有檢測(cè)的成體組織中均有表達(dá), 在眼睛、大腦和精巢中高表達(dá), 與雞[33]和斑馬魚[38]相似。此外,Octyr和Ocslc24a5基因在西里伯斯青鳉的腎和肝中表達(dá), 腎和肝是魚的重要免疫器官, 有研究表明tyr在體液免疫應(yīng)答中起作用[39],因此, 我們推測(cè)Octyr和Ocslc24a5在西里伯斯青鳉免疫反應(yīng)過程中可能發(fā)揮作用。在胚胎發(fā)育過程中,Octyr和Ocslc24a5的轉(zhuǎn)錄本在2-細(xì)胞期就被檢測(cè)到, 表明它們是母性遺傳的。西里伯斯青鳉通常在胚胎發(fā)育到第9天時(shí)孵化, 在7個(gè)被測(cè)試的胚胎發(fā)育時(shí)期中,Octyr和Ocslc24a5的相對(duì)表達(dá)水平均在胚胎發(fā)育到第7天時(shí)最高, 在這個(gè)孵化的關(guān)鍵時(shí)期,幼魚容易受到外界病原體的影響, 因此Octyr和Ocslc24a5的高表達(dá)可能與提高孵化期免疫力相關(guān)。在孵化成小魚后,Octyr和Ocslc24a5的相對(duì)表達(dá)水平明顯降低。這種現(xiàn)象與黃顙魚[6]、爪蟾[7]和山羊[37]相似,tyr和slc24a5的表達(dá)水平在孵化前的幾個(gè)階段相對(duì)較高。這些結(jié)果表明了Octyr和Ocslc24a5與西里伯斯青鳉體色形成密切相關(guān)。

3.3 Octyr和Ocsl24a5 在胚胎中的時(shí)空表達(dá)分析

在斑馬魚tyr的研究中,tyr首先在視網(wǎng)膜色素上皮的背側(cè)端發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄, 隨后在中腦、間腦、后腦和背側(cè)轉(zhuǎn)錄本中被觀察到[40]。在文昌魚的研究中,tyr分布在文昌魚發(fā)育的各個(gè)時(shí)期[35]。西里伯斯青鳉Octyr同樣分布在胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期,Octyr首先在背部被檢測(cè)到, 隨著胚胎發(fā)育,Octyr在眼睛、皮膚和腦等部位表達(dá), 且表達(dá)逐漸增加。在爪蟾中,2-細(xì)胞期注射Morpholino導(dǎo)致爪蟾眼睛和表皮的黑色素沉著減少, 在2-細(xì)胞期注射人類slc24a5能夠挽救Morpholino帶來的黑色素沉著減少[7]。slc24a5的表達(dá)模式與tyrp-2的表達(dá)模式相似,tyrp-2是一種已知的黑素團(tuán)標(biāo)記基因, 在斑馬魚胚胎中, 在黑素團(tuán)和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中均檢測(cè)到slc24a5和tyrp-2[38], 充分說明slc24a5的表達(dá)確實(shí)存在于黑素團(tuán)中。這種表達(dá)模式與斑馬魚胚胎中所見的表達(dá)模式一致。Ocslc24a5的轉(zhuǎn)錄在中腦、間腦、后腦、背側(cè)和眼睛中均被檢測(cè)到。隨著胚胎的發(fā)育, 在胚胎中檢測(cè)到更多的Ocslc24a5信號(hào)。這表明西里伯斯青鳉的體色在胚胎期可能已經(jīng)形成,Octyr和Ocslc24a5不僅與有西里伯斯青鳉體色形成相關(guān), 也可能在西里伯斯青鳉的胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮作用。

綜上, 本研究克隆了西里伯斯青鳉Octyr和Oc-slc24a5的全長cDNA, 并進(jìn)行了生物學(xué)分析, 闡明了Octyr和Ocslc24a5在西里伯斯青鳉胚胎中的時(shí)空表達(dá)模式。后續(xù)將采用分子生物學(xué)技術(shù), 如CRISPR/Cas9或者M(jìn)orpholino注射, 敲除或敲降Octyr和Ocslc24a5的表達(dá), 以進(jìn)一步了解這兩個(gè)基因在西里伯斯青鳉黑色素合成中的調(diào)控作用。我們的研究為闡明青鳉屬的黑色素合成奠定了基礎(chǔ),Octyr和Ocslc24a5在西里伯斯青鳉黑色素合成中的作用、表達(dá)及調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。