牛至提取物和枯草芽孢桿菌體外抑菌效果評(píng)價(jià)

辛 娜，鄧露芳*，郭 亮*，宗文麗，班文杰，黃玉海

（1.北京三元種業(yè)科技股份有限公司飼料分公司，北京 101105；2.北京首農(nóng)畜牧發(fā)展有限公司，北京 100076）

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis,BS）具有耐高溫高壓、耐酸堿、耐膽鹽等抗逆性，是一種理想的微生物飼料添加劑。其作用機(jī)理是可消耗腸道內(nèi)的氧氣，促進(jìn)腸道有益菌生長(zhǎng)、拮抗有害菌的生長(zhǎng)，維持腸道環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，同時(shí)可產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，在動(dòng)物養(yǎng)殖上應(yīng)用可提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)免疫力，同時(shí)具有凈化養(yǎng)殖環(huán)境的功效[1-3]。牛至是一種多年生灌木或草本植物，屬唇形科牛至屬。牛至主要成分取決于產(chǎn)地和其他因素，主要分為揮發(fā)性和非揮發(fā)性兩類成分，有效成分為香芹酚、百里香酚、迷迭香酸等。牛至提取物（Oregano extract，OE）具有提高動(dòng)物采食量、抗菌、抗炎、抗氧化等功能[4-5]。目前，國(guó)內(nèi)尚缺乏牛至提取物、枯草芽孢桿菌的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，且生產(chǎn)廠家眾多，生產(chǎn)工藝及產(chǎn)品品質(zhì)、使用效果等方面也都存在差異。本試驗(yàn)選取6個(gè)不同廠家生產(chǎn)的牛至提取物和枯草芽孢桿菌產(chǎn)品，采用牛津杯體外抑菌方法，研究牛至提取物、枯草芽孢桿菌及其組合的抑菌效果，為篩選出較優(yōu)的抑菌產(chǎn)品及組合提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材 料

1.1 指示菌株

大腸埃希氏菌（ATCC25922）、鼠傷寒沙門氏菌（ATCC14028），購(gòu)于廣東環(huán)凱生物科技有限公司。產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素A 型（BNCC125404）,購(gòu)于北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 牛至提取物（OE）和枯草芽孢桿菌（BS）

6個(gè)不同廠家生產(chǎn)的牛至提取物（OE）和枯草芽孢桿菌（BS），均為市售產(chǎn)品，由北京三元種業(yè)科技股份有限公司飼料分公司收集。6個(gè)牛至提取物和枯草芽孢桿菌分別標(biāo)記為OE-1、OE-2、OE-3、OE-4、OE-5、OE-6 及BS-1、BS-2、BS-3、BS-4、BS-5、BS-6。

1.3 培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

2 方 法

2.1 不同牛至提取物和枯草芽孢桿菌產(chǎn)品對(duì)致病菌的抑制試驗(yàn)

參照劉冬梅等[6]研究中的牛津杯擴(kuò)散法進(jìn)行試驗(yàn)。取滅菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待溫度降至50 ℃左右時(shí)倒平板，每個(gè)平皿約15 mL。待瓊脂凝固后用滅菌的鑷子夾牛津杯置于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板中。每個(gè)平板放置4個(gè)牛津杯。分別取大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌0.1 mL（108cfu·mL-1）加入到已滅菌的100 mL 營(yíng)養(yǎng)瓊脂中（冷卻至50 ℃左右），搖勻后傾倒，注意不要起泡。待瓊脂凝固后，用鑷子將牛津杯夾出來(lái)（牛津杯外徑8 mm），分別標(biāo)記為孔1、孔2、孔3、孔4?？莶菅挎邨U菌用純化水稀釋，牛至提取物用無(wú)水乙醇稀釋備用?？?中加入相對(duì)應(yīng)的稀釋液100 μL作對(duì)照，取不同廠家的牛至提取物和枯草芽孢桿菌稀釋液100 μL加入孔2、孔3、孔4 中，3 個(gè)重復(fù)。置于4 ℃冰箱中放置1 h 后，37 ℃培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑大小。

2.2 牛至提取物和枯草芽孢桿菌不同配比對(duì)致病菌的抑制試驗(yàn)

根據(jù)抑菌試驗(yàn)結(jié)果，篩選出抑菌效果好的牛至提取物和枯草芽孢桿菌產(chǎn)品各4個(gè)，然后進(jìn)行兩兩聯(lián)合抑菌試驗(yàn)。具體試驗(yàn)方法同2.1。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同廠家牛至提取物體外抑菌試驗(yàn)

不同廠家牛至提取物對(duì)致病菌的抑制作用效果見(jiàn)表1。從表1 可知，所有廠家生產(chǎn)的牛至提取物均對(duì)大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌具有抑制作用，不同產(chǎn)品體外抑菌效果不同。OE-5 對(duì)大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌抑菌效果最好，抑菌圈直徑分別是14.51 mm、13.08 mm；OE-2 對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌圈直徑為15.80 mm，抑菌效果最好。綜上，體外抑菌效果較好的3個(gè)產(chǎn)品分別是OE-2、OE-4、OE-5，其次是OE-6 和OE-1，OE-3體外抑菌效果最差。

表1 不同廠家牛至提取物對(duì)致病菌的抑制作用

3.2 不同廠家枯草芽孢桿菌的體外抑菌試驗(yàn)

不同廠家枯草芽孢桿菌對(duì)致病菌的抑制作用效果見(jiàn)表2。

表2數(shù)據(jù)顯示，不同廠家的枯草芽孢桿菌對(duì)致病菌的抑制作用不同，其中，BS-1和BS-5對(duì)大腸埃希氏菌具有抑制作用，BS-1 抑菌性優(yōu)于BS-5；BS-1、BS-4 和BS-6 對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌有抑制作用，抑菌強(qiáng)弱順序依次為BS-1>BS-6>BS-4；所有產(chǎn)品對(duì)鼠傷寒沙門氏菌均沒(méi)有抑制作用。綜上，體外抑菌效果較好的4個(gè)產(chǎn)品分別是BS-1、BS-4、BS-5、BS-6。

表2 不同廠家枯草芽孢桿菌對(duì)致病菌的抑制作用

2.3 牛至提取物和枯草芽孢桿菌組合抑菌作用

牛至提取物和枯草芽孢桿菌組合抑菌作用見(jiàn)表3。

表3 續(xù)

表3 牛至提取物和枯草芽孢桿菌組合對(duì)致病菌的抑制作用

由表3可知，牛至提取物和枯草芽孢桿菌組合對(duì)致病菌的抑制作用效果不同，OE-2與BS-5復(fù)配對(duì)大腸埃希氏菌抑菌效果較好，抑菌圈直徑為11.74 mm；OE-2與BS-6復(fù)配對(duì)鼠傷寒沙門氏菌抑菌效果最好，抑菌圈直徑為10.45 mm；OE-2 與BS-4 對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的體外抑菌效果最好，抑菌圈直徑為12.01 mm。

4 討 論

隨著抗生素的禁用，微生態(tài)制劑和植物提取物成為研究的焦點(diǎn)。眾多學(xué)者研究證實(shí)，枯草芽孢桿菌對(duì)致病菌具有一定的抑制作用。張亞茹等[7]研究證實(shí)，枯草芽孢桿菌菌株N2-10對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出黏附抑制作用，尤其是金黃色葡萄球菌，菌株細(xì)胞表面疏水性可達(dá)31.9%。本試驗(yàn)條件下，不同廠家枯草芽孢桿菌抑菌作用不同，僅個(gè)別廠家枯草芽孢桿菌對(duì)大腸埃希氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌表現(xiàn)出一定的抑制作用?？莶菅挎邨U菌抑菌主要是通過(guò)產(chǎn)生代謝產(chǎn)物以及與致病菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)空間兩個(gè)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)病原菌的抑制作用?？莶菅挎邨U菌代謝產(chǎn)生的細(xì)菌素對(duì)致病菌L.monocytogens（ATCC19114）及M.luleus2016表現(xiàn)出較強(qiáng)的殺菌及抑菌活性[8]。翟召靜[9]提取枯草芽孢桿菌的代謝物，經(jīng)蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在10 個(gè)差異上調(diào)蛋白中，大部分有降解RNA、抑制蛋白質(zhì)表達(dá)的功能，特別是mRNA干擾酶，可引起細(xì)胞凋亡。

牛至油、香芹酚、百里香酚對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌具有顯著體外抑菌作用[10]。李定剛等[11]研究證實(shí)，不同工藝來(lái)源的牛至提取物都能在一定程度上降低大腸桿菌所致十二指腸腸道損傷，改善小鼠腸道組織結(jié)構(gòu)。本試驗(yàn)條件下，牛至提取物對(duì)大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌均表現(xiàn)出較好的抑菌效果。牛至提取物所含酚類、萜類、非揮發(fā)性物質(zhì)均具有一定的抑菌作用。酚類物質(zhì)抗微生物的原理是作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜，使細(xì)菌細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)變性，改變細(xì)胞膜的通透性，或與細(xì)胞膜中的磷脂反應(yīng)，破壞蛋白質(zhì)的合成，使微生物細(xì)胞的生長(zhǎng)受抑制。萜類物質(zhì)能影響細(xì)菌中DNA 的自我復(fù)制過(guò)程，從而抑制細(xì)菌的繁殖和生長(zhǎng)過(guò)程，進(jìn)而抑制菌體的生長(zhǎng)[12]。牛至非揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌具有較好的抗菌活性[13]。目前未見(jiàn)牛至提取物和枯草芽孢桿菌聯(lián)合抑菌的報(bào)道，但是從聯(lián)合試驗(yàn)結(jié)果也可以看出，OE-2 和BS-5 對(duì)大腸埃希氏菌、OE-2 和BS-6 對(duì)鼠傷寒沙門氏菌、OE-2 和BS-4對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌均具有較好的體外抑菌效果。

抑菌試驗(yàn)的影響因素眾多，試驗(yàn)方法[14]、試驗(yàn)條件[15]、質(zhì)控菌株[16]等因素都會(huì)影響抑菌試驗(yàn)的結(jié)果及敏感性，本試驗(yàn)控制在同一試驗(yàn)條件下，研究對(duì)同一株質(zhì)控菌株的影響，不同廠家的產(chǎn)品抑菌結(jié)果存在差異的原因主要由產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝、主成分及含量的差異等因素造成。

5 結(jié) 論

體外抑菌結(jié)果表明，牛至提取物和枯草芽孢桿菌均表現(xiàn)出一定的體外抑菌效果。OE-5，BS-1體外抑菌效果最好。聯(lián)合抑菌試驗(yàn)中OE-2和BS-5對(duì)大腸埃希氏菌、OE-2 和BS-6 對(duì)鼠傷寒沙門氏菌、0E-2和BS-4對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌也表現(xiàn)出一定的抑菌效果，可進(jìn)一步研究其在飼料配方及動(dòng)物試驗(yàn)中的應(yīng)用效果。