非小細(xì)胞肺癌患者缺氧誘導(dǎo)因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)水平及其臨床意義

賀春艷，吳月明

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院腫瘤二科，遼寧 錦州 121001)

非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌中的常見(jiàn)類(lèi)型，所占比例高達(dá)80%，且大多數(shù)患者在就診時(shí)已處于疾病中晚期，5年的總體生存率較低，對(duì)患者預(yù)后的影響較大[1-2]。因此，積極的了解NSCLC的確切發(fā)病機(jī)制，在早診斷、早治療疾病、改善預(yù)后方面占據(jù)著重要地位。缺氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia inducible factor，HIF)是調(diào)節(jié)機(jī)體缺氧環(huán)境的重要指標(biāo)，其中HIF-1α、HIF-2α是作用最為重要的兩種因子，目前的較多研究已證實(shí)，HIF-1α在惡性腫瘤中有著廣泛價(jià)值，可促使腫瘤細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)[3-4]。然而關(guān)于HIF-2α在惡性腫瘤中的相關(guān)作用報(bào)道較少。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial cell growth factor，VEGF)是機(jī)體血管生成的重要指標(biāo)，可促使毛細(xì)血管新生，增加腫瘤組織的灌注情況，造成腫瘤細(xì)胞周期紊亂，從而影響患者預(yù)后[5]。因此，本研究旨在探討NSCLC患者HIF-2α、VEGF的表達(dá)水平及其臨床意義，旨在為臨床診療提供一定參考依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2019年3月至2021年11月我院接診的86例NSCLC患者作為本研究對(duì)象。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合NSCLC相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，并通過(guò)影像學(xué)、纖維支氣管鏡病理學(xué)檢查、病理組織學(xué)檢查等確診[6]；②病歷資料完整；③簽署研究知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①已接受過(guò)放化療；②同時(shí)伴有其他惡性腫瘤；③合并結(jié)締組織性疾病、風(fēng)濕性疾病、強(qiáng)直性脊柱炎等；④長(zhǎng)期服用免疫抑制劑或伴有自身免疫性疾??；⑤伴有其他組織器官功能?chē)?yán)重衰竭；⑥伴有精神疾患。86例中男58例,女28例，年齡47～78歲，平均(62.22±7.10)歲；腫瘤直徑≥5 cm 42例、<5 cm 44例；TNM分期Ⅰ期14例、Ⅱ期28例、Ⅲ期29例、Ⅳ期15例；分化程度：低分化20例、中分化51例、高分化15例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例。本研究已通過(guò)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施。

1.2 標(biāo)本采集及HIF-2α、VEGF檢測(cè)方法 收集所有患者的NSCLC組織標(biāo)本及癌旁組織(距腫瘤病灶邊緣>3 cm的組織)標(biāo)本，使用4%中性福爾馬林溶液固定標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)性4 μm厚度進(jìn)行切片，脫水處理后，使用乙二胺四乙酸(EDTA)予以抗原修復(fù)，加入蒸餾水10 μl、10%過(guò)氧化氫5 μl，置于室溫條件下，孵育30 min，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行3次洗滌，每次洗滌時(shí)間3 min；分別加入HIF-2α、VEGF單克隆抗體(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)，置于37 ℃條件下，孵育60 min，PBS進(jìn)行3次洗滌，每次洗滌時(shí)間3 min；加入經(jīng)過(guò)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的HIF-2α、VEGF二抗，置于37 ℃條件下，孵育20 min，PBS進(jìn)行3次洗滌，每次洗滌時(shí)間3 min，再加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)進(jìn)行顯色處理，PBS沖洗、復(fù)染，脫水處理后進(jìn)行觀察結(jié)果。

1.3 HIF-2α、VEGF陽(yáng)性率判定方法 在顯微鏡下進(jìn)行觀察，隨機(jī)選擇5個(gè)400倍視野，根據(jù)HIF-2α、VEGF著色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占比例判定，其中著色為褐色、黑色記3分，棕黃色記2分，淡黃色記1分，無(wú)色記1分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例≥75%記4分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例<75%且≥51%記3分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例<51%且≥11%記2分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例<11%則記1分，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞則記0分，將兩者結(jié)果相乘，總分≥3分則判定為陽(yáng)性表達(dá)，<3分則為陰性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以[例(%)]表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，HIF-2α和VEGF的相關(guān)性采用Spearman等級(jí)分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NSCLC組織和癌旁組織中HIF-2α、VEGF陽(yáng)性表達(dá)率比較 NSCLC組織中HIF-2α、VEGF陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于癌旁組織，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 NSCLC組織和癌旁組織中HIF-2α、VEGF陽(yáng)性表達(dá)率比較[例(%)]

2.2 不同臨床病理NSCLC組織中HIF-2α、VEGF陽(yáng)性表達(dá)率比較 HIF-2α、VEGF在不同性別、年齡中的陽(yáng)性表達(dá)率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，腫瘤直徑≥5 cm、TNM分期Ⅲ-Ⅳ期、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的HIF-2α、VEGF陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于腫瘤直徑<5 cm、TNM分期Ⅰ-Ⅱ期、中高分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 不同臨床病理NSCLC組織中HIF-2α、VEGF陽(yáng)性表達(dá)率比較[例(%)]

續(xù) 表

2.3 HIF-2α和VEGF相關(guān)性分析 經(jīng)過(guò)Spearman等級(jí)相關(guān)性分析顯示，HIF-2α和VEGF之間呈正相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 HIF-2α和VEGF相關(guān)性分析(例)

3 討 論

隨著人們生活習(xí)慣的不斷改變，NSCLC已在臨床上呈現(xiàn)出較高的發(fā)病率及病死率，極大的影響著患者的預(yù)后，早期接受手術(shù)切除病灶是治愈患者的重要方案，但NSCLC的早期癥狀不明顯，多數(shù)患者在醫(yī)院就診時(shí)已處于病情中晚期，喪失了根治性切除手術(shù)機(jī)會(huì)。而積極了解NSCLC的發(fā)病機(jī)制在指導(dǎo)臨床治療、改善預(yù)后方面顯得十分重要[7-8]。

國(guó)內(nèi)外均有研究顯示，缺氧是實(shí)體腫瘤惡性增殖過(guò)程中十分常見(jiàn)的現(xiàn)象，也是促使腫瘤進(jìn)展的一種重要生理改變，主要是由于腫瘤細(xì)胞會(huì)營(yíng)造一種低氧環(huán)境，并刺激白細(xì)胞介素-6、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等細(xì)胞因子分泌，再通過(guò)一系列途徑發(fā)揮促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、增殖、轉(zhuǎn)移等作用，最終導(dǎo)致疾病惡化[9-10]。HIF是一種人體中普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)主要受到細(xì)胞外氧分壓的調(diào)控，是反映機(jī)體缺氧程度的重要指標(biāo)，既往的研究多著重于HIF-1α在腫瘤組織中的作用[11-12]。但關(guān)于HIF-2α的報(bào)道較為欠缺，HIF-2α主要作用是主導(dǎo)著機(jī)體的慢性缺氧情況，主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡Ⅱ細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等中，而近年來(lái)關(guān)于其在惡性腫瘤中的作用也備受學(xué)者重視，我國(guó)有研究顯示，HIF-2α基因單核苷酸多態(tài)性和胃癌易感性之間存在著密切聯(lián)系[13]。國(guó)外有相關(guān)報(bào)道也發(fā)現(xiàn)，HIF-2α對(duì)腫瘤微環(huán)境也具有調(diào)節(jié)作用，參與著惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展等過(guò)程[14]。此外，新生血管生成也是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，和腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，VEGF是評(píng)價(jià)機(jī)體血管生成的重要指標(biāo)，除具有促進(jìn)血管生成的作用之外，還能夠加強(qiáng)血管側(cè)枝循環(huán)的建立功能，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而促使腫瘤進(jìn)展。目前的較多報(bào)道也發(fā)現(xiàn)，VEGF在乳腺癌、胃癌等惡性腫瘤中均有著高表達(dá)的陽(yáng)性率，且和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等不良預(yù)后有著明顯相關(guān)性[15-16]。

本研究通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，NSCLC組織中HIF-2α、VEGF陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，且在中瘤直徑≥5 cm、TNM分期Ⅲ-Ⅳ期、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中，HIF-2α、VEGF陽(yáng)性表達(dá)率也明顯高于腫瘤直徑<5 cm、TNM分期Ⅰ-Ⅱ期、中高分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，結(jié)果存在著明顯差異。通過(guò)分析是由于，腫瘤組織持續(xù)性的處于一種慢性缺氧環(huán)境下，此過(guò)程會(huì)逐漸增加HIF-2α的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤組織中HIF-2α陽(yáng)性率出現(xiàn)明顯升高；Albadari 等[17]研究也顯示，HIF-2α可通過(guò)上調(diào)一些促癌基因的表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)境中發(fā)揮著重要作用；另也有相關(guān)文獻(xiàn)表明，HIF-2α除能反映缺氧狀況之外，也具有誘導(dǎo)腫瘤血管生成、調(diào)控血管功能的作用[18]。此外，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)依賴(lài)于血管的滋養(yǎng)供應(yīng)，隨著VEGF表達(dá)升高，新生血管的增加，可進(jìn)一步加強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移能力，促使腫瘤組織血流動(dòng)力學(xué)紊亂，最終導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展，影響患者預(yù)后。雷蕓等[19]實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)，NSCLC組織中VEGF的陽(yáng)性表達(dá)率為72.22%，和本研究中的69.77%結(jié)果相近，且該研究中也顯示出VEGF和患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。

本研究通過(guò)進(jìn)一步相關(guān)性分析也顯示，HIF-2α和VEGF之間呈明顯的正相關(guān)，主要原因分析如下，腫瘤發(fā)生后組織會(huì)出現(xiàn)缺氧情況，在缺氧狀態(tài)下會(huì)啟動(dòng)血管生成反應(yīng)，而隨著新生血管的生成，組織缺氧現(xiàn)象會(huì)隨之加重，兩者之間有著相輔相成的作用，形成一種惡性循環(huán)，共同促進(jìn)了NSCLC患者病情的進(jìn)一步進(jìn)展。近年來(lái)，臨床上逐漸開(kāi)展了較多以抗VEGF為靶點(diǎn)治療的研究，也取得了較好的成效[20-21]，而和HIF-2α相關(guān)的靶點(diǎn)研究報(bào)道仍較少，但本研究也為今后臨床治療NSCLC的靶向治療提供了一個(gè)新的方向，筆者也認(rèn)為，今后在NSCLC患者的診治中，可通過(guò)檢測(cè)HIF-2α、VEGF表達(dá)來(lái)評(píng)估患者預(yù)后，也有利于早期開(kāi)展相關(guān)治療。但是本研究也存在不足，例如未能分析兩者與患者預(yù)后、治療效果、生存率方面的影響等，且總體樣本量較少、樣本來(lái)源單一，今后也有待開(kāi)展更高質(zhì)量的研究。

綜上所述，NSCLC組織中HIF-2α、VEGF表達(dá)明顯升高，且和腫瘤直徑、TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間密切相關(guān)，臨床上應(yīng)予以重視，本研究也為今后臨床靶向治療NSCLC提供了新思路。