基于γ-Fe2O3磁性納米微球的過(guò)氧化物模擬酶研究

楊嬌，秦銘杉，呂海軍，顏雪濤，楊貴軍，楊琳燕，通信作者

（1. 天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300392；2. 天津市生物飼料添加劑企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300383）

磁性納米微球是指通過(guò)一定的方法使有機(jī)高分子與磁性金屬或金屬氧化物如鐵、鈷、鎳及其氧化物的超細(xì)粉末相結(jié)合所形成的具有一定磁性及特殊結(jié)構(gòu)的微球[1]。在生物化學(xué)反應(yīng)中過(guò)氧化物酶是一種很重要的催化劑，通過(guò)對(duì)磁性微球進(jìn)行修飾，在粒子表面接上不同的物質(zhì)可為粒子提供表面功能性，也使其作為過(guò)氧化物模擬酶催化各種生物化學(xué)反應(yīng)[2-8]。GOD廣泛分布于動(dòng)植物和微生物體內(nèi)[9-12]。葡萄糖氧化酶（GOD）可催化β-D-葡萄糖氧化生成葡萄糖酸和過(guò)氧化氫，酶法檢測(cè)葡萄糖具有準(zhǔn)確快速、靈敏度高的特點(diǎn)。近年來(lái)，葡萄糖氧化酶法已被廣泛用于生物化學(xué)、臨床化學(xué)及食品分析中葡萄糖的檢測(cè)，酶在正常條件下表現(xiàn)出很高的選擇性和反應(yīng)性，但對(duì)pH和溫度較敏感而易失活[13]。而經(jīng)過(guò)納米微?；腉OD具有穩(wěn)定性良好、保存期較長(zhǎng)和反應(yīng)迅速的優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)旨在研究經(jīng)過(guò)納米微粒化的GOD是否穩(wěn)定，以及是否具有催化活性。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

試驗(yàn)所用的試劑均為市售分析純，二甲基亞砜（DMSO），原硅酸四乙酯（TEOS），3-氨丙基三甲氧基硅烷（APTMS），N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基-碳二亞胺鹽酸鹽（EDC），3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB），2-（N嗎啉）乙磺酸-水合物（MES，上海源葉生物科技有限公司），葡萄糖氧化酶（GOD，上海源葉生物科技有限公司）。粉末X-射線衍射由X-射線衍射分析儀（RigakuD/max- III A）測(cè)定，熒光光譜由熒光分光光度計(jì)（美國(guó)VARIAN公司Cary Eclipse）測(cè)定。紅外光譜由Perkin-Elmer spectrometer 紅外光譜儀測(cè)定。X-射線光電子能譜（XPS）采用英國(guó)Axis Ultra，Kratos（UK）公司的儀器對(duì)表面進(jìn)行半定量表征，測(cè)試條件為單色鋁靶（150 W，15 KV，1 486.6 eV）。

1.2 γ-Fe2O3@SiO2制備與修飾

將2.0 g的γ-Fe2O3懸浮在60 mL二甲基亞砜（DMSO）中，在室溫下過(guò)夜，磁力攪拌19 h。然后，將該懸浮液置于超聲浴中1 h。在混合物中加入8 mL原硅酸四乙酯（TEOS）。室溫下在搖床中反應(yīng)48 h。在此過(guò)程中，TEOS分子通過(guò)硅氧烷（Si-O）鍵在納米粒子表面水解和縮合。將二氧化硅包覆的納米粒子離心，用蒸餾水和乙醇洗滌兩次，保存于20 mL無(wú)水乙醇中。

將APTMS（50 μL）滴加到保存于無(wú)水乙醇中的γ-Fe2O3@SiO2樣品中，并放入搖床使其混合物反應(yīng)24 h。用乙醇沖洗兩次后，在60 ℃下真空干燥過(guò)夜，得到γ-Fe2O3@SiO2-NH2。

將1.0 g的微球分散在30 mL無(wú)水乙醇中，超聲處理10 min。然后在緩慢攪拌下將3.0 g戊二酸酐加到懸浮液中，使其在37 ℃下反應(yīng)3 h。用超純水洗滌微球顆粒數(shù)次，60 ℃下真空干燥過(guò)夜，得到γ-Fe2O3@SiO2-NH2-COOH。

將1.0 g γ-Fe2O3@SiO2-NH2-COOH分散在20 mL MES緩沖溶液（0.1 mol/L，pH 6.0）中，然后加入300 mg EDC，將混合物超聲15 min，然后加入180 mg NHS，放入搖床中活化3～4 h，取出后加入12.7 mg GOD，超聲處理15 min后放入搖床中反應(yīng)24 h，得到γ-Fe2O3@SiO2-NH2-COOH- GOD[14-15]。

1.3 葡萄糖溶液制備及酶活性檢測(cè)

葡萄糖可在GOD的催化下生成葡萄糖酸，并釋放出H2O2。作為過(guò)氧化物模擬酶的γ-Fe2O3@ SiO2-NH2-COOH-GOD樣品也可以催化過(guò)氧化氫與TMB之間的反應(yīng)。在葡萄糖分解過(guò)程中，葡萄糖的分解濃度與獲得的過(guò)氧化氫濃度成正比，因此可以通過(guò)葡萄糖的濃度間接測(cè)量過(guò)氧化氫的濃度，就可判斷γ-Fe2O3@SiO2-NH2- COOH-GOD是否有催化作用。

葡萄糖溶液的配制：用等比稀釋的方法分別配置成1.6×10-3、8.0×10-4、4.0×10-4、2.0×10-4、1.0×10-4、5.0×10-5mol/L 6個(gè)濃度的D（+）-無(wú)水葡萄糖溶液，具體配制方法如下。

A：取11.5 mg的D（+）-無(wú)水葡萄糖加入40 mL純凈水（1.6×10-3mol/L）；

B：取A溶液20 mL加入20 mL純凈水（8.0× 10-4mol/L）；

C：取B溶液20 mL加入20 mL純凈水（4.0× 10-4mol/L）；

D：取C溶液20 mL加入20 mL純凈水（2.0× 10-4mol/L）；

E：取D溶液20 mL加入20 mL純凈水（1.0× 10-4mol/L）；

F：取E溶液20 mL加入20 mL純凈水（5.0× 10-5mol/L）。

葡萄糖的分解：將82.5 μL MES緩沖溶液（0.1 mol/L，pH 6.0）和7.5 μL γ-Fe2O3@SiO2-NH2- COOH-GOD（以1 g γ-Fe2O3@SiO2-NH2-COOH- GOD∶20 mL MES溶液比例取得）分別與6個(gè)等比稀釋后的D（+）-無(wú)水葡萄糖（10 μL）混合，在超聲條件下反應(yīng)30 min[16]。

檢測(cè)過(guò)氧化氫的濃度：將反應(yīng)后6個(gè)不同濃度的產(chǎn)物加入2.78 mL乙酸鈉-乙酸buffer（pH 3.6，0.2 mol/L），120 μL TMB（0.2 mmol/L，DMSO），放入6個(gè)標(biāo)記好的離心管中（10 mL），超聲處理40 min，然后將離心管放入離心機(jī)中離心，將上清放置另一離心管中等待檢測(cè)。通過(guò)熒光分光光度計(jì)檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 γ-Fe2O3修飾產(chǎn)物的IR表征

IR光譜分析是一種根據(jù)物質(zhì)的光譜來(lái)鑒別物質(zhì)及確定其化學(xué)組成、結(jié)構(gòu)或者相對(duì)含量的方法，主要用于定性分析分子中的官能團(tuán)。由圖1可知，兩種修飾物的紅外光譜曲線在400～4 000 cm-1波長(zhǎng)之間均出現(xiàn)了比較明顯的峰，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)記 載[17]，γ-Fe2O3紅外光譜包含F(xiàn)e-O鍵，558 cm-1的光譜峰。SiO2中擁有1 100 cm-1臨近的Si-O-Si鍵的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，本文中γ-Fe2O3@SiO2-NH2紅外光譜曲線在1 100 cm-1處存在。

圖1 紅外光譜表征圖

3 379 cm-1和1 637 cm-1為N-H的特征吸收峰，表明APTMS已成功引入到樣品顆粒表面，表明氨基化修飾成功[18]。而γ-Fe2O3@SiO2-NH2- COOH譜線在1 716 cm-1處存在C=O特征吸收峰。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)記載，可以證實(shí)戊二酸酐羧基化成功[19]。γ-Fe2O3@SiO2-NH2-COOH-GOD譜線在1 639 cm-1和1 560 cm-1處存在酰胺的吸收峰，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)記載，說(shuō)明GOD鍵合成功[20]。

2.2 XPS分析

XPS可以定性分析元素的種類，定性分析主要表現(xiàn)為從XPS圖譜的峰位和峰形獲得樣品表面的元素成分、化學(xué)態(tài)和分子結(jié)構(gòu)等信息。對(duì)γ-Fe2O3@SiO2-NH2-COOH-GOD進(jìn)行XPS分析，詳見圖2。由圖2a和表1可知，γ-Fe2O3@SiO2- NH2-COOH-GOD的高分辨率N1s譜有峰，表明APTMS已被成功修飾。γ-Fe2O3@SiO2-NH2- COOH-GOD樣品的高分辨率C1s譜在285.688 eV（C-O/C-N）處有一個(gè)峰（圖2b）。γ-Fe2O3@SiO2- NH2-COOH-GOD樣品的高分辨率O1s譜在529.414 eV（Fe-O）和531.685 eV（C=O）處各有一個(gè)峰（圖2c），表明酰胺反應(yīng)成功[21]。

表1 改性過(guò)程各步驟的結(jié)合能和元素比

2.3 酶的催化活性評(píng)估

利用熒光分光光度計(jì)，激發(fā)波長(zhǎng)λex=295 nm進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果詳見圖3、圖4。在此過(guò)程中，γ-Fe2O3@SiO2-NH2-COOH-GOD可以作為過(guò)氧化物模擬酶，催化 β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和過(guò)氧化氫（H2O2），而過(guò)氧化氫可與TMB生成藍(lán)色物質(zhì)，通過(guò)UV-vis分光光度計(jì)在652 nm檢測(cè)藍(lán)色產(chǎn)物，理論上，通過(guò)熒光檢測(cè)上清液的藍(lán)色物質(zhì)可得知，葡萄糖的濃度越高，生成藍(lán)色物質(zhì)的含量越多；而本試驗(yàn)結(jié)果卻與之相反，UV-vis分光光度計(jì)并未檢測(cè)到652 nm出峰，僅熒光分光光度計(jì)400 nm左右出現(xiàn)隨濃度增高而降低的峰，說(shuō)明可能出現(xiàn)了淬滅現(xiàn)象。

圖4 上清液密封保存5 d后檢測(cè)上清液的熒光光譜圖

根據(jù)圖5顯示，上清液密封保存5 d后檢測(cè)，隨著濃度升高藍(lán)色物質(zhì)的量減少明顯，甚至趨近于無(wú)，也說(shuō)明發(fā)生了淬滅現(xiàn)象[22]。

圖5 上清液密封保存5 d后的顏色差異（從左到右濃度依次增大）

3 討論

磁性納米粒子是一種具有良好生物相容性的吸附材料，具有吸附力強(qiáng)、易于磁液分離、比表面積大、粒徑小的優(yōu)點(diǎn)。故磁性納米材料在固定化酶、癌癥診斷、藥物輸送、磁流體熱療和磁共振成像、細(xì)胞分離等各個(gè)生物技術(shù)領(lǐng)域均有廣闊的應(yīng)用前景。但是在空氣中易于氧化、親水性較差，這些缺點(diǎn)使得磁性納米微球在生物技術(shù)領(lǐng)域應(yīng)用受到了限制，因此對(duì)磁性納米微球表面的修飾就顯得極為重要。GOD很高的選擇性和反應(yīng)性、對(duì)pH和溫度較敏感而易失活的特性也需要通過(guò)GOD固定化來(lái)解決。將GOD裝載在磁性納米微球上形成γ-Fe2O3@SiO2-NH2-GOOH-GOD，既有很好的催化活性，也使磁性納米微球的缺點(diǎn)得以改善。但值得注意的是γ-Fe2O3@SiO2-NH2- GOOH-GOD的催化活性有一定的限度，超出這個(gè)范圍會(huì)使酶發(fā)生淬滅。圖4和圖3對(duì)比可知，當(dāng)葡萄糖的濃度較低時(shí)，γ-Fe2O3@SiO2-NH2-GOOH- GOD的穩(wěn)定性較好且具有催化活性；而當(dāng)葡萄糖的濃度較高時(shí)，γ-Fe2O3@SiO2-NH2-GOOH-GOD的催化活性卻不及低濃度時(shí)的催化活性。而在放置后，催化活性變得很低甚至趨近于無(wú)。從圖5反應(yīng)物的顏色也能看出葡萄糖的濃度對(duì)于γ-Fe2O3@SiO2-NH2-GOOH-GOD的催化活性是有影響的。這說(shuō)明在γ-Fe2O3@SiO2-NH2-GOOH-GOD催化活性的研究中需要注意選擇合適的葡萄糖 濃度。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)采用共價(jià)修飾的方法對(duì)γ-Fe2O3進(jìn)行共價(jià)修飾，分別得到γ-Fe2O3@SiO2、γ-Fe2O3@ SiO2-NH2、γ-Fe2O3@SiO2-NH2-COOH、γ-Fe2O3@ SiO2-NH2-COOH-GOD納米粒子。用IR對(duì)納米粒子γ-Fe2O3、γ-Fe2O3@SiO2、γ-Fe2O3@SiO2-NH2、γ-Fe2O3@SiO2-NH2-GOOH、γ-Fe2O3@SiO2-NH2- GOOH-GOD進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。結(jié)果表明，葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase，GOD）在O2的存在下，可以對(duì)β-D-葡萄糖高速催化而產(chǎn)生葡萄糖酸和過(guò)氧化氫（H2O2），而γ-Fe2O3@SiO2-NH2-COOH- GOD可以作為過(guò)氧化物模擬酶，催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和過(guò)氧化氫（H2O2）。在葡萄糖的分解中，葡萄糖的分解濃度與獲得的H2O2濃度成比例，葡萄糖的分解濃度太高，酶會(huì)發(fā)生淬滅現(xiàn)象，而過(guò)氧化氫可與TMB生成藍(lán)色物質(zhì)，通過(guò)熒光檢測(cè)上清液的藍(lán)色物質(zhì)，可得知葡萄糖的濃度越高，生成藍(lán)色物質(zhì)的含量越少，二者之間成反比，說(shuō)明發(fā)生了淬滅現(xiàn)象。上清液密封保存5 d后檢測(cè)，隨著濃度升高藍(lán)色物質(zhì)的量減少明顯，甚至趨近于無(wú)，也說(shuō)明發(fā)生了淬滅現(xiàn)象。