DX保存液與甘油保存液對(duì)人角膜基質(zhì)透鏡保存效果的比較

田樂(lè) 李德衛(wèi) 彭予蘇 張飛飛 陳敏

山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬青島眼科醫(yī)院 山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬眼科研究所 山東省眼科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，青島 266071

飛秒激光小切口角膜基質(zhì)透鏡取出術(shù)(femtosecond small incision lenticule extraction，SMILE)目前已成為主流的角膜近視矯正手術(shù)，手術(shù)的廣泛開(kāi)展為健康人角膜基質(zhì)透鏡的再利用提供了豐富的標(biāo)本來(lái)源，使屈光手術(shù)“由減法變?yōu)榧臃ā背蔀榭赡?。有研究嘗試對(duì)1例一側(cè)近視眼SMILE術(shù)中取出的角膜基質(zhì)透鏡植入另一側(cè)遠(yuǎn)視眼角膜基質(zhì)中，隨訪1個(gè)月發(fā)現(xiàn)可安全、有效地對(duì)屈光參差患者進(jìn)行個(gè)性化矯正，可預(yù)測(cè)性好[1]。此外，在對(duì)圓錐角膜基質(zhì)制作囊袋后精確植入角膜基質(zhì)透鏡也取得了較好的臨床效果[2]。近年來(lái)有較多關(guān)于健康人角膜基質(zhì)透鏡臨床應(yīng)用的研究報(bào)道，如飛秒激光輔助的角膜基質(zhì)透鏡植入術(shù)聯(lián)合角膜交聯(lián)術(shù)對(duì)于初期圓錐角膜是可行的治療選擇，但目前仍需要長(zhǎng)期隨訪觀察術(shù)后效果[3]。可見(jiàn)人角膜基質(zhì)透鏡的再利用不僅可以對(duì)遠(yuǎn)視眼進(jìn)行矯正，也可用于圓錐角膜的治療，因此，人角膜基質(zhì)透鏡的保存逐漸成為關(guān)注的焦點(diǎn)。有研究將SMILE術(shù)中取出的角膜基質(zhì)透鏡在液氮中低溫冷凍保存96 d后植入遠(yuǎn)視眼角膜基質(zhì)囊袋內(nèi)，隨訪發(fā)現(xiàn)術(shù)后未發(fā)生排斥反應(yīng)且矯治效果好[4]。此外，對(duì)于各種角膜感染導(dǎo)致的深層角膜潰瘍和角膜穿孔，角膜移植術(shù)是可選擇的最佳治療方式；但目前我國(guó)仍存在角膜供體嚴(yán)重不足的現(xiàn)狀，能否利用SMILE術(shù)后取出的角膜基質(zhì)透鏡作為一種替代供體材料值得進(jìn)一步研究。探討人角膜基質(zhì)透鏡的合理保存方法無(wú)疑為拓展角膜疾病的治療方法提供了新的思路。本研究擬比較DX保存液和無(wú)水甘油保存液對(duì)SMILE術(shù)中取出人角膜基質(zhì)透鏡的保存效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1材料來(lái)源及分組 連續(xù)收集2019年2—5月于山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬青島眼科醫(yī)院行SMILE手術(shù)的中高度近視患者30例60眼的完整角膜基質(zhì)透鏡60個(gè)，其中男18例36眼，女12例24眼；患者年齡18～35歲，平均(26.71±5.06)歲；角膜基質(zhì)透鏡厚度為80～114 μm，平均(99.26±9.20)μm。采用隨機(jī)數(shù)表法將術(shù)中獲取的新鮮人角膜基質(zhì)透鏡分為正常對(duì)照組、DX保存液保存1 d組、DX保存液保存1周組、甘油保存1 d組、甘油保存1周組和甘油保存2周組，每組10個(gè)，其中正常對(duì)照組不做保存處理，其余各組依照分組的不同分別采用DX保存液和甘油保存1 d、1周或2周。本研究方案遵循《赫爾辛基宣言》，經(jīng)山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬青島眼科醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批[批文號(hào)：青眼倫審2019(30)號(hào)]，所有受試者均了解本研究方法和目的并自愿簽署知情同意書(shū)。

1.1.2主要試劑及儀器 錐蟲(chóng)藍(lán)染色液(福建邁新公司)；蘇木精-伊紅染色液(無(wú)錫江原公司)；Epon812環(huán)氧樹(shù)脂(美國(guó)EMS公司)；質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鋨酸、醋酸雙氧鈾硝酸鉛(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供)；DX保存液(細(xì)胞培養(yǎng)基MEM中加入0.05 mmol/L地塞米松、質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%硫酸軟骨素、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%葡聚糖等)(青島眼科醫(yī)院眼庫(kù)提供)；無(wú)水甘油保存液(滅菌甘油，河北金鐘制藥有限公司)。Visumax全飛秒激光系統(tǒng)(德國(guó)Carl Zeiss公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；透射電子顯微鏡(捷克賽默飛公司)。

1.2 方法

1.2.1人角膜基質(zhì)透鏡的取出 保持手術(shù)室溫度(21～23 ℃)、濕度(45%～55%)恒定，手術(shù)由同一位醫(yī)師完成。術(shù)前3 d，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%左氧氟沙星滴眼液(日本參天制藥有限公司)點(diǎn)術(shù)眼，每天5次，術(shù)前采用鹽酸丙美卡因滴眼液(美國(guó)愛(ài)爾康公司)點(diǎn)眼行表面麻醉。采用Visumax全飛秒激光系統(tǒng)行SMILE手術(shù)，參數(shù)設(shè)置：脈沖重復(fù)頻率為500 kHz，脈沖能量為25 nJ；點(diǎn)間距為4.4 μm；光區(qū)直徑為6.5 mm，角膜帽厚度為110 μm、直徑為7.6 mm，于角膜11：00位行2 mm長(zhǎng)、120°側(cè)切口。進(jìn)行常規(guī)手術(shù)操作，取出完整角膜基質(zhì)透鏡立即置于保存液中，DX保存液組立即放入4 ℃冰箱保存，甘油保存液組立即放入-20 ℃冰箱低溫保存。

1.2.2錐蟲(chóng)藍(lán)染色法檢測(cè)角膜基質(zhì)透鏡細(xì)胞死亡數(shù)量 每組各取4個(gè)標(biāo)本，將角膜基質(zhì)透鏡組織平鋪于載玻片，均勻滴加錐蟲(chóng)藍(lán)染色液，浸泡1 min，立即用吸管吸干染液，置于光學(xué)顯微鏡下檢查，200倍視野下隨機(jī)選取4個(gè)視野進(jìn)行觀察并拍照，淡藍(lán)色染色者為死亡細(xì)胞，采用ImageJ軟件進(jìn)行死亡細(xì)胞計(jì)數(shù)，分別計(jì)數(shù)每組4個(gè)視野平均死亡細(xì)胞數(shù)。

1.2.3光學(xué)顯微鏡下觀察角膜基質(zhì)透鏡形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性 每組各取3個(gè)標(biāo)本，將角膜基質(zhì)透鏡置于二甲苯中共3次，每次15 min，分別置于無(wú)水乙醇、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇和80%乙醇中各2 min；自來(lái)水沖洗，蘇木素染色，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%伊紅染色，晾干后中性快干膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察角膜基質(zhì)透鏡形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性。

1.2.4透射電子顯微鏡下觀察角膜基質(zhì)透鏡的超微結(jié)構(gòu) 每組各取3個(gè)標(biāo)本，將角膜基質(zhì)透鏡置于體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液中固定過(guò)夜，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)浸洗，1%鋨酸冷固定，脫水，Epon812環(huán)氧樹(shù)脂包埋樣品，半薄切片定位，UltracutE超薄切片機(jī)切片，醋酸雙氧鈾硝酸鉛染色，透射電子顯微鏡下觀察角膜基質(zhì)透鏡的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和膠原纖維結(jié)構(gòu)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組角膜基質(zhì)透鏡中死亡細(xì)胞數(shù)量比較

錐蟲(chóng)藍(lán)染色法結(jié)果顯示，DX保存液保存1 d組和DX保存液保存1周組死亡細(xì)胞均較少；與DX保存液保存1 d組和DX保存液保存1周組相比，甘油保存1 d組和甘油保存1周組死亡細(xì)胞數(shù)增多，甘油保存2周組死亡細(xì)胞數(shù)明顯增多(圖1)。5個(gè)組死亡細(xì)胞數(shù)總體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=16.37，P<0.05)，其中DX保存液保存1 d組和DX保存液保存1周組死亡細(xì)胞數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；甘油保存1 d組死亡細(xì)胞數(shù)明顯少于甘油保存1周組和甘油保存2周組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；甘油保存1周組與甘油保存2周組死亡細(xì)胞數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；DX保存液保存1 d組與甘油保存1 d組死亡細(xì)胞數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；甘油保存1周組死亡細(xì)胞數(shù)明顯多于DX保存液保存1周組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

圖1 各組角膜基質(zhì)透鏡細(xì)胞存活情況(錐蟲(chóng)藍(lán) ×200，標(biāo)尺=50 μm) A：DX保存液保存1 d組死亡細(xì)胞(箭頭)較少 B：DX保存液保存1周組死亡細(xì)胞(箭頭)與DX保存液保存1 d組接近 C：甘油保存1 d組死亡細(xì)胞(箭頭)較DX保存液保存1 d組和DX保存液保存1周組增多 D：甘油保存1周組死亡細(xì)胞(箭頭)增多 E：甘油保存2周組死亡細(xì)胞(箭頭)明顯增多Figure 1 Cell survival state of corneal stromal lens in different groups(Trypan blue ×200,bar=50 μm) A：The number of dead cells (arrow) was less in the DX preserved 1-day group B：The number of dead cells (arrow) in the DX preserved 1-week group was similar to that of the DX preserved 1-day group C：The number of dead cells (arrow) was increased in the glycerin preserved 1-day group compared with the DX preserved 1-day group and DX preserved 1-week group D：The number of dead cells (arrow) was increased in the glycerin preserved 1-week group compared with the glycerin preserved 1-day group E：There were more dead cells (arrow) in the glycerin preserved 2-week group compared with the glycerin preserved 1-week group

表1 各組角膜基質(zhì)透鏡中死亡細(xì)胞數(shù)比較(x±s,個(gè)/視野)Table 1 Comparison of the number of dead cells in corneal stromal lens among various groups (x±s,pcs/field)組別樣本量死亡細(xì)胞數(shù)DX保存液保存1 d組453.1±14.2DX保存液保存1周組450.8±9.8甘油保存1 d組470.4±13.6甘油保存1周組4172.8±31.7ab甘油保存2周組4182.8±14.2bF值16.37P值<0.05 注:與DX保存液保存1周組比較,aP<0.05;與甘油保存1 d組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) Note:Compared with the DX preserved 1-week group,aP<0.05;compared with the glycerin preserved 1-day group,aP<0.05(One-way ANOVA,LSD-t test)

2.2 各組角膜基質(zhì)透鏡形態(tài)結(jié)構(gòu)變化

光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)正常對(duì)照組角膜基質(zhì)透鏡膠原纖維呈平行排列，無(wú)水腫；DX保存液保存1 d組角膜基質(zhì)透鏡較致密，膠原纖維排列較規(guī)則；DX保存液保存1周組角膜基質(zhì)透鏡膠原纖維排列仍較規(guī)則，細(xì)胞較完整;甘油保存1 d組可見(jiàn)角膜基質(zhì)組織水腫，膠原纖維排列疏松，細(xì)胞核裸露，隨著甘油保存時(shí)間的延長(zhǎng)，組織內(nèi)膠原纖維逐漸變疏松，組織結(jié)構(gòu)紊亂(圖2)。

圖2 各組角膜基質(zhì)透鏡組織形態(tài)觀察 A：正常對(duì)照組膠原纖維平行排列，無(wú)水腫(HE ×200，標(biāo)尺=50 μm) B：DX保存液保存1 d組角膜基質(zhì)組織結(jié)構(gòu)致密，膠原纖維排列規(guī)則(HE ×400，標(biāo)尺=20 μm) C：DX保存液保存1周組膠原纖維排列規(guī)則，細(xì)胞尚完整(HE ×400，標(biāo)尺=20 μm) D：甘油保存1 d組角膜基質(zhì)透鏡增厚(HE ×400，標(biāo)尺=20 μm) E：甘油保存1周組角膜基質(zhì)透鏡膠原纖維排列疏松(HE ×400，標(biāo)尺=20 μm) F：甘油保存2周組角膜基質(zhì)透鏡膠原纖維排列紊亂，細(xì)胞核裸露(HE ×400，標(biāo)尺=20 μm)Figure 2 Morphology findings of the corneal stromal lens in different groups A：Collagen fibers were arranged in parallel without edema in the normal control group (HE ×200,bar=50 μm) B：The arrangement of collagen fibers of the corneal stromal lens was regular in the DX preserved 1-day group (HE ×400,bar=20 μm) C：The arrangement of collagen fibers was regular and the cells were intact in the DX preserved 1-week group (HE ×400,bar=20 μm) D：The corneal stromal lens was thickened in the glycerin preserved 1-day group (HE ×400,bar=20 μm) E：The arrangement of collagen fibers was loose in the glycerin preserved 1-week group (HE ×400,bar=20 μm) F：The arrangement of collagen fibers was disorder and the nuclei were bare in the glycerin preserved 2-week group (HE ×400,bar=20 μm)

2.3 各組角膜基質(zhì)透鏡中基質(zhì)細(xì)胞和膠原纖維結(jié)構(gòu)超微結(jié)構(gòu)變化

正常角膜基質(zhì)透鏡組織膠原纖維排列規(guī)則、邊界清晰，可見(jiàn)完整細(xì)胞器結(jié)構(gòu)；DX保存液保存1 d組和DX保存液保存1周組角膜基質(zhì)細(xì)胞分布均勻，細(xì)胞核完整,膠原纖維分布均勻、致密；甘油保存1 d組角膜基質(zhì)組織膠原纖維較致密，細(xì)胞核尚完整,膠原纖維分布均勻、致密；甘油保存1周組角膜基質(zhì)細(xì)胞分布稀疏，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，膠原纖維分布稀疏；甘油保存2周組角膜基質(zhì)細(xì)胞分布明顯稀疏，未見(jiàn)完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)，膠原纖維分布極不均勻、稀疏(圖3～5)。

圖3 正常對(duì)照組角膜基質(zhì)透鏡超微結(jié)構(gòu)(醋酸雙氧鈾硝酸鉛 ×50 000，標(biāo)尺=500 nm) 透射電子顯微鏡下觀察可見(jiàn)膠原纖維(藍(lán)色箭頭)排列規(guī)則，邊界清晰，可見(jiàn)結(jié)構(gòu)正常的細(xì)胞器(紅色箭頭) 圖4 各DX保存液保存組角膜基質(zhì)透鏡超微結(jié)構(gòu)(醋酸雙氧鈾硝酸鉛) A：DX保存液保存1 d組細(xì)胞核完整(×15 000，標(biāo)尺=2 μm) B：DX保存液保存1 d組角膜基質(zhì)細(xì)胞分布均勻(×100 000，標(biāo)尺=200 nm) C：DX保存液保存1周組細(xì)胞核尚完整(×15 000，標(biāo)尺=2 μm) D：DX保存液保存1周組角膜基質(zhì)細(xì)胞分布尚均勻(×100 000，標(biāo)尺=200 nm)Figure 3 Ultrastructure of corneal stromal lens in the normal control group(Uranyl acetate lead nitrate ×50 000,bar=500 nm) The arrangement of collagen fibers (blue arrow) was regular with clear boundaries,and well-identified organelles (red arrow) were seen Figure 4 Ultrastructure of the corneal stromal lens preserved with DX solution(Uranyl acetate lead nitrate) A：The nucleus was intact in the DX preserved 1-day group (×15 000,bar=2 μm) B：The distribution of the cells was even in the DX preserved 1-day group (×100 000,bar=200 nm) C：The nucleus was still intact in the DX preserved 1-week group (×15 000,bar=2 μm) D：The distribution of the cells was still even in the DX preserved 1-week group (×100 000,bar=200 nm)

圖5 各甘油保存組角膜基質(zhì)透鏡超微結(jié)構(gòu)(醋酸雙氧鈾硝酸鉛) A：甘油保存1 d組膠原纖維較致密，細(xì)胞核尚完整(×15 000，標(biāo)尺=2 μm) B：甘油保存1 d組細(xì)胞分布均勻(×100 000，標(biāo)尺=200 nm) C：甘油保存1周組角膜基質(zhì)細(xì)胞明顯變形(×15 000，標(biāo)尺=2 μm) D：甘油保存1周組細(xì)胞數(shù)量明顯減少(×100 000，標(biāo)尺=200 nm) E：甘油保存2周組角膜基質(zhì)細(xì)胞形態(tài)消失(×15 000，標(biāo)尺=2 μm) F：甘油保存2周組細(xì)胞排列稀疏(×100 000，標(biāo)尺=200 nm)Figure 5 Ultrastructure of the corneal stromal lens in various glycerin preserved groups(Uranyl acetate lead nitrate) A：The arrangement of collagen fibers was still regular with intact nuclei in the glycerin preserved 1-day group (×15 000,bar=2 μm) B：The distribution of the cells was still even in the glycerin preserved 1-day group (×100 000,bar=200 nm) C：The cell deformation was seen under the transmission electron microscope in the glycerin preserved 1-week group (×15 000,bar=2 μm) D：The number of cells was less in the glycerin preserved 1-week group (×100 000,bar=200 nm) E：The cells were destroyed in the glycerin preserved 2-week group (×15 000,bar=2 μm) F：The cell arrangement was sparse in the glycerin preserved 2-week group (×100 000,bar=200 nm)

3 討論

目前角膜移植仍是各種角膜感染導(dǎo)致的角膜深層潰瘍和角膜穿孔的有效治療方法，但嚴(yán)重的角膜供體不足給嚴(yán)重角膜疾病的治療帶來(lái)了很大困難，尋求良好的角膜供體成為角膜移植手術(shù)開(kāi)展的瓶頸問(wèn)題，利用SMILE術(shù)后取出的健康人角膜基質(zhì)透鏡為角膜供體來(lái)源提供了新的途徑。近期關(guān)于角膜基質(zhì)透鏡再利用的研究較多，主要包括遠(yuǎn)視、圓錐角膜的治療及作為板層材料對(duì)角膜穿孔的修復(fù)等，具有效果良好、免疫排斥反應(yīng)性低的特點(diǎn)。Riau等[5]報(bào)道人角膜基質(zhì)透鏡低溫保存后植入靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物角膜中是安全、有效且可行的。Liu等[6]和Sun等[7]利用自體透鏡移植矯治遠(yuǎn)視獲得了良好的效果。在治療角膜疾病方面，Yin等[8]研究發(fā)現(xiàn)，利用纖維蛋白膠將2層，甚至多層角膜基質(zhì)透鏡進(jìn)行粘合后可具有與角膜基質(zhì)相同的生物活性，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)角膜基質(zhì)透鏡用于角膜穿孔的修復(fù)過(guò)程中未發(fā)生角膜新生血管、植片降解和排斥反應(yīng)。許多研究表明，將角膜基質(zhì)透鏡用于角膜疾病的治療是可行的，Wu等[9]將厚度為100 μm的人角膜基質(zhì)透鏡用于6例角膜穿孔患眼的治療，術(shù)后3～4周部分患眼植入的透鏡與角膜基質(zhì)相融合，隨訪1年未出現(xiàn)感染、復(fù)發(fā)或再穿孔。Bhandari等[10]采用纖維蛋白膠將新鮮人角膜基質(zhì)透鏡粘合于角膜穿孔病灶，視力和植片透明性均較好。多個(gè)臨床研究報(bào)道了多層人角膜基質(zhì)透鏡單獨(dú)應(yīng)用或聯(lián)合羊膜移植治療角膜潰瘍的短期療效，認(rèn)為是安全、有效的，這些研究所用的透鏡均為純甘油-80 ℃保存的人角膜基質(zhì)透鏡，最長(zhǎng)保存30 d。但是，這些研究的局限性均為樣本量較小且隨訪時(shí)間較短[11-14]。無(wú)論如何，以上研究為嚴(yán)重角膜疾病的治療研究提供了新的方法選擇。

SMILE手術(shù)是目前主流的角膜屈光手術(shù)方式，但不同近視程度患者可取出角膜基質(zhì)透鏡的厚度也有差別，目前臨床上取出的角膜基質(zhì)透鏡厚度大多為65～120 μm，其中較厚的角膜基質(zhì)透鏡對(duì)角膜潰瘍或角膜穿孔的移植效果更好。本研究選取的角膜基質(zhì)透鏡厚度為90～110 μm，一經(jīng)取出立即置于保存液中，雖然避免了外在環(huán)境對(duì)新鮮角膜基質(zhì)透鏡組織的影響，但不同保存液對(duì)這些組織的保存效果和安全性是亟待解決的問(wèn)題。

目前，關(guān)于角膜基質(zhì)透鏡保存的研究較少，大多是關(guān)于將角膜基質(zhì)透鏡低溫保存于細(xì)胞培養(yǎng)液及相關(guān)成分中的方法學(xué)研究。新加坡眼科研究所應(yīng)用改良的低溫保存方法保存1個(gè)月，發(fā)現(xiàn)角膜基質(zhì)纖維密度降低但膠原結(jié)構(gòu)保持完好[15]。Liu等[16]研究團(tuán)隊(duì)探討了8種不同保存方式對(duì)于角膜基質(zhì)透鏡的影響，保存液包括PBS、DMEM、甘油和無(wú)血清培養(yǎng)基等，發(fā)現(xiàn)室溫下連續(xù)4周保存于甘油的角膜基質(zhì)透鏡透明度高，組織完整性好，免疫原性低。Liang等[17]分別采用Optisol角膜中期保存液、干燥劑和無(wú)水甘油保存角膜基質(zhì)透鏡，結(jié)果顯示Optisol角膜中期保存液保存效果較好，保存后14 d仍可見(jiàn)相對(duì)清晰的膠原結(jié)構(gòu)。韋琦等[18]研究發(fā)現(xiàn)人角膜基質(zhì)透鏡保存于-80 ℃超低溫冰箱84個(gè)月其透明性和完整性仍較好，超低溫技術(shù)可用于人角膜基質(zhì)透鏡的長(zhǎng)期保存。

DX保存液由山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬青島眼科醫(yī)院自主研制，相對(duì)于Optisol角膜中期保存液配制簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，與Optisol保存液的不同之處在于含有地塞米松，并去除了TC-199和多種維生素、上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子等成分，有效期為配制后1周[19]。我國(guó)部分地區(qū)醫(yī)療機(jī)構(gòu)不具備低溫冷凍保存條件，角膜材料也非常匱乏，對(duì)于嚴(yán)重角膜潰瘍或穿孔者利用SMILE術(shù)取材后經(jīng)DX保存液保存的人角膜基質(zhì)透鏡進(jìn)行角膜移植術(shù)以作為一種替代治療對(duì)于挽救患者的視力具有重要意義。由于目前近視矯治的角膜屈光手術(shù)的普及，新鮮的人角膜基質(zhì)透鏡立即應(yīng)用效果會(huì)更好，但行SMILE手術(shù)的高度近視者比例尚不高，人角膜基質(zhì)透鏡并不能及時(shí)應(yīng)用于臨床，用DX保存液保存1周的人角膜基質(zhì)透鏡與未經(jīng)保存處理的新鮮角膜基質(zhì)透鏡效果是否相近值得進(jìn)一步探討。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)錐蟲(chóng)藍(lán)染色法探討不同保存條件下角膜基質(zhì)透鏡中的死亡細(xì)胞數(shù)量，發(fā)現(xiàn)DX保存液保存1 d和1周對(duì)組織和細(xì)胞均無(wú)明顯影響，但甘油保存1周后死亡細(xì)胞數(shù)明顯增多。本研究采用組織形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)觀察，發(fā)現(xiàn)DX保存液保存1周的角膜基質(zhì)透鏡結(jié)構(gòu)完好，膠原纖維較致密，證明組織的透明度很好，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，而無(wú)水甘油低溫冷凍保存1周時(shí)，膠原纖維排列疏松，組織也失去了正常結(jié)構(gòu)。甘油保存是一種非活性的保存方法，主要是通過(guò)低溫防腐保存以維持組織的膠原板層結(jié)構(gòu)，去除生物原性，也能有效地用于各種炎癥反應(yīng)及血管化導(dǎo)致的角膜疾病的治療。本研究發(fā)現(xiàn)，與甘油保存的角膜基質(zhì)透鏡相比，DX保存液在維持透鏡組織結(jié)構(gòu)的完整性方面效果更好。

國(guó)內(nèi)對(duì)于人角膜基質(zhì)透鏡保存的研究報(bào)道較少，本研究對(duì)不同保存液保存不同時(shí)間后人角膜基質(zhì)透鏡的組織特點(diǎn)進(jìn)行了研究，但仍需要進(jìn)一步檢測(cè)保存后角膜基質(zhì)透鏡生物活性的變化，特別是角膜基質(zhì)損傷修復(fù)相關(guān)因子基質(zhì)金屬蛋白酶2等以及免疫排斥相關(guān)因子人白細(xì)胞DR抗原、白細(xì)胞共同抗原等的表達(dá)變化，以判斷人角膜基質(zhì)透鏡的臨床應(yīng)用價(jià)值，有利于某些眼部疾病的治療方法選擇。

綜上所述，本研究結(jié)果表明人角膜基質(zhì)透鏡保存于DX保存液1周內(nèi)其膠原纖維排列緊密，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，但關(guān)于保存后角膜基質(zhì)透鏡生物活性及免疫相關(guān)問(wèn)題和對(duì)臨床應(yīng)用的價(jià)值仍需進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明田樂(lè)：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析、起草文章；李德衛(wèi)、彭予蘇、張飛飛：參與實(shí)驗(yàn)，采集數(shù)據(jù)；陳敏：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)施研究、對(duì)文章的知識(shí)性?xún)?nèi)容作批評(píng)性審閱