晝夜節(jié)律變化對(duì)RORs表達(dá)及RORs激動(dòng)劑SR1078對(duì)角膜上皮創(chuàng)傷修復(fù)的影響

徐鵬洋 李志杰 薛蕓霞

1暨南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，廣州 510632；2暨南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院眼科研究所，廣州 510632

角膜上皮細(xì)胞通過(guò)不斷更新的方式來(lái)保持角膜上皮的穩(wěn)態(tài)，角膜上皮細(xì)胞更新節(jié)律異常會(huì)造成角膜上皮穩(wěn)態(tài)的失衡，引起角膜上皮缺損[1]。角膜損傷的修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，主要過(guò)程為創(chuàng)口區(qū)域炎癥反應(yīng)的觸發(fā)引起炎癥細(xì)胞從角膜緣周圍血管滲出，清除損傷區(qū)域的壞死組織，并伴隨著炎癥反應(yīng)的消退，使基底細(xì)胞重塑角膜基質(zhì)。視黃酸相關(guān)孤兒受體(retinoic acid-related orphan receptors，RORs)由RORα、RORβ和RORγ 3個(gè)成員組成，分布在全身各個(gè)部位，在生理節(jié)律調(diào)節(jié)、新陳代謝紊亂、炎癥發(fā)生以及免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)等生理病理過(guò)程中扮演重要角色。ROR基因轉(zhuǎn)錄具有節(jié)律性，當(dāng)小鼠RORα缺失時(shí)，會(huì)擾亂生物鐘基因Bmal1的調(diào)控，引起晝夜節(jié)律的異常[2]。相關(guān)研究表明，小鼠缺乏RORα/RORγ可顯著降低Cry1、Bmal1、Rev-Erbα和Per2等時(shí)鐘基因的活性[3]。RORs激動(dòng)劑SR1078能夠合成RORα/γ，提高RORα和RORγ RNA的表達(dá)活性，促使RORα/RORγ與目的基因啟動(dòng)子上的ROR調(diào)控元件(ROR response element，RORE)結(jié)合，刺激RORα/RORγ目的基因的表達(dá)[4]。晝夜節(jié)律是生命適應(yīng)內(nèi)部環(huán)境周期變化演變而來(lái)的內(nèi)在計(jì)時(shí)機(jī)制，其中環(huán)境對(duì)機(jī)體的節(jié)律性改變最大的機(jī)制是光照/黑暗循環(huán)，在維持細(xì)胞活動(dòng)(如激素分泌、細(xì)胞增生和細(xì)胞內(nèi)代謝等)的轉(zhuǎn)化及有序性和協(xié)同性方面發(fā)揮重要作用。研究表明，不同的光照條件下角膜上皮的有絲分裂能力會(huì)發(fā)生明顯改變，影響角膜創(chuàng)傷修復(fù)的能力[5-7]?？梢姽獾墓庾訒?huì)破壞DNA和細(xì)胞膜、線粒體等細(xì)胞器，并通過(guò)產(chǎn)生活性氧和破壞細(xì)胞色素而影響細(xì)胞的呼吸作用[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)晝夜節(jié)律對(duì)角膜的正常生長(zhǎng)發(fā)育和角膜厚度變化具有較大影響[10]，角膜上皮的更新具有日節(jié)律性[7]，光照節(jié)律也能夠引起大鼠視網(wǎng)膜中時(shí)鐘基因的表達(dá)發(fā)生改變[11]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，許多疾病的發(fā)生與基因突變或環(huán)境因素引起的晝夜節(jié)律改變密切相關(guān)[12]，RORα/RORγ在角膜、大腦、胸腺、肝臟和肺臟等多種組織中均有表達(dá)，目前關(guān)于RORα/RORγ的相關(guān)研究主要聚焦于各種癌癥、腦部及淋巴細(xì)胞發(fā)育的研究，而RORα/RORγ對(duì)角膜影響的相關(guān)研究較少。本研究擬探討SR1078對(duì)角膜上皮修復(fù)的動(dòng)力學(xué)影響，觀察不同晝夜節(jié)律下RORα/RORγ表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化及SR1078作用下角膜創(chuàng)傷修復(fù)動(dòng)力學(xué)以及分裂細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化，為SR1078對(duì)角膜上皮細(xì)胞創(chuàng)傷修復(fù)的調(diào)控及其影響因素的研究提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取SPF級(jí)健康無(wú)眼疾雌性6～8周齡C57BL/6小鼠222只(購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，飼養(yǎng)于(24±2)℃、SPF級(jí)動(dòng)物房中，飼養(yǎng)過(guò)程中自由進(jìn)食。本研究嚴(yán)格遵循美國(guó)視覺與眼科學(xué)研究協(xié)會(huì)制定的ARVO聲明，經(jīng)暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批文號(hào)：JN-A-2002-01)。

1.1.2主要試劑及儀器 SR1078(1246525-60-9)(美國(guó)MedChemExpress公司)；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)(廣州瑞泰生物科技有限公司)；RNAsimple總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；體積分?jǐn)?shù)10% Triton-X100、水合氯醛、熒光素鈉、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)(廣州斯佳生物技術(shù)有限公司)；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染液(上海碧云天生物試劑公司)；ReverTra Ace qPCR RT試劑盒、SYBR Green Master Mix(日本Bio-Toyobo公司)；引物(美國(guó)Thermo Fisher公司)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、梯度PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；高爾夫樣刀(美國(guó)Accutome公司)；SZ61體式顯微鏡、正置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1小鼠分組及干預(yù) 根據(jù)小鼠飼養(yǎng)室接受的光照節(jié)律不同，采用隨機(jī)數(shù)表法將180只小鼠分為晝夜節(jié)律正常組、全晝組、全夜組、晝夜顛倒12 h組、晝夜顛倒3周組，每組36只；根據(jù)接受的干預(yù)不同，采用隨機(jī)數(shù)表法將48只小鼠角膜損傷模型分為SR1078組和PBS對(duì)照組，每組24只。各組小鼠造模前均置于可控制光照(光照強(qiáng)度300 lx)及黑暗時(shí)間的節(jié)律箱中，其中晝夜節(jié)律正常組、PBS對(duì)照組和SR1078組節(jié)律箱的連續(xù)光照時(shí)間為7：00～19：00，連續(xù)黑暗時(shí)間為19：00～次日7：00；晝夜顛倒12 h組光干預(yù)節(jié)律時(shí)間相反；晝夜顛倒3周組黑暗/光照模式同晝夜顛倒12 h組，但連續(xù)3周；全晝組為連續(xù)24 h光照狀態(tài)；全夜組為連續(xù)24 h黑暗狀態(tài)。SR1078組和PBS對(duì)照組于角膜上皮損傷及修復(fù)模型造模后0 h分別采用SR1078溶液和PBS每隔6 h點(diǎn)眼1次，持續(xù)至造模后48 h。根據(jù)Zeitgeber Time計(jì)時(shí)法，以開始光照時(shí)間7：00記為ZT0，以關(guān)閉光照時(shí)間19：00記為ZT12。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定角膜中RORα和RORγ mRNA表達(dá)量 采用頸椎脫臼法將不同光干預(yù)節(jié)律組小鼠處死，每組各時(shí)間點(diǎn)(ZT1、ZT5、ZT9、ZT13、ZT17、ZT21)獲取3只小鼠，雙眼含帶角膜緣的完整角膜。采用RNAsimple總RNA提取試劑盒提取總RNA，通過(guò)ReverTra Ace qPCR RT試劑盒合成cDNA，總反應(yīng)體系為30 μl，反應(yīng)條件為：33 ℃ 20 min，96 ℃ 7 min，3 ℃ 3 min，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩２捎肧YBR Green Master Mix在Applied Biosystems 7900HT實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)中進(jìn)行定量PCR，分別以小鼠RORα和RORγ為引物，RORα正向引物序列為5’-TCAGCA GAGCAATGCCACCTAC-3’，反向引物序列為5’-TGGA CATCCGACCAAACTTGAC-3’；RORγ正向引物序列為5’-CAAGTCATCTGGCATCCACTACGG-3’，反向引物序列為5’-GCGGCTGGTTCGGTCAATGG-3;以GAPDH為內(nèi)參，GAPDH正向引物序列為5’-GAAGGAC ACTGAGCAAGAG-3’，反向引物序列為5’-TGCAGCG AACTTTATTGATG-3’。熱循環(huán)方案為：95 ℃ 510 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s。采用2-ΔΔCt法計(jì)算各組不同時(shí)間點(diǎn)RORα和RORγ mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3角膜上皮損傷及修復(fù)模型的建立 PBS對(duì)照組和SR1078組各選取3只小鼠，參照文獻(xiàn)[13]中的方法，小鼠腹腔內(nèi)注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%水合氯醛(0.05～0.1 ml)進(jìn)行全身麻醉，在解剖臺(tái)用直徑0.2 cm的環(huán)鉆標(biāo)記小鼠雙眼角膜中央?yún)^(qū)域，采用高爾夫樣刀機(jī)械性刮除標(biāo)記區(qū)域的角膜上皮。采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%熒光素鈉點(diǎn)眼評(píng)估角膜上皮缺損面積。造模后即刻(0 h)開始，每隔4 h采用Adobe Photoshop CC2019軟件測(cè)量角膜上皮缺損面積，直至角膜完全上皮化。計(jì)算并比較2個(gè)組小鼠角膜上皮缺損率。角膜上皮缺損率=造模后某時(shí)間點(diǎn)上皮缺損面積/造模后0 h角膜缺損面積×100%。造模后0 h角膜上皮缺損率為100%。

1.2.4全角膜鋪片及免疫熒光染色法觀察角膜上皮基底細(xì)胞分裂數(shù) 分別于造模后12、18、24、30、36、42和48 h采用頸椎脫臼法處死PBS對(duì)照組和SR1078組小鼠各3只，摘取雙側(cè)眼球，體積分?jǐn)?shù)2%甲醛溶液中固定40～60 min。在PBS中取出含角膜緣的完整角膜。用調(diào)速搖床振蕩器將角膜上皮置于PBS中清洗3次，每次5 min，置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% BSA溶液200 ml中封閉15 min，用手術(shù)刀片將角膜上皮分為中央相連的4個(gè)瓣，角膜上皮面朝上呈放射狀置于載玻片上，滴加含有DAPI的封片劑，蓋上蓋玻片，4 ℃避光保存。正置熒光顯微鏡下觀察角膜上皮分裂細(xì)胞，DAPI染色細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)呈亮藍(lán)色，細(xì)胞核為白色，未分裂的角膜上皮基底細(xì)胞呈圓形或橢圓形，分裂細(xì)胞呈啞鈴狀。

1.2.5小鼠角膜分區(qū)及上皮分裂細(xì)胞計(jì)數(shù) 根據(jù)文獻(xiàn)[14]的方法對(duì)角膜進(jìn)行分區(qū)(圖1)，從角膜緣到角膜中央共將角膜分為5個(gè)區(qū)，在5個(gè)區(qū)的角膜中選取經(jīng)角膜中央的縱向和橫向2條相互垂直的徑線，熒光顯微鏡下在其橫向徑線和縱向徑線分別均勻選取9個(gè)目標(biāo)視野進(jìn)行觀察并拍照，評(píng)估分裂細(xì)胞的增生及遷移情況，各視野分裂細(xì)胞之和作為完整角膜的分裂細(xì)胞數(shù)，對(duì)PBS對(duì)照組和SR1078組小鼠角膜上皮分裂細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行比較。

圖1 角膜分裂細(xì)胞計(jì)數(shù)分區(qū)示意圖Figure 1 Schematic diagram of corneal zoning

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組不同時(shí)間點(diǎn)小鼠角膜RORα和RORγ mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

晝夜節(jié)律正常組、全晝組、全夜組、晝夜顛倒12 h組和晝夜顛倒3周組不同時(shí)間點(diǎn)小鼠角膜RORα mRNA相對(duì)表達(dá)量總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F分組=143.28，P<0.001；F時(shí)間=30.11，P<0.001)，其中與晝夜節(jié)律正常組比較，全夜組小鼠在ZT5、ZT9、ZT13和ZT17角膜中RORα mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，全晝組小鼠在ZT5、ZT9和ZT13角膜中RORα mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，晝夜顛倒12 h組RORα mRNA相對(duì)表達(dá)量在ZT9、ZT13和ZT17均顯著降低，晝夜顛倒3周組RORα mRNA相對(duì)表達(dá)量在ZT9、ZT13、ZT17和ZT21均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表1)。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)小鼠角膜中RORα mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(x±s)Table 1 Comparison of the relative expression level of RORα mRNA in mouse cornea at various time points among different groups (x±s)組別樣本量不同時(shí)間點(diǎn)RORα mRNA相對(duì)表達(dá)量ZT1ZT5ZT9ZT13ZT17ZT21晝夜節(jié)律正常組62.43±0.082.63±0.287.40±1.274.40±1.044.67±1.312.83±0.97全夜組60.66±0.020.34±0.45a2.35±0.59a0.69±0.07a1.07±0.28a2.11±0.82全晝組62.19±0.121.12±0.18a1.43±0.18a0.93±0.25a3.33±0.992.97±0.60晝夜顛倒12 h組61.59±0.552.24±0.353.73±0.21a2.19±0.23a2.37±0.55a1.71±0.14晝夜顛倒3周組60.96±0.191.05±0.240.22±0.21a0.91±0.49a1.09±0.01a0.13±0.03a 注:F分組=143.28,P<0.001;F時(shí)間=30.11,P<0.001.與各自時(shí)間點(diǎn)晝夜節(jié)律正常組比較,aP<0.05(兩因素方差分析,Tukey檢驗(yàn)) ROR:視黃酸相關(guān)孤兒受體 Note:Fgroup=143.28,P<0.001;Ftime=30.11,P<0.001.Compared with the normal circadian rhythm group at corresponding time points,aP<0.05(Two-way ANOVA,Tukey test) ROR:retinoic acid-related orphan receptor

晝夜節(jié)律正常組、全晝組、全夜組、晝夜顛倒12 h組和晝夜顛倒3周組不同時(shí)間點(diǎn)小鼠角膜RORγ mRNA相對(duì)表達(dá)量總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F分組=91.27，P<0.001；F時(shí)間=66.34，P<0.001)，其中與晝夜節(jié)律正常組比較，全夜組和全晝組小鼠角膜RORγ mRNA相對(duì)表達(dá)量在ZT13、ZT17、ZT21均顯著降低，晝夜顛倒12 h組RORγ mRNA相對(duì)表達(dá)量在ZT13和ZT17均顯著降低，晝夜顛倒3周組RORγ mRNA相對(duì)表達(dá)量在ZT9、ZT13、ZT17和ZT21均顯著降低，在ZT5顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)(表2)。

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)小鼠角膜中RORγ mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(x±s)Table 2 Comparison of the relative expression level of RORγ mRNA in mouse cornea at various time points among different groups (x±s)組別樣本量不同時(shí)間點(diǎn)RORγ mRNA相對(duì)表達(dá)量ZT1ZT5ZT9ZT13ZT17ZT21晝夜節(jié)律正常組615.97±1.887.22±1.0310.04±1.3821.23±3.2129.60±2.8223.71±0.53全夜組613.91±1.824.52±0.978.59±1.3410.47±5.21a13.11±2.12a2.11±0.56a全晝組66.29±3.5110.80±1.6411.86±1.635.00±1.98a10.08±3.17a10.11±1.05a晝夜顛倒12 h組613.26±1.095.95±1.3012.91±2.8415.12±1.08a18.55±5.58a20.54±2.65晝夜顛倒3周組67.90±1.1317.60±0.69a2.30±0.37a2.28±0.51a2.59±1.62a5.00±0.17a 注:F分組=91.27,P<0.001;F時(shí)間=66.34,P<0.001.與各自時(shí)間點(diǎn)晝夜節(jié)律正常組比較,aP<0.05(兩因素方差分析,Tukey檢驗(yàn)) ROR:視黃酸相關(guān)孤兒受體 Note:Fgroup=91.27,P<0.001;Ftime=66.34,P<0.001.Compared with the normal circadian rhythm group at corresponding time points,aP<0.05 (Two-way ANOVA,Tukey test) ROR:reti-noic acid-related orphan receptor

2.2 PBS對(duì)照組與SR1078組小鼠角膜上皮缺損率比較

隨著造模后時(shí)間的延長(zhǎng)，SR1078組和PBS對(duì)照組小鼠角膜上皮熒光素染色面積逐漸縮小，造模后48 h角膜染色消失，角膜上皮光滑。造模后12 h SR1078組小鼠角膜上皮熒光素染色面積小于PBS對(duì)照組，造模后24 h 2個(gè)組角膜上皮染色面積接近(圖2)。造模后12 h，SR1078組角膜上皮缺損面積明顯小于PBS對(duì)照組。造模后不同時(shí)間點(diǎn)PBS對(duì)照組與SR1078組小鼠角膜角膜上皮缺損率總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F分組=74.01，P<0.001；F時(shí)間=5 171.48，P<0.001)，其中造模后12 h SR1078組角膜上皮角膜缺損率明顯低于PBS對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；造模后18 h和24 h，2個(gè)組角膜上皮角膜缺損率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)(表3)。

圖2 PBS對(duì)照組和SR1078組造模后各時(shí)間點(diǎn)角膜熒光素染色面積變化 隨著造模后時(shí)間的延長(zhǎng)，2個(gè)組小鼠角膜熒光素染色面積均逐漸縮小，造模后12 h SR1078組小鼠角膜熒光素染色面積小于PBS對(duì)照組，造模后48 h 2個(gè)組角膜熒光素染色均消失 PBS：磷酸鹽緩沖液；SR1078：視黃酸受體相關(guān)孤兒受體激動(dòng)劑Figure 2 Comparison of corneal fluorescein staining area at various time points between the PBS control group and SR1078 group The corneal fluorescein staining area was gradually shrunk in the two groups over time.The corneal fluorescein staining area was smaller in the SR1078 group compared with the PBS control group at 12 hours after modeling.The corneas were clear at 48 hours after modeling in both groups PBS:phosphate buffered saline;SR1078:retinoic acid receptor-related orphans receptor agonist

表3 PBS對(duì)照組和SR1078組小鼠角膜創(chuàng)傷后不同時(shí)間點(diǎn)角膜上皮缺損率比較(x±s,%)Table 3 Comparison of corneal epithelial defect rate at different time points between PBS control group and SR1078 group (x±s,%)組別樣本量創(chuàng)傷后不同時(shí)間點(diǎn)角膜上皮缺損率0 h12 h18 hPBS對(duì)照組6100.000±0.00045.717±1.90220.122±3.421SR1078組6100.000±0.00025.997±2.969a19.118±3.270 注:F組別=74.01,P<0.001;F時(shí)間=5 171.48,P<0.001.與PBS對(duì)照組比較,aP<0.05(兩因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) PBS:磷酸鹽緩沖液;SR1078:視黃酸受體相關(guān)孤兒受體激動(dòng)劑 Note:Fgroup=74.01,P<0.001;Ftime=5 171.48,P<0.001.Compared with the PBS control group,aP<0.05 (Two-way ANOVA,LSD-t test) PBS:phosphate buffered saline;SR1078:retinoic acid receptor-related orphan receptor agonist

2.3 小鼠角膜上皮缺損率與RORα和RORγ mRNA相對(duì)表達(dá)量的關(guān)聯(lián)性

RORα和RORγ mRNA相對(duì)表達(dá)量與小鼠角膜上皮缺損率均呈中度正相關(guān)(r=0.614、0.537，均P<0.01)。RORα mRNA相對(duì)表達(dá)量是小鼠角膜上皮缺損率高的主要影響因素，其對(duì)角膜上皮缺損率的影響量約為38%，線性回歸方程為Y=33.153X-43.052(F=20.58，P<0.001)；RORγ mRNA相對(duì)表達(dá)量對(duì)小鼠角膜上皮缺損率的影響量約為29%，線性回歸方程為Y=2.764X-1.364(F=13.11，P<0.001)(圖3)。

圖3 RORα和RORγ mRNA相對(duì)表達(dá)量與角膜上皮缺損率的關(guān)聯(lián)分析(Pearson線性相關(guān)分析，一元線性回歸分析，n=36) A：RORα mRNA表達(dá)量與角膜上皮缺損率呈中度正相關(guān)(r=0.614，P<0.01)，其對(duì)角膜上皮缺損率的影響約為38%(R2=0.377) B：RORγ mRNA表達(dá)量與角膜上皮缺損率呈中度正相關(guān)(r=0.537，P<0.01)，其對(duì)角膜上皮缺損率的影響約為29%(R2=0.289) ROR：視黃酸相關(guān)孤兒受體Figure 3 Association analysis of relative expression of RORα,RORγ mRNA and corneal epithelial defect rate(Pearson linear correlation analysis,unary linear regression analysis,n=36) A:RORα mRNA expression and corneal epithelial defect rate was positively correlated (r=0.614,P<0.01),and the contribution of RORα mRNA expression to corneal epithelial defect rate was 38% (R2=0.377) B:RORγ mRNA expression was positively correlated with corneal epithelial defect rate (r=0.537,P<0.01),and the contribution of RORγ mRNA expression to corneal epithelial defect rate was 29% (R2=0.289) ROR：retinoic acid-related orphan receptor

2.4 SR1078組與PBS對(duì)照組小鼠角膜上皮分裂細(xì)胞數(shù)量比較

DAPI染色后熒光顯微鏡下可見角膜上皮基底細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)呈亮藍(lán)色，細(xì)胞核呈白色。未分裂的細(xì)胞呈圓或橢圓性，分裂細(xì)胞呈啞鈴狀(圖4)。造模后不同時(shí)間點(diǎn)SR1078組與PBS對(duì)照組小鼠角膜上皮分裂細(xì)胞數(shù)量總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F分組=160.55，P<0.001；F時(shí)間=83.57，P<0.001)，其中造模后24、30、36 h SR1078組分裂細(xì)胞數(shù)目顯著少于PBS對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表4)。

圖4 造模后36 h PBS對(duì)照組與SR1078組小鼠角膜上皮基底細(xì)胞分裂細(xì)胞數(shù)比較(DAPI ×40，標(biāo)尺=25 μm) 完整角膜上皮基底細(xì)胞呈圓或橢圓形(紅箭頭)，分裂的細(xì)胞呈啞鈴狀(白箭頭) SR1078組角膜上皮分裂細(xì)胞數(shù)明顯少于PBS對(duì)照組 A：PBS對(duì)照組 B：SR1078組Figure 4 Comparison of the number of mouse corneal epithelial mitotic cells between the PBS control group and SR1078 group at 36 hours after corneal trauma(DAPI ×40,bar=25 μm) The normal cells (red arrow) were round or oval,and the mitotic cell (white arrow) was dumbbell-like.The number of mitotic cells was less in the SR1078 group compared with the PBS control group A:PBS control group B:SR1078 group

表4 各組小鼠角膜創(chuàng)傷后不同時(shí)間點(diǎn)分裂細(xì)胞數(shù)量比較(x±s,個(gè)/角膜)Table 4 Comparison of the number of mitotic cells at various time points between the two groups (x±s,pcs/cornea)組別樣本量創(chuàng)傷后不同時(shí)間點(diǎn)分裂細(xì)胞數(shù)量12 h18 h24 h30 h36 h42 h48 hPBS對(duì)照組638±733±8128±3150±26221±3180±2130±9SR1078組625±252±3 53±2a74±10a75±13a43±229±3 注:F分組=160.55,P<0.001;F時(shí)間=83.57,P<0.001.與PBS對(duì)照組比較,aP<0.001(兩因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) PBS:磷酸鹽緩沖液;SR1078:視黃酸受體相關(guān)孤兒受體激動(dòng)劑 Note:Fgroup=160.55,P<0.001;Ftime=83.57,P<0.001.Compared with the PBS con-trol group,aP<0.001 (Two-way ANOVA,LSD-t test) PBS:phosphate buffered saline;SR1078:retinoic acid receptor-related orphan receptor agonist

3 討論

研究表明，RORα/RORγ的缺乏會(huì)引起組織中時(shí)鐘基因Cry1、Bmal1、E4bp4、Rev-Erbα和Per2的峰值表達(dá)水平顯著降低[15]。時(shí)鐘基因的表達(dá)受環(huán)境的調(diào)控，其中主要的環(huán)境因子為光周期。光線從視網(wǎng)膜直接投射傳送到視交叉上核(suprachiasmatic nucleus，SCN)，SCN再將節(jié)律信號(hào)傳送至其他器官，發(fā)揮組織生物鐘同步化的作用[16]，生物鐘是由4個(gè)時(shí)鐘基因Clock、Bmal1、Per2和Cry組成的正負(fù)調(diào)節(jié)所調(diào)控，這一回路是“轉(zhuǎn)錄-翻譯-逆轉(zhuǎn)錄”機(jī)制構(gòu)成的反饋環(huán)路[17]。有研究表明，當(dāng)小鼠受到連續(xù)光照或處于12 h時(shí)差反應(yīng)的條件下時(shí)，通過(guò)晝夜節(jié)律控制去甲腎上腺素分泌，交感神經(jīng)系統(tǒng)會(huì)明顯改變?cè)煅杉?xì)胞向外周血的晝夜節(jié)律釋放[18]?？紤]到角膜上皮有絲分裂中的晝夜節(jié)律變化，推測(cè)調(diào)控時(shí)鐘基因的RORα/RORγ可能在一天中的不同時(shí)間存在差異表達(dá)，并且它們的表達(dá)量可能受環(huán)境明暗周期變化的調(diào)節(jié)，進(jìn)而影響動(dòng)物的生理病理過(guò)程。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定正常晝夜節(jié)律下24 h內(nèi)小鼠角膜中RORα/RORγ mRNA表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)與正常晝夜節(jié)律比較，在24 h持續(xù)光照或黑暗條件下小鼠角膜中RORα/RORγ mRNA表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明RORα/RORγ mRNA表達(dá)量會(huì)受到小鼠晝夜節(jié)律的影響。在連續(xù)24 h的黑暗或光照模擬狀態(tài)下，小鼠由于生物鐘節(jié)律的紊亂，角膜中RORα/RORγ mRNA的表達(dá)量在某些時(shí)間段發(fā)生異常變化。為了驗(yàn)證小鼠角膜中RORα/RORγ mRNA的表達(dá)量是否與生物鐘紊亂有關(guān)，本研究又設(shè)立了晝夜顛倒12 h組和晝夜顛倒3周組對(duì)上述結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)當(dāng)小鼠晝夜節(jié)律與正常小鼠完全顛倒時(shí)，小鼠角膜中RORα/RORγ mRNA表達(dá)量同樣呈降低趨勢(shì)，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)該效應(yīng)越明顯。相關(guān)研究表明，RORα/RORγ對(duì)于機(jī)體晝夜節(jié)律的調(diào)控具有重要作用，RORα對(duì)機(jī)體節(jié)律性的調(diào)控主要是由bmal1基因通過(guò)與RORE位點(diǎn)結(jié)合而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，而Bmal1基因是生物節(jié)律體系中的重要因子，其含量隨著時(shí)間的變化不斷呈現(xiàn)規(guī)律性的增長(zhǎng)和消退，其中RORα能激活Bmal1基因，而REV-ERBα的作用則相反，與RORα競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合RORE位點(diǎn)，從而抑制或激活Bmal1基因的轉(zhuǎn)錄[19]。對(duì)斑馬魚的研究中也同樣說(shuō)明，斑馬魚的Per2基因可通過(guò)與RORα結(jié)合增強(qiáng)bmal1b基因的表達(dá)[20]。

根據(jù)相關(guān)研究，斑馬魚腸道細(xì)胞分裂具有節(jié)律性[21]，角膜緣的干細(xì)胞也同樣具有節(jié)律性，且對(duì)創(chuàng)傷十分敏感，角膜上皮細(xì)胞受到損傷時(shí)，基底細(xì)胞會(huì)迅速進(jìn)行分裂以補(bǔ)足損傷區(qū)域，以完成再分化過(guò)程。研究表明，小鼠角膜創(chuàng)傷后12 h和18 h角膜再上皮化速度加快，角膜上皮分裂細(xì)胞的正常節(jié)律受到睡眠顛倒的影響而發(fā)生改變[22]。本研究中通過(guò)SR1078的作用對(duì)小鼠角膜創(chuàng)傷模型進(jìn)行恢復(fù)實(shí)驗(yàn)，在創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中應(yīng)用SR1078點(diǎn)眼，但與PBS對(duì)照組比較總體恢復(fù)時(shí)間無(wú)明顯變化，而給藥后的小鼠角膜上皮分裂細(xì)胞數(shù)明顯少于PBS對(duì)照組，這也許意味著RORα/RORγ的增多具有抑制創(chuàng)傷修復(fù)的作用。根據(jù)相關(guān)研究，時(shí)鐘基因在細(xì)胞分化生長(zhǎng)方面具有重要作用，如Per基因具有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和抑制腫瘤的功能，Per2基因的缺失會(huì)引起小鼠異常的細(xì)胞凋亡和癌癥的發(fā)生，也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分裂的錯(cuò)誤發(fā)生，使正常的細(xì)胞分裂過(guò)程受到干擾[23-24]。因此根據(jù)本研究結(jié)果我們推測(cè)，SR1078點(diǎn)眼后，小鼠角膜中RORα/RORγ的表達(dá)量增多，阻礙了小鼠角膜上皮分裂細(xì)胞的分化，可能是由于大量外源性RORα/RORγ的侵入，使RORα/RORγ調(diào)控的基因表達(dá)發(fā)生改變，如RORγ通過(guò)RORE對(duì)BMAL1基因的表達(dá)過(guò)剩，同時(shí)RORα和Per2基因的大量結(jié)合，引起Per2基因減少，使時(shí)鐘基因無(wú)法正常表達(dá)。

角膜創(chuàng)傷修復(fù)的目的是促進(jìn)角膜上皮修復(fù)過(guò)程，并使阻礙角膜創(chuàng)傷的因素降到最低。有效阻斷影響角膜創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程的不良因素可最大程度地促進(jìn)角膜創(chuàng)傷的修復(fù)過(guò)程，并減輕其所造成的不良反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。本研究全晝組小鼠的持續(xù)光照可產(chǎn)生焦躁情緒，引起應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能造成一定誤差。但本研究仍然提示，正常晝夜節(jié)律的擾亂加速了角膜創(chuàng)傷修復(fù)的過(guò)程，其原因可能是機(jī)體對(duì)外界晝夜周期的變化發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致RORα/RORγ的表達(dá)量下降，促進(jìn)了角膜上皮細(xì)胞的分裂過(guò)程。角膜作為視覺系統(tǒng)重要的屈光介質(zhì)之一，與外界直接接觸發(fā)生損傷的風(fēng)險(xiǎn)極大，因此了解與角膜創(chuàng)傷修復(fù)相關(guān)調(diào)節(jié)因子的晝夜節(jié)律變化對(duì)角膜創(chuàng)傷修復(fù)的防治具有重要意義。本研究針對(duì)SR1078是否對(duì)角膜創(chuàng)傷修復(fù)產(chǎn)生影響這一問(wèn)題，通過(guò)晝夜節(jié)律的改變對(duì)角膜中RORα/RORγ的表達(dá)量進(jìn)行分析，分別從組織和細(xì)胞水平研究RORα/RORγ激動(dòng)劑SR1078對(duì)角膜上皮細(xì)胞分化的影響，闡釋SR1078在角膜創(chuàng)傷修復(fù)中的作用機(jī)制，為角膜創(chuàng)傷修復(fù)的臨床防治提供新的理論基礎(chǔ)。

綜上所述，RORα/RORγ激動(dòng)劑SR1078對(duì)角膜創(chuàng)傷修復(fù)的過(guò)程能夠產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。光線不規(guī)律照射破壞了小鼠正常晝夜節(jié)律，激活REV-ERBα與RORα競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RORE位點(diǎn)的活性，從而抑制或激活Bmal1基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而使小鼠角膜中RORα和RORγ mRNA的表達(dá)量下降，而SR1078通過(guò)促進(jìn)角膜上皮RORα和RORγ的表達(dá)，使小鼠角膜上皮分裂細(xì)胞數(shù)目下降，抑制角膜創(chuàng)傷后修復(fù)。SR1078對(duì)時(shí)鐘基因作用的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明徐鵬洋：實(shí)施研究方案、采集數(shù)據(jù)、制作圖表、撰寫及修改論文；李志杰：指導(dǎo)研究方案、修改論文；薛蕓霞：設(shè)計(jì)與指導(dǎo)研究方案、審核研究數(shù)據(jù)、修改論文