特異性抗鐮刀菌感染雞卵黃抗體的制備及其抗鐮刀菌作用

林靜 劉星 彭旭東 李翠 隋建新 趙桂秋

1青島大學(xué)附屬醫(yī)院眼科，青島 266003；2中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，青島 266003

真菌性角膜炎是一種由致病真菌感染引起的嚴(yán)重致盲眼病。植物性外傷是其主要的發(fā)病誘因，因此其在以農(nóng)業(yè)生產(chǎn)為主的發(fā)展中國(guó)家發(fā)病率較高[1-2]。真菌性角膜炎的致病菌屬主要包括鐮孢菌屬、曲霉菌屬、念珠菌屬和彎孢菌屬，以鐮刀菌和煙曲霉菌常見[3]。在我國(guó)，鐮刀菌導(dǎo)致真菌性角膜炎的發(fā)病率逐年升高。真菌性角膜炎起病緩慢、病程長(zhǎng)，與病毒性或細(xì)菌性角膜潰瘍相比，真菌性角膜潰瘍預(yù)后更差。目前在臨床中常用的抗真菌藥物主要有多烯類(兩性霉素B)、唑類(伏立康唑、氟康唑)、棘白菌素類(卡泊芬凈、米卡芬凈)和環(huán)孢素類等[4]。由于抗真菌藥物的毒性和不良反應(yīng)較大，局部滲透性差且刺激性強(qiáng)，限制了其在真菌性角膜炎中的應(yīng)用[5]，因此亟需尋找毒性低、抗真菌效果好、滲透性強(qiáng)的藥物來增加局部作用效果并減輕全身毒性作用。雞卵黃抗體(yolk immunoglobulin，IgY)是將抗原通過注射的方式免疫禽類后，通過其免疫系統(tǒng)產(chǎn)生并蓄積在卵細(xì)胞中的特異性抗體。母雞產(chǎn)生IgY是為了給后代提供對(duì)常見禽病原體有效的體液免疫，直至后代自身免疫系統(tǒng)完全成熟。IgY具有產(chǎn)量高、易獲得、價(jià)格低廉、毒性低、對(duì)溫度和pH具有良好的耐受性等特點(diǎn)，已經(jīng)在疾病診斷和治療等方面有廣泛的研究和應(yīng)用[6-8]。研究表明，用細(xì)菌、真菌、病毒等病原體作為抗原免疫蛋雞后，均能使蛋雞產(chǎn)生針對(duì)特定抗原的IgY[9]，產(chǎn)生的特異性IgY能夠有效抑制痢疾志賀菌、輪狀病毒、白念珠菌、毛癬霉菌等的生長(zhǎng)，并在口腔念珠菌感染、皮膚毛癬霉病等多種疾病中具有較好的治療效果[10-13]。但是到目前為止，特異性IgY在真菌性角膜炎中的作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬制備特異性抗鐮刀菌的IgY，并檢測(cè)其抗真菌作用及對(duì)溫度和pH的耐受性，以期為真菌性角膜炎的藥物治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象及來源 標(biāo)準(zhǔn)鐮刀菌菌株(NO.3.01829)(中國(guó)普通微生物保藏中心提供)。22周齡萊杭母雞18只，體質(zhì)量約1 kg(青島森淼公司提供)。健康8周齡SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠12只(濟(jì)南朋悅公司)，均經(jīng)過檢驗(yàn)及檢疫，眼前節(jié)無明顯異常。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在18～22 ℃，濕度為50%～60%，室內(nèi)明暗循環(huán)各12 h。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用遵循美國(guó)眼科和視覺研究協(xié)會(huì)關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的原則和標(biāo)準(zhǔn)，本研究方案經(jīng)青島大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批文號(hào)：QYFYWZLL26168)。

1.1.2主要試劑及儀器 沙氏培養(yǎng)基、沙氏Agar培養(yǎng)基、Bradford法蛋白濃度測(cè)定試劑盒、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)(北京索萊寶公司)；DMEM(美國(guó)HyClone公司)；弗氏佐劑、弗氏不完全佐劑、辣根酶標(biāo)記兔抗雞IgG(美國(guó)Sigma公司)；優(yōu)級(jí)純硫酸銨(天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)。透氣封口膜(上海富雪生物科技有限公司)；普蘭德封口膜(上海生物公司)；角膜板層刀(美國(guó)Alcon公司)；5-0帶線縫合針(寧波醫(yī)用縫針公司)；體式顯微鏡(德國(guó)Carl Zeiss公司)；-80 ℃和4 ℃冰箱、超凈工作臺(tái)、凍干機(jī)(美國(guó)Thermo Scientific公司)；全套移液器、低溫高速離心機(jī)(5810R)(德國(guó)Eppendorf公司)；高壓立式蒸汽滅菌器(日本Tomy公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Forma公司)；恒溫培養(yǎng)箱(上海力康公司)；裂隙燈顯微鏡(日本拓普康公司)。

1.2 方法

1.2.1特異性IgY的制備 取出凍存的標(biāo)準(zhǔn)鐮刀菌菌株于超凈工作臺(tái)中溶解吹打后接種在沙氏Agar培養(yǎng)基，置于28 ℃恒溫箱中5～7 d，刮取鐮刀菌的孢子及菌絲接種于含沙氏培養(yǎng)基的無菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，透氣封口膜封口，在37 ℃搖床培養(yǎng)箱內(nèi)120 r/min條件下培養(yǎng)約5 d。收集細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的鐮刀菌菌絲于離心管內(nèi)研磨充分后在離心半徑13.5 cm，12 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，棄上清，無菌PBS充分洗滌菌液3遍。加入體積分?jǐn)?shù)75%乙醇充分混勻后于4 ℃冰箱過夜滅活菌絲。次日再次12 000 r/min離心15 min，棄去75%乙醇，用無菌PBS洗滌3遍，加入DMEM培養(yǎng)液混勻，配制成終濃度為2×107菌落形成單位(colony forming units，CFU)/ml的菌絲刺激液。采用隨機(jī)數(shù)表法將18只萊杭母雞隨機(jī)分為陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組9只。取菌懸液與弗氏完全佐劑等體積混合并充分乳化，取1 ml混合液于實(shí)驗(yàn)組雞的頸部、雙翅及胸肌處皮下散點(diǎn)注射，2周后換為弗氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫1次。收集免疫后的雞蛋，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。同時(shí)以氯化鈉溶液代替菌懸液按照同樣方式對(duì)陰性對(duì)照組萊杭母雞進(jìn)行注射，以制備非特異性抗體作為實(shí)驗(yàn)中的陰性對(duì)照。取免疫后蛋黃20 g，用滅菌雙蒸水稀釋至質(zhì)量濃度為90 mg/ml，混勻后調(diào)節(jié)pH至5.0，4 ℃靜置過夜。4 ℃條件下10 000 r/min離心30 min，取上清液過濾，收集濾液。向?yàn)V液中加入50%飽和度的優(yōu)級(jí)純硫酸銨，4 ℃條件下攪拌30 min并靜置2 h以使蛋白沉淀。4 ℃條件下10 000 r/min離心15 min，棄上清。將離心所得沉淀溶解于適量的PBS中，再加入33%飽和度的優(yōu)級(jí)純硫酸銨進(jìn)行二次鹽析，4 ℃條件下攪拌20 min后靜置40 min以使蛋白沉淀。4 ℃條件下10 000 r/min離心15 min，棄上清，沉淀溶解于適量的PBS中，充分透析后獲得IgY溶液。將得到的IgY蛋白液體放入凍干機(jī)中制作成凍干粉，4 ℃保存。

1.2.2考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定特異性IgY蛋白濃度 將考馬斯亮藍(lán)工作液分別加到一系列不同濃度標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)BSA溶液中，振蕩搖勻，15 min后，測(cè)定波長(zhǎng)595 nm處吸光度(absorbance,A)值，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)，繪成標(biāo)準(zhǔn)曲線。取第5～16周適宜體積待測(cè)樣品，使其測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)，根據(jù)所測(cè)定的A595值，計(jì)算出待測(cè)樣品的蛋白質(zhì)濃度。

1.2.3間接酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定特異性IgY效價(jià) 取第5～16周IgY，將質(zhì)量濃度調(diào)整至100 mg/ml，用2×107CFU/ml鐮刀菌絲包被96孔免疫板。分別以PBS和陰性IgY提取液作為空白對(duì)照和陰性對(duì)照，濃度與特異性抗鐮刀菌IgY的稀釋梯度一致。辣根酶標(biāo)記兔抗雞IgG按1∶ 2 500稀釋，每孔100 μl，TMB顯色劑顯色后，1 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定A450值?？贵w的效價(jià)定義為樣品A450與陰性對(duì)照A450的比值≥2.1時(shí)所需要的樣品最大稀釋倍數(shù)。

1.2.4特異性IgY體外抑菌活性的測(cè)定 將1×105CFU/ml和1×103CFU/ml鐮刀菌懸液與效價(jià)為1∶ 10 000的不同濃度特異性IgY混合培養(yǎng)4 d后用酶標(biāo)儀測(cè)定A600值。用PBS及陰性卵黃抗體與鐮刀菌液共孵育分別作為空白對(duì)照組和陰性IgY組，繪制抑菌曲線。

1.2.5特異性IgY熱穩(wěn)定性的測(cè)定 將特異性IgY用pH 7.4的PBS稀釋至0.02 mg/ml，分別在30、40、50、60、70、80和90 ℃水浴中孵育30 min，室溫冷卻后，以2×107CFU/ml鐮刀菌絲包被96孔板，以間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法測(cè)定不同溫度處理后IgY的活性。

1.2.6特異性IgY酸堿穩(wěn)定性的測(cè)定 將特異性IgY分別用pH值為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12的PBS稀釋至0.02 mg/ml，并在4 ℃條件下放置l h，以2×107CFU/ml的鐮刀菌絲包被96孔板，以間接ELISA法測(cè)定不同pH條件處理后IgY的活性。

1.2.7小鼠鐮刀菌性角膜炎模型的建立及處理 采用隨機(jī)數(shù)表法將12只小鼠隨機(jī)分為PBS對(duì)照組和特異性IgY治療組，每組6只。腹腔內(nèi)注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%水合氯醛(0.4 ml/kg)麻醉C57BL/6小鼠，在體式顯微鏡下，用板層刀刮除約2 mm直徑范圍的右眼中央角膜上皮組織以形成角膜缺損，將10 μl鐮刀菌菌懸液點(diǎn)于角膜上并用封口膜自制的軟性角膜接觸鏡覆蓋，用5-0帶線縫合針縫合上下眼瞼。建模后1 d，特異性IgY治療組用200 mg/ml特異性抗鐮刀菌IgY點(diǎn)眼，PBS對(duì)照組用PBS點(diǎn)眼，每2 h點(diǎn)1次。于鐮刀菌感染后1、3和5 d在裂隙燈顯微鏡下觀察并拍照，參照文獻(xiàn)[14]的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)小鼠鐮刀菌性角膜炎的嚴(yán)重程度進(jìn)行分級(jí)(表1)。

表1 小鼠真菌性角膜炎模型炎癥分級(jí)[14]Table 1 Inflammation grading in mouse model of fungal keratitis[14]項(xiàng)目Ⅰ級(jí)(1分)Ⅱ級(jí)(2分)Ⅲ級(jí)(3分)Ⅳ級(jí)(4分)潰瘍面積(%)1-2526-5051-7576-100混濁程度 虹膜紋理尚清,瞳孔可見,角膜輕度混濁虹膜可見,角膜較混濁虹膜不可見,角膜不均勻混濁角膜均勻,重度混濁潰瘍形態(tài) 輕度不規(guī)則 輕度水腫、不規(guī)則 重度水腫,龕樣潰瘍,或后彈力層膨出穿孔或后彈力層膨出 注:3項(xiàng)分?jǐn)?shù)相加為最終炎癥得分 Note:The final inflammation score was the sum of the three items

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 特異性抗鐮刀菌IgY的濃度及效價(jià)測(cè)定

考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定IgY濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得第5～16周的特異性IgY的蛋白質(zhì)量濃度分別為1.57、2.89、24.98、25.09、23.89、25.78、21.57、21.37、18.98、15.78、14.67和12.67 mg/ml。特異性抗鐮刀菌IgY的效價(jià)從第5周開始升高，第7周時(shí)達(dá)到最高效價(jià)，為1∶ 10 000，可維持至免疫后第12周，從第12周開始效價(jià)緩慢下降(圖2)。

圖1 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定IgY濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式Y(jié)=0.507X+0.557(R2=0.990)測(cè)得蛋白質(zhì)量濃度 A:吸光度Figure 1 Bradford assay standard curve of IgY concentration versus absorbance The IgY concentration was calculated according to the equation Y=0.507X+0.557 (R2=0.990) A:absorbance

圖2 間接ELISA法測(cè)定第5～16周IgY效價(jià) 特異性抗鐮刀菌IgY的效價(jià)從第5周開始升高，第7周時(shí)達(dá)到最高效價(jià)，為1∶ 10 000，可維持至免疫后第12周，從第12周開始效價(jià)開始緩慢下降 IgY:雞卵黃抗體Figure 2 Indirect ELISA method to determine the titer of IgY in 5-16 weeks following immunization The titer of IgY was increased from the 5th week and reached the highest titer 1∶ 10 000 at the 7th week,which could be maintained until the 12th week after immunization.The titer began to decline slowly from the 12th week IgY:yolk immunoglobulin

2.2 特異性抗鐮刀菌IgY抑制鐮刀菌生長(zhǎng)的抑菌曲線

抑菌曲線顯示，特異性IgY治療組的抑菌效果明顯好于空白對(duì)照組及陰性IgY組，250 mg/ml的特異性IgY可完全抑制1×105CFU/ml的鐮刀菌生長(zhǎng)(圖3)，100 mg/ml的特異性IgY可完全抑制1×103CFU/ml鐮刀菌的生長(zhǎng)(圖4)。

圖3 各組對(duì)1×105 CFU/ml鐮刀菌懸液的抑菌曲線 特異性IgY治療組的抑菌效果明顯好于空白對(duì)照組及陰性IgY組，250 mg/ml的特異性IgY可完全抑制1×105 CFU/ml的鐮刀菌生長(zhǎng) CFU：菌落形成單位;IgY:雞卵黃抗體Figure 3 Concentration-bactericidal curve of different groups against 1×105 CFU/ml Fusarium suspension The antifungal effect of the specific IgY group against Fusarium was significantly better than the blank group and the negative IgY group.The specific IgY with a concentration of 250 mg/ml could completely inhibit the growth of Fusarium of 1×105 CFU/ml CFU：colony forming units;IgY:yolk immunoglobulin

圖4 各組對(duì)1×103 CFU/ml鐮刀菌懸液的抑菌曲線 特異性IgY治療組的抑菌效果明顯好于空白對(duì)照組及陰性IgY組，質(zhì)量濃度為100 mg/ml的特異性IgY可完全抑制1×103 CFU/ml鐮刀菌的生長(zhǎng) CFU：菌落形成單位;IgY:雞卵黃抗體Figure 4 Concentration-bactericidal curve of different groups against 1×103 CFU/ml Fusarium suspension The antifungal effect of the specific IgY group against Fusarium was significantly better than the blank group and the negative IgY group.The specific IgY with a concentration of 100 mg/ml could completely inhibit the growth of Fusarium of 1×103 CFU/ml CFU：colony forming units;IgY:yolk immunoglobulin

2.3 特異性IgY對(duì)不同溫度和pH的耐受性

效價(jià)高于1∶ 10 000的特異性IgY在60 ℃以下具有較好的熱穩(wěn)定性，效價(jià)無明顯變化，60 ℃以上抗體效價(jià)明顯下降(圖5)；特異性IgY在pH 4～6具有最高的活性，在pH 3～9的條件下能夠維持活性；隨著pH值的進(jìn)一步降低或者升高，其活性迅速降低(圖6)。

圖5 不同溫度對(duì)特異性IgY效價(jià)的影響 效價(jià)高于1∶ 10 000的特異性IgY在30～60 ℃間效價(jià)無明顯變化，60 ℃以上抗體效價(jià)明顯下降 IgY:雞卵黃抗體Figure 5 Effect of temperature on the titer of specific IgY There was no significant change in the titer of the specific IgY with a titer higher than 1∶ 10 000 in the range of 30-60 °C,and the titer was decreased significantly when the temperature reached above 60 ℃ IgY:yolk immunoglobulin

圖6 不同pH對(duì)特異性IgY效價(jià)的影響 效價(jià)高于1∶ 10 000的特異性IgY在pH 4～6具有最高的活性，在pH 3～9的條件下能夠維持活性；隨著pH值的進(jìn)一步降低或者升高，其活性迅速降低 IgY:雞卵黃抗體Figure 6 Effect of pH on the titer of specific IgY There was the highest activity of the specific IgY with a titer higher than 1∶ 10 000 at pH 4-6,which could be maintained at pH 3-9.With the decrease or increase of pH,the activity was reduced rapidly IgY:yolk immunoglobulin

2.4 特異性IgY治療組與PBS對(duì)照組角膜炎癥評(píng)分比較

鐮刀菌感染后3 d和5 d，與PBS對(duì)照組相比，特異性IgY治療組小鼠角膜混濁面積減小、潰瘍程度減輕(圖7)。鐮刀菌感染后1、3和5 d，PBS對(duì)照組和特異性IgY治療組不同時(shí)間點(diǎn)炎癥評(píng)分總體比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F分組=247.35，P<0.05；F時(shí)間=23.19，P<0.05；F交互作用=32.10，P<0.05)。鐮刀菌感染后1 d，2個(gè)組炎癥評(píng)分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.610)；鐮刀菌感染后3 d和5 d，與PBS對(duì)照組相比，特異性IgY治療組炎癥評(píng)分降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表2)。

圖7 特異性IgY治療組與PBS對(duì)照組小鼠角膜形態(tài)及炎癥程度比較 裂隙燈顯微鏡下觀察可見，感染后3 d和5 d，與PBS對(duì)照組相比，特異性IgY治療組小鼠角膜混濁面積縮小，潰瘍程度和炎癥程度均明顯減輕 PBS：磷酸鹽緩沖液;IgY:雞卵黃抗體Figure 7 Comparison of morphology of mice cornea and degree of inflammation between the two groups At 3 and 5 days after infection,there was a smaller area of corneal opacity,relieved ulceration and inflammation in the specific IgY treatment group compared with the PBS group PBS：phosphate buffered saline;IgY:yolk immunoglobulin

表2 2個(gè)組鐮刀菌感染后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠角膜炎癥評(píng)分比較(x±s)Table 2 Comparison of corneal inflammation scores of mice at various time points after Fusarium infection between the two groups (x±s)組別樣本量感染后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠角膜炎癥評(píng)分1 d3 d5 dPBS對(duì)照組63.50±0.557.33±0.824.00±0.63特異性IgY治療組63.33±0.824.17±0.75a2.50±0.55 a 注:F分組=247.35,P<0.05;F時(shí)間=23.19,P<0.05;F交互作用=32.10,P<0.05.與PBS對(duì)照組比較,aP<0.05(重復(fù)測(cè)量?jī)梢蛩胤讲罘治?LSD-t檢驗(yàn)) PBS:磷酸鹽緩沖液;IgY:雞卵黃抗體 Note:Fgroup=247.35,P<0.05;Ftime=23.19,P<0.05;Finteraction=32.10,P<0.05.Compared with the PBS control group,aP<0.05 (Two-way repeated measures ANOVA,LSD-t test) PBS:phosphate buffered saline;IgY:yolk immunoglobulin

3 討論

IgY來自于被抗原免疫后的蛋雞卵黃。國(guó)內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)，特異性針對(duì)病原體的IgY可被應(yīng)用于病原體感染性疾病的診斷及治療[15]。IgY不僅具有抗原結(jié)合力，而且對(duì)其抗原菌的生長(zhǎng)具有明顯抑制作用。盡管其作用機(jī)制尚不明確，IgY應(yīng)用于動(dòng)物病原菌的被動(dòng)免疫在病原體相關(guān)疾病的預(yù)防和治療中有重要作用[16-18]。特異性IgY能夠有效抑制鮑曼不動(dòng)桿菌、輪狀病毒、白念珠菌、毛癬霉菌等的生長(zhǎng)。在小鼠模型中應(yīng)用特異性IgY能夠減輕口腔念珠菌感染、皮膚毛癬霉病等多種疾病的嚴(yán)重程度[8,10]。但特異性針對(duì)鐮刀菌的IgY未見相關(guān)報(bào)道。

本研究制備了特異性針對(duì)鐮刀菌的IgY，并驗(yàn)證了其抗真菌作用。我們用鐮刀菌菌絲作為抗原，與弗氏佐劑混合，采用頸部、雙翅及胸肌等多處皮下散點(diǎn)注射的方式免疫萊杭母雞，2周后更換為弗氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫1次。用硫酸銨鹽析法從免疫后的萊杭母雞卵黃中提取出特異性IgY，并檢測(cè)了效價(jià)。結(jié)果顯示，特異性IgY的最高效價(jià)可達(dá)到1∶ 10 000，在免疫后5周效價(jià)開始升高，7～12周時(shí)效價(jià)最高，12周后效價(jià)開始下降。研究顯示，雞卵黃抗體在免疫制備過程中，免疫的途徑、注射部位、抗原用量、間隔時(shí)間、免疫次數(shù)等都是影響免疫效果的因素[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鐮刀菌的菌絲在頸部、雙翅及胸肌等多處皮下散點(diǎn)注射的方式能夠充分引起蛋雞的免疫，而且硫酸銨鹽析法可高效提取IgY，與文獻(xiàn)[20]研究結(jié)果一致。既往實(shí)驗(yàn)中，提取IgY的方法可分為4種，即硫酸銨鹽析法、硫酸鈉鹽析法、冰乙醇法和聚乙二醇沉淀法[21]。硫酸銨鹽析法提取產(chǎn)物的抗體效價(jià)最高，且產(chǎn)量大，是較為理想的提取純化方法。另外有研究表明，針對(duì)白念珠菌的IgY可以封閉白念珠菌的表面抗原，防止白念珠菌菌絲體轉(zhuǎn)變，引起凝集，從而抑制白念珠菌的生長(zhǎng)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組及陰性IgY組相比，特異性IgY可顯著抑制鐮刀菌生長(zhǎng)，這為特異性IgY成為新型抗真菌藥提供了研究基礎(chǔ)。另外，在小鼠鐮刀菌性角膜炎中，特異性IgY治療組小鼠角膜混濁面積、潰瘍程度、炎癥程度均明顯減輕，炎癥評(píng)分顯著降低，這表明特異性IgY對(duì)小鼠的鐮刀菌性角膜炎具有治療作用，有望作為天然生物抑菌劑應(yīng)用于鐮刀菌性角膜炎的治療中。IgY作為一種蛋白類物質(zhì)，在應(yīng)用中對(duì)溫度及酸堿度的耐受性非常重要。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了特異性IgY對(duì)酸堿度和溫度的耐受力，結(jié)果顯示抗體效價(jià)高于1∶ 10 000的特異性IgY在60 ℃以下具有較好的熱穩(wěn)定性；抗體在pH 4～6具有最高的活性，在pH 3～9的條件下能夠維持活性，隨著pH值的進(jìn)一步降低或者升高，其活性迅速降低，與既往研究結(jié)果一致[21-23]。IgY良好的溫度及酸堿耐受性為其大量制備和廣泛應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示采用硫酸銨鹽析法可成功制備高產(chǎn)量、高效價(jià)的特異性IgY，該抗體可顯著抑制鐮刀菌生長(zhǎng)，在小鼠鐮刀菌性角膜炎模型中降低角膜炎癥評(píng)分，減輕角膜潰瘍的嚴(yán)重程度，并且其穩(wěn)定性高，對(duì)溫度和酸堿度均有一定的耐受性。高效價(jià)特異性IgY作為一種新的天然抑菌劑，有望應(yīng)用于真菌性角膜炎的治療中。

利益沖突所有作者均聲明不存在任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明林靜：分析/解釋數(shù)據(jù)，醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱，獲取研究經(jīng)費(fèi)；劉星：實(shí)施研究，分析/解釋數(shù)據(jù)，起草文章；彭旭東：對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱，統(tǒng)計(jì)分析；李翠：分析/解釋數(shù)據(jù)，對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱；隋建新：對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱；趙桂秋：對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱，提供研究經(jīng)費(fèi)，行政、技術(shù)或材料支持